本实验方案旨在检测羟基红花黄色素A（HSYA）是否能够减轻脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼神经毒性。采用视觉视觉系统评估运动功能。通过免疫组织化学方法检测多巴胺能神经损伤。利用Western blot分析TLR4/NF-κB信号通路相关分子的表达水平。
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本实验方案旨在检测羟基红花黄色素A（HSYA）是否能够减轻脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼神经毒性。采用视觉视觉系统评估运动功能。通过免疫组织化学方法检测多巴胺能神经损伤。利用Western blot分析TLR4/NF-κB信号通路相关分子的表达水平。
脂多糖（LPS）诱导的炎症在触发和持续推动神经退行性疾病（包括帕金森病，PD）中起着关键作用。羟基红花黄色素A（HSYA）是红花（Carthamus tinctorius L.）的主要成分。本研究旨在观察HSYA是否能够改善LPS诱导的斑马鱼多巴胺能神经元的毒性损伤。将斑马鱼暴露于LPS后，给予HSYA处理。通过行为学测试评估斑马鱼的运动功能，并检测多巴胺能神经元损伤及多巴胺水平。同时测定TLR4、NF-κB、IL-1β和TNF-α的表达水平。结果显示，LPS（终浓度60 µg/mL）可诱导斑马鱼产生毒性，导致运动功能障碍以及酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的损伤。LPS暴露不仅降低了多巴胺含量，还增加了IL-1β和TNF-α的水平，并上调了TLR4和NF-κB的表达。HSYA可改善LPS诱导的运动功能障碍。此外，HSYA减轻了TH阳性神经元的丢失，并伴随多巴胺含量的升高。HSYA处理还抑制了TLR4和NF-κB的表达，以及IL-1β和TNF-α的产生。综上所述，本研究表明HSYA通过调控TLR4/NF-κB通路，减轻了炎症诱导的斑马鱼多巴胺能神经元损伤，为预防帕金森病中的炎症性损伤提供了实验依据。
帕金森病（PD）的发病机制是由于脑内多巴胺能神经元受损，导致运动功能进行性恶化。PD 的临床表现包括运动功能障碍，如静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和肌张力异常。炎症是 PD 显著的病理学特征之一。与年龄匹配的健康对照者相比，PD 患者脑脊液及死后黑质纹状体脑区的细胞因子水平显著升高1。炎症导致多巴胺能神经元损伤的机制已较为明确。在 PD 中，中脑多巴胺能神经元对肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ等细胞因子尤为敏感2 。脂多糖（LPS）是细菌的组分之一，被确认为 Toll 样受体 4（TLR-4）的配体。LPS 一旦与 TLR-4 结合，即可引发炎症反应并对组织产生毒性作用。TLR-4 主要定位于中枢神经系统的小胶质细胞上。LPS 激活 TLR-4 后，可诱导 TNF-α 和 IL-1β 的产生。中枢或外周暴露于 LPS 均可对中枢神经系统产生毒性作用。已有证据表明，LPS 诱导的神经毒性在包括 PD 在内的神经退行性疾病的发生与进展过程中发挥重要作用3,4,5。
近年来，斑马鱼已被广泛用作研究神经系统疾病的模型。斑马鱼与人类的基因同源性高达80%，且染色体数目与人类几乎相同。此外，斑马鱼大脑的主....
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实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》（1986年修订版，出版物编号86-23）的规定进行。本研究已获得烟台大学动物护理与使用委员会的批准（批准编号：YTDX20220623）。本研究中所使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 斑马鱼的饲养管理
AB品系斑马鱼（Danio rerio）饲养于循环水系统中，水温为27–28.5 °C（pH值7.0），光照周期为14小时光照/10小时黑暗。斑马鱼每日投喂两次虾料。自然交配后，将受精胚胎收集至含有E3培养基的培养皿中，E3培养基成分为去离子水、KCl、NaCl、MgSO4·7H2O和CaCl2。
2. 脂多糖诱导的斑马鱼毒性
收集受精后24小时（hpf）的斑马鱼胚胎，分为对照组和LPS组，每组60个胚胎。称取LPS粉末，加入一定量的PBS（pH = 7.4）溶液溶解，配制成2 mg/mL的LPS母液，置于-20 °C保存备用。实验时将LPS储备液稀释为30 µg/mL、60 µg/mL和90 µg/mL的LPS工作液。将终浓度为30 µg/mL、60 µg/mL或90 µg/mL的LPS溶液加入含有24....
