本方案描述了患者来源的B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的在卵内 异种移植，该过程发生在注射后4天。
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摘要
摘要
本研究介绍了一种快速、经济且高效的方法，用于将患者来源的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞（包括B细胞和T细胞谱系）进行in ovo异种移植。利用受精的鸡胚，我们在受精后第11天（11dpf）将患者来源的B-ALL和T-ALL细胞注射至胚胎的血管系统中。令人瞩目的是，在注射后第4天，移植的人类白血病细胞在发育中的鸡胚内表现出显著的存活、增殖以及对血管系统的定植。到15dpf时，我们在鸡胚血管系统的血液样本中检测到CD10/CD19+ B-ALL细胞和CD4/CD8+ T-ALL细胞数量明显增加，证实了移植成功。该系统可在活体生物中高效且可重复地评估白血病细胞的行为，同时避免了其他动物模型所伴随的高昂成本和伦理限制。这一快速方法为评估潜在治疗化合物提供了一个高通量且具有生物学相关性的in vivo平台。本文所呈现的in ovo患者来源异种移植（PDX）-ALL系统，为白血病研究中的临床前药物筛选、机制研究以及个性化医疗策略提供了有前景的工具。
引言
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）在受精后孵化第7天开始形成，到第12天完全发育成熟。由于CAM具有天然的免疫缺陷特性以及高度发达的血管系统，因此成为研究血管生成1和移植癌细胞2,3,4,5,6,7,8,9,10，尤其是血液系统相关癌细胞的理想体内模型11。此外，CAM还含有多种细胞外基质蛋白，如胶原蛋白、整合素αVβ3、纤连蛋白、层粘连蛋白以及基质金属蛋白酶-2（MMP-2），因此也是研究肿瘤侵袭和转移的优良体系10。
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于骨髓和血液的恶性肿瘤，其特征是未成熟的B细胞和T细胞淋巴细胞迅速增殖。它是儿童中最常见的癌症，也是儿童癌症死亡的首要原因。ALL在 >85%的患病儿童可被治愈，但成人和婴儿的治愈率显著较低，复发/难治性ALL的5年生存率 <10%12因此，迫切需要开发新的治疗策略以预防或阻止复发性或难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）的进展。尽管已建立多种异种移植模型，如小鼠和大鼠13，已开发出这些方法，但耗时较长（例如数月）、成本高昂，且需要遵循全面的伦理规范。为满足急性淋巴细胞白血病（ALL）新型治疗方案尚未满足的临床需求，亟需建立一种可重复、省时且经济的动物模型，以促进基础研究的拓展 体外 工作至关重要。
在本研究中，我们报道了成功建立一种 在卵内 一种可稳定产生患者B细胞和T细胞急性淋巴细胞白血病（B-和T-ALL）细胞三维血管定植的异种移植方案，该方案有望用于设计阻断ALL进展的新型疗法，并可用于开发预测ALL治疗效果及风险的工具。
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方案
实验根据卡尔加里大学伦理委员会（REB15-1143；其中已从所有受试者获得知情同意）和阿尔伯塔癌症委员会健康研究伦理委员会（HREBA.CC-17-0108_REN8）批准的方案进行。纳入研究的患者为初诊时（尚未开始任何治疗前）患有急性淋巴细胞白血病（ALL）且外周血中存在原始细胞（不仅骨髓中存在，血液中也存在原始细胞）的患者。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 卵的孵化
- 获取受精的鸡卵。为避免运输或开壳过程中卵的损坏，应额外多准备约10%的卵。
- 将受精卵在12 °C条件下储存最多两周，以保持其活力。
- 将卵转移至湿度为~50%-60%、温度为39 °C的翻转式培养箱中。
- 在培养箱中孵育卵至10 dpf。注意，第1天从卵转移至培养箱时开始计算。
2. 从急性淋巴细胞白血病（ALL）患者血样中分离急性淋巴细胞白血病细胞
- 按照先前所述的方法分离细胞14,15.
- 从B-ALL和T-ALL患者中采集10 mL外周血（或骨髓）至含肝素的试管中。
- 将血液样本转移至无菌的50 mL离心管中，用含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH的1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释三倍2PO4.
