本实验方案旨在检测羟基红花黄色素A（HSYA）是否能够减轻脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼神经毒性。采用视觉视觉系统评估运动功能。通过免疫组织化学方法检测多巴胺能神经损伤。利用Western blot分析TLR4/NF-κB信号通路相关分子的表达水平。
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本实验方案旨在检测羟基红花黄色素A（HSYA）是否能够减轻脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼神经毒性。采用视觉视觉系统评估运动功能。通过免疫组织化学方法检测多巴胺能神经损伤。利用Western blot分析TLR4/NF-κB信号通路相关分子的表达水平。
脂多糖（LPS）诱导的炎症在触发和持续推动神经退行性疾病（包括帕金森病，PD）中起着关键作用。羟基红花黄色素A（HSYA）是红花（Carthamus tinctorius L.）的主要成分。本研究旨在观察HSYA是否能够改善LPS诱导的斑马鱼多巴胺能神经元的毒性损伤。将斑马鱼暴露于LPS后，给予HSYA处理。通过行为学测试评估斑马鱼的运动功能，并检测多巴胺能神经元损伤及多巴胺水平。同时测定TLR4、NF-κB、IL-1β和TNF-α的表达水平。结果显示，LPS（终浓度60 µg/mL）可诱导斑马鱼产生毒性，导致运动功能障碍以及酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的损伤。LPS暴露不仅降低了多巴胺含量，还增加了IL-1β和TNF-α的水平，并上调了TLR4和NF-κB的表达。HSYA可改善LPS诱导的运动功能障碍。此外，HSYA减轻了TH阳性神经元的丢失，并伴随多巴胺含量的升高。HSYA处理还抑制了TLR4和NF-κB的表达，以及IL-1β和TNF-α的产生。综上所述，本研究表明HSYA通过调控TLR4/NF-κB通路，减轻了炎症诱导的斑马鱼多巴胺能神经元损伤，为预防帕金森病中的炎症性损伤提供了实验依据。
帕金森病（PD）的发病机制是由于脑内多巴胺能神经元受损，导致运动功能进行性恶化。PD 的临床表现包括运动功能障碍，如静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳和肌张力异常。炎症是 PD 显著的病理学特征之一。与年龄匹配的健康对照者相比，PD 患者脑脊液及死后黑质纹状体脑区的细胞因子水平显著升高1。炎症导致多巴胺能神经元损伤的机制已较为明确。在 PD 中，中脑多巴胺能神经元对肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ等细胞因子尤为敏感2 。脂多糖（LPS）是细菌的组分之一，被确认为 Toll 样受体 4（TLR-4）的配体。LPS 一旦与 TLR-4 结合，即可引发炎症反应并对组织产生毒性作用。TLR-4 主要定位于中枢神经系统的小胶质细胞上。LPS 激活 TLR-4 后，可诱导 TNF-α 和 IL-1β 的产生。中枢或外周暴露于 LPS 均可对中枢神经系统产生毒性作用。已有证据表明，LPS 诱导的神经毒性在包括 PD 在内的神经退行性疾病的发生与进展过程中发挥重要作用3,4,5。
近年来，斑马鱼已被广泛用作研究神经系统疾病的模型。斑马鱼与人类的基因同源性高达80%，且染色体数目与人类几乎相同。此外，斑马鱼大脑的主要结构及其信号通路与哺乳动物相似。斑马鱼还能产生大量透明的胚胎，发育迅速，并易于进行遗传操作6。这些优势使斑马鱼成为研究帕金森病（PD）发病机制以及开展PD高通量药物筛选的理想模型。
羟基红花黄色素A（HSYA）是红花（Carthamus tinctorius L.）的主要成分。既往研究表明，HSYA具有抗炎特性。在原代中脑培养体系中，20 µM至640 µM浓度的HSYA未表现出任何毒性作用，且40 µM至640 µM浓度范围内的HSYA可减轻脂多糖（LPS）诱导的多巴胺能神经元损伤7。采用6-羟基多巴胺处理C57BL/6J小鼠以建立帕金森病（PD）模型，结果显示HSYA不仅可缓解神经功能损伤，还能保护脑内多巴胺能神经元。此外，HSYA降低了黑质中环氧合酶-2、诱导型一氧化氮合酶以及核因子κB的表达水平8。
