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一种用于测量抑郁小鼠模型中嗅觉享乐偏好的嗅觉偏好测试

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DOI：

10.3791/68391

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2025年7月11日

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1Centre National de la Recherche Scientifique, Unité Mixte de Recherche 3571, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 2Ecole Doctorale 158 - Cerveau, Cognition, Comportement, Université Paris Cité, 3Laboratoire d’Ethologie Expérimentale et Comparée – UR 4443, Université Sorbonne Paris Nord, 4Université de Paris Cité, 5Department of Psychiatry, Service Hospitalo-Universitaire, GHU Paris Psychiatrie & Neuroscience

本文内容

摘要

本文介绍了一种嗅觉偏好测试方案，可用于评估抑郁小鼠模型对具有吸引力和厌恶性气味刺激的负面嗅觉偏向。

摘要

抑郁症是全球致残的首要原因，每年影响2.8亿人。除了活动减少和动机降低外，研究表明抑郁症还与情感效价的负性偏倚相关：与健康个体相比，患者对中性及积极的感官刺激感受更不愉快，而对负性刺激则感受更不愉快。特别是嗅觉享乐偏倚可能代表患者疾病状态的标志物，并可在小鼠模型中轻松测量。然而，目前在动物中可用于以可转化方式测量情绪偏倚的测试极为有限。本文提出了一种通过探索具有不同享乐价值的气味物质来可靠评估对照组和抑郁样小鼠气味效价归因的实验方案。利用该嗅觉偏好测试及多种行为读数，我们在两种不同的小鼠抑郁模型中均证实了对趋近性和回避性刺激均存在负性嗅觉偏倚。重要的是，该方法适用于雄性和雌性个体。最后，该方案允许多种改进以优化情绪反应的评估，并可轻松与用于神经元活动实时监测的经典工具相结合。

引言

抑郁症是一种严重的情绪障碍，也是全球致残的主要原因之一。根据世界卫生组织的数据，全球约有2.8亿人（即人口的4%）患有抑郁症。女性患病率比男性高50%，在新冠疫情暴发的第一年，抑郁障碍的患病率上升了25%（世界卫生组织，2022年）。此外，约三分之一的患者对传统抗抑郁治疗无效，抗抑郁效果通常需要数周才能显现，而情绪障碍的病理生理机制在很大程度上仍不清楚。

根据《精神障碍诊断与统计手册（第五版）》（DSM-5）1，抑郁症的诊断依据包括多种症状，如情绪低落、兴趣或愉悦感丧失、显著的体重变化、精神和身体活动迟滞、疲劳、无价值感、注意力难以集中，以及反复出现的死亡念头。临床研究还表明，情绪障碍常伴随感觉功能的改变：与对照组个体相比，抑郁症患者对感觉刺激的愉悦感受降低2,3,4。

享乐性"效价"是指某种事物令人愉悦（正性效价）或令人厌恶（负性效价）的程度。对刺激赋予特定效价可触发适应性行为，包括趋近或回避5。有趣的是，这一过程在从昆虫到人类的多个物种间高度保守6。因此，抑郁症与效价的负性偏倚相关。然而，目前临床诊断对感觉偏倚评估的依赖仍较少。

在各种感觉模式中，嗅觉尤为引人关注，因为嗅觉输入在很大程度上绕过了丘脑中继，直接投射至包括人类在内的哺乳动物的边缘系统。从进化角度看，该系统已被证明在编码对环境刺激的一系列基本反应中起关键作用7,8,9,10,11,12。在这些共有的神经回路基础上，临床研究揭示了嗅觉与抑郁症之间存在双向关系：抑郁症患者会出现嗅觉功能改变，而嗅觉障碍亦可引发抑郁症状13。此外，抑郁症患者在接受药物治疗或心理干预后，其嗅觉功能可得到恢复14,15,16,17。这些结果提示，嗅觉缺陷可能更倾向于作为疾病的状态生物标志物（反映患者临床表现的当前状态），而非特质生物标志物（指在精神疾病病理生理过程中起前置性、可能因果性作用的特征，可用于早期、症状前诊断）18。因此，更深入地理解抑郁症中嗅觉模态的改变机制，可能为开发新的诊断工具以及评估治疗反应性的方法开辟道路。