- 将1体积稀释后的血液样本叠加到1体积密度梯度介质上，于室温下以300 × g离心，离心时不用刹车 g 30 分钟。
- 用无菌移液管从界面处收集单个核细胞（MNCs）的棕黄层，并转移至新的无菌15 mL离心管中。
- 加入10 mL 1x PBS，以300 x g离心 g 5分钟，以去除任何残留的血清成分（此步骤重复两次）。
- 加入 2 mL 0.8% NH4将Cl加入细胞沉淀中，轻轻涡旋，室温孵育5分钟，然后以300 x g离心 g 5 分钟以裂解红细胞（如有必要，可重复此步骤）。
- 按照步骤2.6所述，用1×PBS洗涤细胞。
- 用含10% FBS的RPMI 1640重悬细胞，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 使用台盼蓝排斥法检测细胞活力。
- 用冻存液（含10% DMSO的FBS）重悬细胞，在-80 °C条件下冻存，随后转移至液氮中长期保存。
3. 2的扩增nd携带 mCherry 的复制缺陷型慢病毒生成
- 将 HEK293T 人胚肾细胞以约 60%-70% 的融合度接种于 6 孔板中，孔内含 DMEM 培养基，添加 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素，于 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养。
- 使用 Lipofectamine 3000 将细胞（1.5 × 106）与 FUW-Luc-mCherry-puro 转移载体、pCMVΔr8.91 包装载体和 pVSV-G 包膜载体以 3:2:1 的比例共转染，持续 2 天。
- 收集含慢病毒的上清液，并通过 0.45 µm 滤膜过滤。
- 将澄清的病毒上清液转移至离心管中，在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 2 小时，弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 µL PBS 或无血清培养基中。
- 使用 qPCR 慢病毒滴度检测试剂盒测定感染复数（MOI）。
4. 使用 mCherry 标记持续生长的急性淋巴细胞白血病细胞系及患者来源的急性淋巴细胞白血病细胞
- 将B-ALL（SEM）和T-ALL（MOLT3）16,17细胞系及患者来源的B-或T-ALL细胞以1 × 106 个细胞/mL的密度接种于含RPMI 1640 + 10% FBS的6孔板中。
- 每1 × 106 个细胞加入300 µL慢病毒液（病毒滴度为3.47 × 106 IU/mL），使感染复数（MOI）为1，轻轻混匀后于37 °C、5% CO2条件下培养2天。
- 向培养基中加入1 µg/mL嘌呤霉素，筛选稳定转导的细胞，持续2天。
- 使用荧光显微镜观察表达mCherry标记的细胞。
5. 在卵内 异种移植
- 在第10天（参见上述鸡蛋孵化部分），在透射光下观察鸡胚的血管系统以评估胚胎活力。随后，用70%乙醇轻轻清洗鸡蛋表面，进行表面消毒。
- 使用手钻在鸡蛋的气室处钻孔，开一个直径约2.0 cm的小窗口。
- 用透明胶带密封窗口，并放回5% CO2培养箱中继续孵育。
- 在第11天，使用34 G针头将1 × 107个mCherry标记的ALL细胞注射至发育中胚胎的血管内。需要注意的是，由于无法保证每次开窗位置完全一致，因此难以确认ALL细胞是否被注射至不同胚胎的相同位置。
- 用透明胶带密封窗口，放回5% CO2培养箱中，并每日监测胚胎活力。
- 在第15天，从胚胎中解剖出血管组织，置于载玻片上，使用配备荧光功能的体视显微镜拍摄成功移植的异种移植物图像。
注意：超过15天后（此时羽毛已覆盖全身，卵白几乎耗尽），需进行免疫组织化学分析，以评估ALL细胞在鸡胚血管系统中的增殖与定植变化。
6. 流式细胞术
- 在第15天，使用带有32 G针头的无菌注射器从鸡胚血管系统采集血液，转移至含有肝素的1.5 mL无菌离心管中，并在4 °C下以226 × g离心10分钟。
- 移除上清液（血浆），并将细胞沉淀重悬于含1% BSA（牛血清白蛋白）的1× PBS中。
- 执行步骤2.7和步骤2.8以裂解红细胞。
- 在4 °C避光条件下孵育30分钟，分别使用人源FITC-CD10和人源PE-CD19抗体标记B-ALL细胞，使用人源FITC-CD4和人源PE-CD8抗体标记T-ALL细胞。
- 用含1% BSA的PBS洗涤标记后的细胞两次，每次在4 °C下以226 × g离心5分钟，然后重悬于1× PBS中，并通过流式细胞术进行分析。
- 将前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）电压分别设置为400 V和360 V。将FITC和PE通道的检测器增益分别调整为450–500 V和400–450 V。
注意：设门策略：（a）光散射设门（FSC vs. SSC）：使用FSC-A vs. SSC-A识别一群具有中等前向散射（大小）和低侧向散射（颗粒度）的细胞群，对应于淋巴母细胞区域。此步骤有助于排除碎片以及颗粒度更高的细胞（如单核细胞或粒细胞）；（b）单细胞事件选择（FSC-H vs. FSC-A）：通过在FSC-H vs. FSC-A图上设门进行双细胞排除，确保仅分析单细胞事件18。 - 通过统计FITC vs. PE图中第二象限（Q2；FITC/PE+）的事件数量，定量分析CD10/CD19+ B-ALL和CD4/CD8+ T-ALL细胞。数据以三次独立实验的均值±标准误表示（n = 3）18。
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结果
为了确定人急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞在发育中的鸡胚中移植是否成功，2nd-生成的携带 mCherry 的复制缺陷型慢病毒被扩增后用于标记 B-和 T-ALL 细胞系 SEM 和 MOLT316,17，分别如图所示。 图1A约50%的B-（左上两个图板）和T-（右上两个图板）ALL细胞被mCherry标记。随后，患者来源的B-（#1和#2）和T-（#3和#4）ALL细胞也用mCherry进行了标记图1A，左下和右下各四个面板）。经嘌呤霉素处理以富集mCherry标记的ALL细胞用于后续实验 在卵内 人源ALL细胞的异种移植，其时间线在图中以示意图形式展示 图2.