迄今为止，尚无研究报告证实羟基红花黄色素A具有降低脂多糖毒性的作用 体内结果表明，羟基红花黄色素A减轻了脂多糖诱导的细胞毒性 体外7然而，基于细胞的评估并不能代表神经毒性的复杂过程中的所有步骤。斑马鱼在揭示毒性机制方面具有特别重要的价值。近年来的研究还表明，羟基红花黄色素A（HSYA）能够通过降低蛋白激酶B的表达来抑制NF-κB炎症通路的活化，从而减轻炎症反应；同时，HSYA还能抑制活化蛋白1相关的炎症信号通路，进而影响细胞增殖及肿瘤坏死因子α诱导的炎症损伤。9,10本研究旨在探究HYSA是否能够改善脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼多巴胺能神经元毒性。
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实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》（1986年修订版，出版物编号86-23）的规定进行。本研究已获得烟台大学动物护理与使用委员会的批准（批准编号：YTDX20220623）。本研究中所使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 斑马鱼的饲养管理
AB品系斑马鱼（Danio rerio）饲养于循环水系统中，水温为27–28.5 °C（pH值7.0），光照周期为14小时光照/10小时黑暗。斑马鱼每日投喂两次虾料。自然交配后，将受精胚胎收集至含有E3培养基的培养皿中，E3培养基成分为去离子水、KCl、NaCl、MgSO4·7H2O和CaCl2。
2. 脂多糖诱导的斑马鱼毒性
收集受精后24小时（hpf）的斑马鱼胚胎，分为对照组和LPS组，每组60个胚胎。称取LPS粉末，加入一定量的PBS（pH = 7.4）溶液溶解，配制成2 mg/mL的LPS母液，置于-20 °C保存备用。实验时将LPS储备液稀释为30 µg/mL、60 µg/mL和90 µg/mL的LPS工作液。将终浓度为30 µg/mL、60 µg/mL或90 µg/mL的LPS溶液加入含有24 hpf斑马鱼胚胎的培养皿中，每个实验孔的溶液体积为3 mL。对照组斑马鱼胚胎在不含LPS的E3培养基中培养。培养皿置于28 °C恒温培养箱中。按照上述方法连续处理五天，每天重复暴露LPS。
3. TLR4抑制剂对脂多糖诱导的斑马鱼毒性的效应
在24 hpf时，将斑马鱼胚胎分为对照组、LPS组和TAK-242组。已有大量研究验证了TAK-242在终浓度为1 µM时对TLR4信号通路的调控作用，其中一些研究表明，TAK-242通过抑制LPS诱导的细胞增殖及炎症因子的释放，为解决术后青光眼减轻相关问题提供了新思路11。在TAK-242组中，向含有24 hpf斑马鱼胚胎的培养皿中加入TAK-242（终浓度1 µM）；每个实验孔的溶液体积为3 mL。30分钟后，加入LPS（终浓度60 µg/mL）以诱导毒性，该LPS浓度不会导致斑马鱼胚胎死亡。对照组胚胎仅维持在E3培养基中。将培养皿置于28 °C恒温培养箱中。上述操作连续重复五天。
4. HSYA 对脂多糖诱导的斑马鱼毒性的效应
将24 hpf的斑马鱼胚胎分为对照组、LPS组和HSYA组。在含有24 hpf斑马鱼胚胎的培养皿中加入终浓度为20 µM、40 µM或80 µM的HSYA，每个实验孔的溶液体积为3 mL。30分钟后，加入LPS（终浓度60 µg/mL）。对照组胚胎仅维持在E3培养基中。将培养皿置于28 °C恒温培养箱中。上述操作连续重复五天。
5. 行为学评估
将斑马鱼转移至96孔板中间的60个孔中，每孔放置一条斑马鱼幼体。每个孔中加入250 µL E3培养基，以允许其自由游动。使用视觉系统记录其运动活动。向暗箱（30 cm × 40 cm × 60 cm）中加入纯水，并设置为加热状态，温度调节至28 °C。
当暗箱温度达到 28 °C 时，将含有斑马鱼的 96 孔板放入其中，并启动视觉视觉系统以记录其运动活动。创建一个新文件夹用于存储数据。Homemade Video File 被选为视频源，以进入实验设置界面。在实验设置部分，观察区域数量被设置为 60，以便同时观察 60 条斑马鱼。在区域设置中，镜头拍摄到的 96 孔板图像显示在屏幕上，并带有定位圆。通过调整排列区域界面中的模块，使镜头捕捉区域与每个孔对齐。在区域硬件映射中，暗箱光源被设置为开启。
在试验控制设置中，创建了一个包含10分钟准备期和10分钟检测期的新程序，并将其应用于所有并行实验。检测设置用于确认镜头捕获功能运行正常。在试验列表中，显示了每组60条斑马鱼的数据。利用工具栏中的试验次数生成包含所有实验组的数据表，以确保数据的完整性。
所有设置均已确认，暗箱温度维持在 28 °C。确认每个孔中均含有一条具有生命体征的斑马鱼后，开始实验。实验过程中，行为学仪器的镜头记录斑马鱼的运动轨迹、持续时间及相关参数。第一次记录持续 20 min 后，系统自动结束并准备下一次试验。打开暗箱，将 96 孔板更换为含有用于后续实验的斑马鱼的新孔板。