因此，在抑郁症模型中评估嗅觉情感偏向具有特殊意义，不仅可用于评价所诱导的抑郁样表型，还可作为研究这些效价分配变化背后神经机制的工具。先前已有研究采用行为学方法来评估小鼠对气味效价的判断。然而，这些检测方法存在若干局限性：它们需要复杂的设备19，且大多涉及带盖的封闭箱体19,20,21，需要与气味溶液持续发生物理接触20,21,22，和/或导致极短的气味探索时间21,22,23。这些限制使得此类检测方法无法与需要在固定小鼠中进行较长时间采样的神经元活动活体监测经典技术相兼容。

此外，Malkesman 等人已开发出雌性小鼠尿液嗅探测试（Female Urine Sniffing Test, FUST），通过测量雄性啮齿类动物对雌性小鼠尿液的嗅觉探究行为来监测其寻求奖赏的活动24。然而，该测试仅评估动物对一种特定社交性质的正性刺激的行为反应，且互动时间较短。此外，该测试仅针对雄性啮齿类动物设计，而实际上女性抑郁症的发病率是男性的两倍。

为了克服上述所有局限性，我们在此开发了一种改良的嗅觉偏好测试（Olfactory Preference Test, OPT），该方法改编自 Bigot 等人14的研究，可使雄性和雌性小鼠暴露于多种中性、正性及负性气味中，从而在抑郁背景下精确评估其享乐反应。所选气味可依据以往文献14,25确定，但该测试也支持探索新的社会性、营养相关或感染相关刺激，既可使用天然成分，也可采用单分子化合物或特异性设计的化学混合物。

方案

所有动物护理和实验程序均遵循国家及欧洲（2010/63/EU）指南，并获得法国研究部批准（APAFiS：#16380-2018080217358599_v1；APAFIS #51636-2024101718013761_v4）。实验使用 C57BL/6JRj 雄性和雌性小鼠（UCMS 模型）以及 C57BL/6NTac 雄性小鼠（CORT 模型），鼠龄均为 8 周。选择 C57BL/6 亚系的依据来自相关文献。27重要的是，每种模型均与其同 substrain 的对照组进行比较。所有小鼠均群居饲养（每笼4-5只），在标准条件下维持（23 ± 1 °C；湿度40%），光照周期为14/10小时光暗循环（光照开启时间为上午7点），并可自由获取食物和水 随意摄取.

1. 实验装置

  1. 实验区域的安装
    1. 准备实验装置，该装置由一个两室区域（45 cm × 50 cm × 25 cm）组成，区域壁为灰色有机玻璃，底部为白色。用一块灰色有机玻璃板（37 cm × 25 cm）将两个隔室（每个25 cm × 45 cm）分隔开。
    2. 在每个隔室的隔板底部放置一个带孔的培养皿（60 mm × 15 mm，含7个直径为5 mm的孔）。
    3. 使用双面胶或压敏胶（例如Blu-tack）将培养皿垂直固定在隔板上。
    4. 在区域上方放置一台摄像机，用于记录动物行为（距区域上方2 m），并在整个实验过程中自动追踪其运动轨迹。
  2. 气味的选择
    1. 实验前，选择一组具有中性、正性和负性效价的气味进行测试（示例见表1）。
    2. 确保所有选定气味具有相似的蒸气压。此外，可使用光离子化检测器（PID）26评估部分气味在区域内的扩散情况。
    3. 每种气味应在不同的日期单独测试。
      注意：建议先测试中性气味，然后是诱引性气味，最后是厌恶性气味，以尽量减少不同测试日之间的探索行为影响。此顺序可最大限度地降低测试日之间的残留效应。也可采用随机呈现方式，但所有实验组必须使用相同的气味顺序。
  3. 实验分组设计
    1. 将小鼠分为至少两个实验组：对照组小鼠和将接受抑郁模型处理的小鼠。同一组的小鼠应饲养于相同的笼子中。
      注意：每个实验组应至少包含约7–8只个体，以确保统计学显著性。动物饲养笼应尽量放置在动物房内相近的位置，以减少笼位效应。
    2. 使用选定的抑郁模型诱导相关小鼠组产生类抑郁表型。
      ​注意：本文不涉及诱导小鼠类抑郁行为的具体操作方案。然而，本研究展示了使用两种不同模型（不可预测的慢性轻度应激[UCMS]和皮质酮[CORT]）27,28作为该嗅觉偏好测试的代表性结果。简而言之，UCMS模型通过在数周内暴露于多种不同的环境应激源来建立，而CORT模型则是通过在小鼠饮水中长期添加溶解的皮质酮（约5 mg/kg/天，根据小鼠饮水量调整）来实现。