在15 dpf时（即注射mCherry标记的ALL细胞后第4天），解剖发育中鸡胚的血...
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讨论
实验过程中的三个关键步骤在卵内 移植过程中的污染防控与鸡胚存活率优化措施包括：（1）开窗前用70%乙醇对蛋壳表面进行消毒；（2）使用Cellotape严密封闭蛋壳窗口，防止孵化过程中鸡胚内容物蒸发；（3）采用细针头（如34 G）并在最小体积（如100 µL）内注射ALL细胞，以确保有效的血管输送并最大限度减少机械损伤。我们的故障排查分析显示，1 x 107 100 mL 体积内带有 mCherry 标记的 ALL 细胞是实现有效血管定植的最佳剂量。
在异种移植过程中遇到的一个挑战是实现ALL细胞在一致的解剖位点注射。然而，由于需要解剖胚胎的血管以辅助成像分析，难以确认ALL细胞是否被注射到不同胚胎的相同位置。这种变异可能会影响评估ALL植入效率或对实验治疗反应的研究的可重复性。
尽管如此，在注射急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞系和患者来源的ALL细胞后4天观察到的血管定植现象，支持了该模型用于研究ALL细胞植入和增殖的可行性，并表明ALL细胞能够以一种具有生物学相关性的方式与鸡胚血管系统...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢哥伦比亚大学的 Andrew Kung 博士提供 FUW-Luc-mCherry-puro。本研究工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR；PJT-174983）向 KYL 提供的资助，以及韩国国家研究基金会（NRF；RS-2023-00284121）向 KYL 和 M-YJ 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 34G 针头 | BD Perisafe | ||
| Attune NxT 流式细胞仪 | Thermo Fisher | ||
| BD Perisafe 注射器（32G） | BD Perisafe | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | Millipore Sigma | A9647 | |
| 细胞冻存液 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| 离心机（Allegra X-22R 离心机） | Beckman Coulter | ||
| 一次性手套 | Royal Touch300 丁腈检查手套 | ||
| 解剖显微镜 | Leica MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | D12345 | |
| 鸡蛋孵育器，Vevitts 120 滚动孵育器 | Vixest Trading Co. | ||
| 乙醇（95%） | VWR International | BDH1158-4LP | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Ficoll 溶液（Ficoll?? Paque Plus） | MilliporeSigma | GE17-1440-02 | |
| FITC-CD10 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-46656 FITC | |
| FITC-CD4 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-19641 FITC | |
| 荧光显微镜 | Leica Microsystems | ||
| 手电钻（Dremel3000） | Bosch | ||
| HEK293T | ATCC, VA, USA | CRL-3216 | |
| 血细胞计数板 | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| 来源于猪肠黏膜的肝素钠盐 | Millipore Sigma | H3149 | |
| 含肝素的试管 | BD Vacutainer | BD 366480 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| 多重慢病毒滴度检测试剂盒（qPCR 慢病毒滴度检测试剂盒） | Abm | LV900 | |
| NH4Cl（氯化铵） | Millipore Sigma | A9434 | |
| Olympus IX71 倒置显微镜 | Olympus | ||
| PE-CD19 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-19650 PE | |
| PE-CD8 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-1177 PE | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P3813 | |
| 移液器（可调体积） | Eppendorf | ||
| 嘌呤霉素 | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| RPMI 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Scotch 透明胶带 | 3M | ||
| 无菌 6 孔板 | VWR international, Corning | 22250-140 | |
| 无菌离心管 | Axygen Inc, Corning | AXYMCT-150-C-S | |
| 无菌培养瓶（75T） | VWR International | 10062-872 | |
| 无菌 Falcon 管（15 mL） | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 无菌 Falcon 管（50 mL） | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| 无菌滤器（0.45 µm 滤膜） | VWR International | 76778-974 | |
| 无菌镊子 | VWR International | 82027-404 | |
| 无菌载玻片 | VWR international | 48300-031 | |
| 无菌移液器吸头 | VWR International | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| 无菌注射器 | BD syringe | 309628? | |
| 台盼蓝 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | T10282 |
参考文献
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