实验结束时，从分析模块中选择结果。从结果模块中提取平均速度、距离、最大加速度和绝对转向角等实验参数，并导出数据。随后对数据进行汇总，以分析斑马鱼各组之间的行为差异12。
6. 炎症性细胞因子的测定
收集斑马鱼样本，称重后按1:9的重量体积比加入磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH = 7.4），在4 °C条件下以5000 r/min匀浆30秒。将匀浆液在4 °C、5000 × g 条件下离心20分钟，收集上清液。使用鱼类ELISA试剂盒按照制造商提供的说明书检测IL-1β和TNF-α水平。
7. 免疫组织化学
将斑马鱼用5 mL 4%（v/v）多聚甲醛固定，经石蜡包埋后切成5 µm厚的切片。切片加入200 µL柠檬酸盐缓冲液，微波加热10分钟。随后用含0.3%过氧化氢的甲醇溶液于37 ºC孵育30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入非免疫血清于37 ºC孵育30分钟。加入一抗抗TH抗体（1:100），于37 ºC孵育30分钟。用PBS洗涤3次。加入与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1:200），于37 ºC孵育30分钟。然后加入3,3´-二氨基联苯胺显色。使用明场显微镜对切片进行成像。
8. 神经递质
采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）测定多巴胺水平。将盐酸多巴胺溶解于0.1 M高氯酸（HClO4）中，配制浓度梯度为3.90625 ng/mL、7.8125 ng/mL、15.625 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5 ng/mL和125 ng/mL的标准溶液。使用HPLC-ECD分析一系列多巴胺标准溶液，根据多巴胺浓度与其峰面积进行线性回归，绘制标准曲线。将斑马鱼组织用0.1 M HClO413匀浆。匀浆液在4 °C条件下以20,000 × g离心15分钟。随后，样品在ODS2色谱柱（E2118047；4.6 × 250 mm，5 µm）上进行分离。流动相缓冲液的组成为：25 mmol/L乙酸钠、25 mmol/L柠檬酸、0.01 mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐、1 mmol/L辛烷磺酸钠，并用乙酸调节pH至3.35。流动相为乙腈:缓冲液（1:9, v/v）。样品经0.22 µm滤膜真空过滤后，超声脱气10分钟。色谱柱温箱温度设为30 °C，流速为1 mL/min，进样体积为20 µL。电化学检测器工作电压为1000 mV，量程为10 µA。根据回归方程计算斑马鱼组织中多巴胺的含量。
9. 蛋白质印迹
从斑马鱼组织中提取蛋白质，并测定其浓度（最终浓度：10 mg/mL）。取50 µg/5 µL蛋白质样品进行8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜条件为110 V，持续1小时。用5%脱脂奶粉室温封闭膜1小时。随后在4 °C下与一抗孵育：兔抗TLR4抗体（1:1000）、兔抗NF-κB抗体（1:2000）、兔抗lamin B1抗体（1:2000）或兔抗GAPDH抗体（1:1000）。用TBST缓冲液洗涤3次，每次5分钟，然后加入二抗室温孵育1小时。使用ECL化学发光底物试剂盒显影条带，并通过凝胶成像系统进行定量分析。以lamin B1和GAPDH作为上样对照。
10. 统计分析
所有数据均以均值 ± 标准差表示，并使用统计软件进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计检验，随后进行Tukey检验。当P值小于<0.05时，认为差异具有统计学显著性。
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脂多糖（LPS）对斑马鱼运动功能的影响
与对照组相比，LPS（60 µg/mL 和 90 µg/mL）组斑马鱼的平均速度、总移动距离和最大加速度均降低（P < 0.01）。运动功能障碍还表现为运动方向频繁改变。与对照组相比，LPS 60 µg/mL 和 LPS 90 µg/mL 组斑马鱼游泳时的绝对转向角显著增加（P < 0.01）（图1）。
LPS对IL-1β和TNF-α的影响
与对照组相比，LPS 60 µg/mL和LPS 90 µg/mL组中IL-1β和TNF-α的含量显著升高（P < 0.01）（图2）。根据这些结果，在后续实验中采用60 µg/mL浓度的LPS诱导斑马鱼的...