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脂多糖（LPS）对斑马鱼运动功能的影响
与对照组相比，LPS（60 µg/mL 和 90 µg/mL）组斑马鱼的平均速度、总移动距离和最大加速度均降低（P < 0.01）。运动功能障碍还表现为运动方向频繁改变。与对照组相比，LPS 60 µg/mL 和 LPS 90 µg/mL 组斑马鱼游泳时的绝对转向角显著增加（P < 0.01）（图1）。
LPS对IL-1β和TNF-α的影响
与对照组相比，LPS 60 µg/mL和LPS 90 µg/mL组中IL-1β和TNF-α的含量显著升高（P < 0.01）（图2）。根据这些结果，在后续实验中采用60 µg/mL浓度的LPS诱导斑马鱼的.......
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药用植物在抗炎和神经保护方面具有长期的应用历史14。我们之前的研究表明，羟基红花黄色素A（HSYA）在神经毒素诱导的帕金森病动物模型中具有保护作用。本研究利用脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼毒性模型，证明HSYA通过调控TLR4/NF-κB信号通路，减轻炎症引起的斑马鱼多巴胺能神经元损伤。
睡眠障碍和认知功能障碍不仅与帕金森病（PD）密切相关15,16，运动功能障碍也是帕金森病的关键特征之一17。通过研究脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼毒性模型中的行为表现，我们发现暴露于LPS的斑马鱼其平均速度、总移动距离和最大加速度均下降，同时绝对转向角增大。然而，羟基红花黄色素A（HSYA）可降低绝对转向角，并提高平均速度、总移动距离和最大加速度。因此，可以合理地得出结论：HSYA改善了LPS攻击下斑马鱼的运动功能。
帕金森病（PD）中.......
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作者声明无利益冲突。
作者贡献：
概念化：Guirong Zhang，Bing Han。经费获取：Guirong Zhang，Bing Han。调查：Huilin Zhang。方法学：Huilin Zhang，Mingyue Li，Xiaohan Zhang，Yang Li。监督：Guirong Zhang，Bing Han。撰写-初稿：Mingyue Li，Xiaohan Zhang，Yang Li。撰写-审阅 & 编辑：Huilin Zhang，Guirong Zhang，Bing Han
感谢 Rachel James 对本文稿的编辑。本研究由山东省自然科学基金（项目编号：ZR2020MH377）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白浓度 测定试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0012S | |
| 化学发光成像系统 | 北京赛智创业科技有限公司 | ChampChemi 910 | |
| 盐酸多巴胺 | Sigma–Aldrich | PHR1090 | |
| 电子天平 | 上海奥豪斯仪器有限公司 | AR-2140 | |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | 科博生物技术 | CB10018-FI | |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | 科博生物技术 | CB10148-FI | |
| GAPDH 抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad 统计软件，波士顿， 马萨诸塞州，美国，www.graphpad.com | Prism 5.0 | |
| 高效液相 色谱–电化学 检测（HPLC–ECD） | GL Sciences，日本茨城县 | ED723 | |
| 高速冷冻离心机 | 北京大龙兴创 实验仪器有限公司 | D3024R | |
| HPLC–ECD | GL Sciences | ED723 | |
| HSYA | 绿叶制药集团有限公司 | LY202206 | |
| Image Quant | GE Healthcare，日本东京 | LAS 4000 | |
| Lamin B1 抗体 | Cell Signaling Technology | 13435S | |
| LPS | Sigma–Aldrich | L2630 | |
| 显微镜 | Leica，韦茨拉尔 | DM1000LED | |
| 显微镜 | Leica，德国 | DM1000LED | |
| 多功能酶标仪 | 上海美谷分子仪器有限公司 | SpectraMax Paradigm | |
| NF-κB 抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Noldus 视觉行为分析 XT 系统 | 北京诺达斯生物科技有限公司 | EthoVision XT15 | |
| 核蛋白与胞浆 蛋白提取试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0028 | |
| PMSF | 碧云天生物技术 | ST506 | |
| TAK-242 | Merck | 614316 | |
| 恒温器 | 深圳银河仪器有限公司 | 12810129 | |
| TLR4 抗体 | Abcam | ab13556 | |
| 斑马鱼 | 中国北方国家 斑马鱼模式动物中心 | AB 品系 | |
| 斑马鱼循环水系统 | 北京艾生生物科技有限公司 | ESEN-AW-S1 |
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