2. 习惯化阶段

  1. 一般适应与操作
    1. 小鼠到达后，保持 1 周不干扰，期间不更换垫料。在笼内添加额外的棉质材料和一个 igloo（小屋），以减少应激。
    2. 1 周后，每天温和地抓取所有小鼠进行操作，持续 3–4 天，并使其适应杯式抓取操作，最好在实验室内进行。
  2. 测试的实验条件
    1. 实验开始前 30 分钟，将小鼠转移至行为测试室。
      注意：理想情况下，行为实验室内应分为两个独立区域，使未测试动物待在一个区域，而正在测试的小鼠在另一区域进行实验。
    2. 确保维持标准饲养条件（23 ± 1 °C；湿度 40%），且实验室内无干扰性声音、光照或气味。
    3. 使用照度计将测试 arena 的光照强度调节至约 40 lux，并确保 arena 内照明均匀。
  3. 对 arena 的适应
    1. 在两个培养皿（60 mm × 15 mm）中各放入一张洁净的滤纸（42.5 mm）。
    2. 使用透明胶带将培养皿的盖子固定在底部（因为培养皿将垂直放置）。
    3. 第一天，将同一饲养笼内的所有小鼠一起轻柔地放入 arena 中，持续 10 分钟，以减少新奇恐惧反应。
      ​警告：始终通过杯式抓取方式将小鼠放入 arena，避免因抓取尾巴引起应激。
    4. 第二天，将每只小鼠单独引入 arena，放置于两个隔间之间的中央位置，记录其行为 10 分钟。
      ​警告：务必在个体之间，尤其是雄性和雌性小鼠之间，使用消毒液（如 70% 乙醇）彻底清洁 arena 及墙壁下部，以避免残留气味干扰。
    5. 连续重复 2–3 天。
  4. 探索标准
    1. 定义两个放置培养皿的区域（25 cm × 15 cm），并测量每只动物在每个区域中停留的时间。
    2. 将所有个体适应阶段的数据进行平均。
    3. 如果每只动物在每个区域的平均停留时间均超过 50 秒，则视为达到标准；否则需重复适应训练，直至达标，或在未达标时将该动物从分析中剔除。
      ​注意：每天最多可进行两次适应训练（上午和下午各一次）。

3. 测试阶段

  1. 气味的制备
    1. 在测试当天，在通风橱内按正确稀释比例配制气味。根据化合物的化学结构，将气味物质稀释于矿物油或蒸馏水中。为避免污染，应将矿物油储存在远离气味剂的独立通风房间内。
      注意：开始新实验时，建议使用新瓶装的矿物油。
    2. 将气味溶液储存于玻璃小瓶中。避免使用塑料管容器，以防引入气味污染。
    3. 在每只小鼠测试前，使用带滤芯吸头的移液器吸取200 µL气味溶液，并将其滴加到两个培养皿之一中的滤纸上。
    4. 保持第二个培养皿中的滤纸不做任何处理。
    5. 将培养皿转移至测试房间，并垂直固定在实验箱体的墙壁上。
      警告：切勿在实验室内配制或丢弃气味溶液，以避免气味污染。实验过程中应定期更换手套。若怀疑在操作气味时手套已被污染，则在抓取小鼠进行测试前必须更换手套。
  2. 行为学测试
    1. 将每只小鼠单独放入实验箱内，置于两个区域之间的中央位置。
    2. 记录10分钟。
    3. 将小鼠从实验箱中移出。
    4. 移除含有气味的培养皿。
    5. 使用消毒液（例如70%乙醇）清洁实验箱并将其擦干。确保同时擦拭箱体墙壁的下部区域。
    6. 丢弃使用过的滤纸，并为下一只小鼠重复气味制备步骤。
    7. 理想情况下，每天仅测试一种气味。建议优先测试中性气味，然后是正性气味，最后是负性气味（见图1）。
      警告：整个实验期间，每天的 适应和测试步骤应尽量在相同时间段内进行（理想时间为上午9点至下午3点之间）。如果动物数量较多，所需测试时间较长，则应注意交替测试不同的实验组，以避免时间偏差。若同一实验中需测试雄性和雌性小鼠，建议先测试一种性别，再测试另一种性别。
      注意：测试期间每天均应使用清洁的培养皿，以防气味残留。值得注意的是，穿孔培养皿在经过适当清洗和去气味处理后，可在多个实验中重复使用。对照用滤纸也可根据需要每日更换。