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药用植物在抗炎和神经保护方面具有长期的应用历史14。我们之前的研究表明，羟基红花黄色素A（HSYA）在神经毒素诱导的帕金森病动物模型中具有保护作用。本研究利用脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼毒性模型，证明HSYA通过调控TLR4/NF-κB信号通路，减轻炎症引起的斑马鱼多巴胺能神经元损伤。
睡眠障碍和认知功能障碍不仅与帕金森病（PD）密切相关15,16，运动功能障碍也是帕金森病的关键特征之一17。通过研究脂多糖（LPS）诱导的斑马鱼毒性模型中的行为表现，我们发现暴露于LPS的斑马鱼其平均速度、总移动距离和最大加速度均下降，同时绝对转向角增大。然而，羟基红花黄色素A（HSYA）可降低绝对转向角，并提高平均速度、总移动距离和最大加速度。因此，可以合理地得出结论：HSYA改善了LPS攻击下斑马鱼的运动功能。
帕金森病（PD）中...
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作者声明无利益冲突。
作者贡献：
概念化：Guirong Zhang，Bing Han。经费获取：Guirong Zhang，Bing Han。调查：Huilin Zhang。方法学：Huilin Zhang，Mingyue Li，Xiaohan Zhang，Yang Li。监督：Guirong Zhang，Bing Han。撰写-初稿：Mingyue Li，Xiaohan Zhang，Yang Li。撰写-审阅 & 编辑：Huilin Zhang，Guirong Zhang，Bing Han
感谢 Rachel James 对本文稿的编辑。本研究由山东省自然科学基金（项目编号：ZR2020MH377）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白浓度 测定试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0012S | |
| 化学发光成像系统 | 北京赛智创业科技有限公司 | ChampChemi 910 | |
| 盐酸多巴胺 | Sigma–Aldrich | PHR1090 | |
| 电子天平 | 上海奥豪斯仪器有限公司 | AR-2140 | |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | 科博生物技术 | CB10018-FI | |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | 科博生物技术 | CB10148-FI | |
| GAPDH 抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad 统计软件，波士顿， 马萨诸塞州，美国，www.graphpad.com | Prism 5.0 | |
| 高效液相 色谱–电化学 检测（HPLC–ECD） | GL Sciences，日本茨城县 | ED723 | |
| 高速冷冻离心机 | 北京大龙兴创 实验仪器有限公司 | D3024R | |
| HPLC–ECD | GL Sciences | ED723 | |
| HSYA | 绿叶制药集团有限公司 | LY202206 | |
| Image Quant | GE Healthcare，日本东京 | LAS 4000 | |
| Lamin B1 抗体 | Cell Signaling Technology | 13435S | |
| LPS | Sigma–Aldrich | L2630 | |
| 显微镜 | Leica，韦茨拉尔 | DM1000LED | |
| 显微镜 | Leica，德国 | DM1000LED | |
| 多功能酶标仪 | 上海美谷分子仪器有限公司 | SpectraMax Paradigm | |
| NF-κB 抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Noldus 视觉行为分析 XT 系统 | 北京诺达斯生物科技有限公司 | EthoVision XT15 | |
| 核蛋白与胞浆 蛋白提取试剂盒 | 碧云天生物技术 | P0028 | |
| PMSF | 碧云天生物技术 | ST506 | |
| TAK-242 | Merck | 614316 | |
| 恒温器 | 深圳银河仪器有限公司 | 12810129 | |
| TLR4 抗体 | Abcam | ab13556 | |
| 斑马鱼 | 中国北方国家 斑马鱼模式动物中心 | AB 品系 | |
| 斑马鱼循环水系统 | 北京艾生生物科技有限公司 | ESEN-AW-S1 |
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