4. 数据分析

  1. 行为追踪
    1. 使用自动追踪程序记录小鼠在测试过程中的位置。
    2. 在竞技场中定义用于分析的不同区域（参见 图1):
      1. 定义一个“气味区”（25 cm × 15 cm），即放置含有浸有气味物质的滤纸的培养皿的区域（即靠近气味源、约占表面隔室三分之一的区域）。
      2. 定义一个“对照区”（25 cm × 15 cm），与“气味区”对称，但在培养皿中不添加任何气味物质。
      3. 定义一个“后部气味区”（25 cm × 30 cm），即气味培养皿放置区域以外的其余隔间部分。
      4. 定义一个“后部对照区”（25 cm × 30 cm），与“后部对照区”对称，由无气味隔室的其余部分组成。
        注意：追踪小鼠身体中心点足以分析动物的嗅觉偏好。然而，若能特异性地追踪每只小鼠的鼻尖位置，则可更精确地反映动物对气味的探究行为。
  2. 享乐反应的读数
    1. 使用自动追踪系统，收集每只小鼠在测试期间每一天（包括适应阶段）的相关信息：
      1. 记录在实验区域内的总移动距离（m）。
      2. 记录在实验区域各分区所花费的时间（s）。
      3. 记录动物在竞技场各区域的进入次数。
    2. 利用总移动距离来评估主要的运动效应。
    3. 为评估对不同气味的嗅觉偏好差异，使用以下主要读数：
      1. 使用在气味区域所花费的时间。
      2. 使用气味区域中的条目数量。
      3. 使用偏好指数，该指数计算为小鼠在气味区域停留时间与习惯化阶段在该区域停留时间的比值（归一化处理基于所有组别的小鼠数据）。均值指小鼠在气味区域停留时间的算术平均值，sd 指其标准差。
        Preference index formula, including mean and standard deviation, in statistical analysis equation.
      4. 使用气味探索指数，该指数计算方法如下：取在气味区域内的移动距离（标准化后）、在气味区域停留时间（标准化后）以及进入气味区域次数（标准化后）的平均值。
        Normalized value formula, equation for statistical data analysis, standard deviation, and mean calculation.
        Odor exploration index formula; mean(time, entries, distance), normalized calculation
        注意：如有必要，可对本偏好指数进行调整，例如通过比较动物在不同气味区域的停留时间 与 对照区域。若各组在习惯化阶段对“气味区域”的探索存在显著差异，可仅以对照组为基准进行归一化处理，而非以所有组别合并后的数据为基准。
    4. 将对照组和抑郁样小鼠的这些读数以均值 ± 均值标准误（SEM）的形式进行可视化表示。
    5. 采用重复测量双因素方差分析（ANOVA），随后进行事后检验（本研究中使用未校正的Fisher最小显著性差异检验），以同时考虑实验分组、气味（重复测量因素）以及交互作用因素的影响。交互作用因素用于判断各组间差异在所有呈现的气味条件下是否具有一致性。
    6. 使用适配的检验方法（Shapiro-Wilk 检验、Bartlett 检验）验证正态性与方差齐性。统计学显著性水平设定为 *p* < 0.05 < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001.

结果

为了验证抑郁样小鼠是否存在负性嗅觉偏倚14,29，并确认我们所描述的嗅觉偏好测试方案能够可靠地检测该偏倚，我们评估了两种不同的抑郁症小鼠模型对不同气味的享乐反应。

首先，我们采用了一种持续4周的不可预测性慢性轻度应激（UCMS）小鼠模型，该模型改编自文献28（详细方案见补充文件1），以在年轻的雌性C57BL/6JRj小鼠中诱导出类似抑郁的表型（图2A、B）。这些雌性小鼠接受了嗅觉偏好测试，其中使用雄性小鼠尿液（MU，纯品）作为趋近性气味，2,4,5-三甲基噻唑（TMT，矿物油中5%浓度）作为厌恶性气味。在适应阶段，每只小鼠在“对照区”和“气味区”平均停留时间均不少于50秒，满足实验标准（图2C）。然而，在适应过程中，UCMS小鼠在“对照区”的停留时间显著长于对照组小鼠；但由于在即将添加气味的区域之间无显著差异，该差异可忽略不计。在移动距离方面，对照组小鼠在暴露于MU时的活动距离显著大于UCMS组，但在适应阶段或TMT存在时无此差异（图2D）。最后，所有快感反应指标（在气味区停留时间、进入气味区次数及偏好指数）均显示对照组与UCMS雌性小鼠之间存在显著差异或统计学趋势（图2E–G）。这一效应也体现在整体气味探索指数上，该指数是快感反应与运动反应的综合测量指标（图2H）。一致地，所有检测指标均表明，UCMS小鼠对趋近性和厌恶性嗅觉刺激均表现出负性快感偏倚。有趣的是，情绪性评分（基于一系列行为学测试结果计算得出的焦虑样和抑郁样表型的标准化数值）14与MU和TMT的气味探索指数呈正相关（图2I），表明对正性和负性气味刺激的行为反应与焦虑样及抑郁样表型之间存在关联。

其次，我们此次采用相同的UCMS方案在雄性小鼠中诱导出类似抑郁的表型。在嗅觉偏好测试中，这些小鼠被暴露于雌性小鼠尿液（FU，纯品）——一种具有吸引力的气味，以及如前所述的TMT作为负面气味（图3A，B）。在适应阶段，各组小鼠在四个区域停留的时间以及测试过程中的移动距离均无显著差异（图3C，D）。然而，与对照组相比，UCMS小鼠在气味区域的停留时间显著减少，对FU和TMT的探索均明显降低（图3E）。此外，UCMS小鼠进入气味区域的次数显著减少或呈减少趋势，并且对FU和TMT的偏好指数均显著降低（图3F，G），证实了在类似抑郁状态下存在负面嗅觉偏向。同样，气味探索指数显示，与对照组相比，UCMS小鼠对FU和TMT的行为反应呈负向偏移（图3H），且该指数倾向于与动物的情绪性评分呈正相关（图3I）。

在第三项实验中，我们采用了另一种抑郁模型，该模型依赖于在雄性C57BL/6NTac小鼠的饮用水中长期给予皮质酮（CORT），而对照组小鼠仅接受溶剂（Veh）溶液（10% 2-羟丙基-β-环糊精）27。经过四周的CORT或Veh处理后，小鼠进行为期四天的适应，随后暴露于一种中性气味（OCT：2-反式-辛烯醛，1% 水溶液）、一种正性气味（PO：花生油）和一种负性气味（TMT：2,4,5-三甲基噻唑，5% 矿物油溶液）（图4A，B）。在适应阶段，Veh组与CORT组之间无显著差异（图4C）。然而，两组小鼠在“气味区”停留的时间均显著长于“对照区”。在移动距离方面无显著差异，仅在正性气味（PO）条件下，Veh组小鼠的移动距离显著大于CORT组（图4D）。重要的是，与UCMS小鼠类似，当暴露于中性及趋近性气味时，CORT小鼠在气味区停留的时间显著减少（图4E）。气味探索的减少还体现在进入气味区的次数显著减少或呈现下降趋势（图4F）。在此情况下，组间差异取决于所分析的检测指标，这可能与所用动物数量的限制以及TMT暴露后观察到的探索时间较低所导致的潜在下限效应有关。总体而言，与Veh组相比，CORT小鼠对所有气味刺激的偏好指数均显著降低（图4H）。最后，所有气味的气味探索指数与动物的情绪性评分呈显著相关性（图4I），再次证明该嗅觉偏好测试是评估多种抑郁小鼠模型中负性情绪偏倚的合适工具。

最后，我们可以排除观察到的差异可能是由运动活动减少引起的可能性，而非情绪偏向所致。事实上，在适应阶段评估总移动距离时，各组之间的运动活动并无差异（图 2D、图 3D、图 4D）。此外，根据统计分析，任务参与度的普遍降低或新奇效应也无法解释这些偏向。实际上，在偏好指数分析中，我们发现了气味因素的显著效应，而实验组与气味之间无显著交互作用。这些结果表明，具有抑郁样表型的小鼠确实能够执行该任务，且其探索行为的减少是针对特定嗅觉线索的。

适应性实验示意图：小鼠在不同时间对各种气味区域偏好的测试。
图1：嗅觉偏好测试的时间线与实验设置总览示意图。首先使小鼠适应实验环境。在适应的第一天，将来自同一饲养笼的小鼠共同放入实验区域，以减少新奇恐惧。第二天，将小鼠单独放入实验区域。适应结束后，在其中一个区域加入一种气味。优先依次测试中性气味、正向气味，最后测试负向气味。用于分析时，可将实验区域划分为四个不同区域。图示使用Biorender制作。请点击此处查看此图的放大版本。

嗅觉偏好测试实验；图表显示小鼠的时间、距离和行为指标。
图2：抑郁症UCMS雌性小鼠模型中的负性嗅觉偏倚。（A,B）研究的时间线和实验分组：对照组和UCMS（不可预测的慢性轻度应激）雌性小鼠在嗅觉偏好测试中接受正性气味（MU：雄性小鼠尿液，纯品）和负性气味（TMT：2,4,5-三甲基噻唑，矿物油中5%）的检测。图示由Biorender生成。（C）在适应阶段，与对照组相比，UCMS小鼠在“对照区域”停留的时间显著更长，在“气味后方区域”停留的时间显著更短（组间：F(1, 12) = 74.03，p < 0.0001；区域：F(2.434, 29.21) = 7.688，p = 0.0012；交互作用：F(3, 36) = 5.148，p = 0.0046）。（D）暴露于MU时，UCMS小鼠的总移动距离显著减少，但在适应（Hab）和TMT条件下无此差异（组间：F(1, 12) = 4.664，p = 0.0518；气味：F(1.871, 22.45) = 4.846，p = 0.0195；交互作用：F(2, 24) = 4.797，p = 0.0177）。（E）UCMS小鼠探索MU和TMT的时间显著减少（组间：F(1, 12) = 24.39，p = 0.0003；气味：F(1, 12) = 59.69，p < 0.0001；交互作用：F(1, 12) = 2.267，p = 0.1580）。（F）UCMS小鼠进入气味区域的次数少于对照组或呈减少趋势（组间：F(1, 12) = 9.279，p = 0.0102；气味：F(1, 12) = 5.100，p = 0.0433；交互作用：F(1, 12) = 1.649，p = 0.2233）。（G）UCMS小鼠对MU和TMT的偏好指数显著降低（组间：F(1, 12) = 24.39，p = 0.0003；气味：F(1, 12) = 59.69，p < 0.0001；交互作用：F(1, 12) = 2.267，p = 0.1580）。（H）UCMS小鼠对MU和TMT的气味探索指数显著降低（F(1, 12) = 14.71，p = 0.0024；气味：F(1, 12) = 0，p > 0.9999；交互作用：F(1, 12) = 0.02630，p = 0.8739）。（I）MU和TMT的气味探索指数均与动物的情绪性评分呈正相关（MU：Pearson R2 = 0.4837，F(1,12) = 11.24，**p = 0.0058；TMT：Pearson R2 = 0.5340，F(1,12) = 13.75，**p = 0.0030）。请点击此处查看该图的放大版本。

嗅觉偏好测试示意图、行为数据图表、C57BL/6JRj小鼠研究结果。
图3：抑郁症UCMS雄性小鼠模型中的负性嗅觉偏好。 (A,B) 研究的时间线和实验分组：对照组和UCMS雄性小鼠在嗅觉偏好测试中接受正性气味（FU：雌性小鼠尿液，原液）和负性气味（TMT：2,4,5-三甲基噻唑，矿物油中5%）的检测。图示使用Biorender制作。(C) 在适应阶段，对照组与UCMS小鼠在实验区域不同区域停留的平均时间无显著差异（组间：F(1, 13) = 3.921, p = 0.0693；区域：F(1.688, 21.94) = 34.57, p < 0.0001；交互作用：F(3, 39) = 0.7385, p = 0.5355）。(D) 对照组与UCMS小鼠在总移动距离上无显著差异（组间：F(1, 13) = 2.313, p = 0.1522；气味：F(1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998；交互作用：F(2, 26) = 0.8806, p = 0.4266）。(E) UCMS小鼠探索FU和TMT气味区域的时间显著减少（组间：F(1, 13) = 6.808, p = 0.0216；气味：F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014；交互作用：F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753）。(F) UCMS小鼠进入TMT气味区域的次数显著减少，对FU气味区域的进入次数也呈减少趋势（组间：F(1, 13) = 6.572, p = 0.0236；气味：F(1, 13) = 3.784, p = 0.0737；交互作用：F(1, 13) = 0.2145, p = 0.6509）。(G) UCMS小鼠对FU和TMT的偏好指数均显著降低（组间：F(1,13 ) = 6.808, p = 0.0216；气味：F(1, 13) = 16.21, p = 0.0014；交互作用：F(1, 13) = 0.3304, p = 0.5753）；(H) UCMS小鼠对两种气味的嗅觉探索指数均显著降低（组间：F(1, 13) = 12.42, p = 0.0037；气味：F(1, 13) = 0.002580, p = 0.9603；交互作用：F(1, 13) = 0.5804, p = 0.4598）。(I) UCMS小鼠对FU和TMT的嗅觉探索指数与动物的情绪性评分呈正相关趋势（FU：Pearson R2 = 0.2573, F(1, 13) = 4.504, p = 0.0536；TMT：Pearson R2 = 0.2266, F(1, 13) = 3.809, p = 0.0729）。请点击此处查看该图的放大版本。

嗅觉偏好测试结果；时间和距离指标的图表；小鼠行为分析。
图4：抑郁CORT雄性小鼠模型中的负性嗅觉偏倚。 （A,B）研究的时间线和实验分组：Veh和CORT雄性小鼠在嗅觉偏好测试中分别暴露于中性气味（OCT：反式-2-辛烯醛，1% 水溶液）、正性气味（PO：花生油，纯品）和负性气味（TMT：2,4,5-三甲基噻唑，5% 矿物油溶液）。在整个实验期间，Veh和CORT小鼠分别接受溶剂（Vehicle）和溶剂+皮质酮（Corticosterone）溶液处理。图示使用Biorender制作。（C）适应期期间，小鼠在实验箱不同区域停留的平均时间（组间效应：F(1, 10) = 0.07588，p = 0.7886；区域效应：F(2.224, 22.24) = 6.939，p = 0.0036；交互效应：F(3, 30) = 0.7033，p = 0.5575）。（D）适应期（Hab）及不同气味测试期间的总移动距离（组间效应：F(1, 10) = 4.193，p = 0.0678；气味效应：F(3, 30) = 11.80，p < 0.0001；交互效应：F(3, 30) = 1.489，p = 0.2375）。（E）与Veh组相比，CORT小鼠在OCT和PO气味区域停留的时间更短（组间效应：F(1, 10) = 5.094，p = 0.0476；气味效应：F(2, 20) = 28.87，p < 0.0001；交互效应：F(2, 20) = 3.841，p = 0.0388）。（F）与Veh组相比，CORT小鼠进入气味区域的次数更少或呈减少趋势（组间效应：F(1, 10) = 6.832，p = 0.0259；气味效应：F(2, 20) = 2.738，p = 0.0889；交互效应：F(2, 20) = 0.2902，p = 0.7512）。（G）CORT小鼠对OCT和PO的偏好指数更低（组间效应：F(1, 10) = 5.895，p = 0.0356；气味效应：F(2, 20) = 20.83，p < 0.0001；交互效应：F(2, 20) = 1.437，p = 0.2611）。（H）UCMS小鼠在所有气味下的气味探索指数均显著降低（组间效应：F(1, 10) = 12.35，p = 0.0056；气味效应：F(2, 20) = 0.04381，p = 0.9572；交互效应：F(2, 20) = 0.3622，p = 0.7006）。（I）每种气味的探索指数与动物的情绪性评分呈正相关（OCT：Pearson R2 = 0.5601，F(1, 10) = 12.73，**p = 0.0051；PO：Pearson R2 = 0.4495，F(1, 10) = 8.165，*p = 0.0170；TMT：Pearson R2 = 0.5061，F(1, 10) = 10.25，**p = 0.0095）。请点击此处查看该图的放大版本。

名称缩写稀释度电荷性质
2,4,5-三甲基噻唑TMT5% 矿物油溶液负性
2-反式-辛烯醛OCT1% 水溶液中性
雌性小鼠尿液FU原液正性
雄性小鼠尿液MU原液正性
花生油PO原液正性

表1：具有中性、正性和负性效价的气味示例。

补充文件 1：为期 4 周的不可预测慢性轻度应激方案。 请点击此处下载该文件。

讨论

负性情绪偏倚是抑郁症的主要特征之一，对于深入理解该疾病的病理生理机制具有重要意义。因此，在临床前模型中纳入对感觉偏倚的评估至关重要，这不仅有助于更全面地表征类抑郁表型，还能进一步探究情绪加工及其在病理状态下发生改变所涉及的生物学机制。此外，嗅觉是研究情绪偏倚的理想感官。从转化医学的角度来看，在小鼠和人类中评估情绪加工均具有生态学相关性。同时，嗅觉系统与情绪系统在进化过程中高度交织，并共享许多共同的神经结构。嗅觉功能受损与抑郁症之间存在强烈的双向关系10，这使得嗅觉成为用于疾病诊断、治疗反应评估以及基础研究中极具前景且强有力的工具。

本文建立了一种嗅觉偏好测试方案，用于评估两种抑郁症小鼠模型中的嗅觉情绪偏向。重要的是，该方法能够评估动物对多种不同效价刺激（包括正性、负性以及在病理条件下价值可能发生变化的中性刺激）的反应。这些中性刺激并非测试有效性的必要条件，但可为实验提供有价值的附加信息。此外，通过使用不同浓度的气味，该测试还可评估反应的可扩展性。在抑郁症研究背景下，评估对不同享乐价值刺激的反应，并区分正性和负性情绪加工过程，具有重要意义。事实上，临床前研究结果表明，抗抑郁治疗可能无法均等地恢复正性和负性嗅觉加工功能14。动物对先天具有显著吸引力或厌恶性的嗅觉刺激进行自发探索，也有助于避免抑郁样状态相关的认知或动机缺陷所带来的混杂因素30,31。因此，本方案无需长时间的学习阶段，具有技术上的优势。需要指出的是，本研究中使用的两种模型均基于成年期进行的干预措施，未来还需进一步实验验证该方案是否同样适用于评估其他抑郁症风险因素（如早期生活逆境）。

重要的是，本方案适用于男性和女性个体，这一点至关重要，因为女性患抑郁症的概率是男性的两倍。然而，由于社会期望、羞耻感或病耻感，男性抑郁症可能被低估，正如Shi等人32综述所述。尽管如此，抑郁症在症状学（临床表现）、病因学（生物学原因）以及治疗反应预测性方面33,34,35，男女之间似乎存在差异，但目前许多抑郁症模型和检测方法仍主要针对雄性个体设计。例如，标准的雌性尿液嗅闻实验24采用类似方案，但依赖于一种独特的社会性气味线索。尽管该方法信息丰富，但其探索时间较短（对照组为30秒），且主要适用于雄性小鼠，因为雌性尿液对两性并不具有相同的生态学和享乐意义。最后，研究表明嗅觉享乐反应对抗抑郁治疗敏感14，这使得我们的实验成为可靠表征类抑郁状态的首选工具，可替代其他存在争议的检测方法，如强迫游泳实验36,37,38。

重要的是，与先前描述的测试相比，该测试的结果显示出更长的刺激探索时间（100–200 秒）21,22,23。当该测试与神经元活动的实时监测技术（例如）结合使用时，延长的探索时间尤为重要。此外，该测试无需食物或饮水剥夺，从而避免了代谢相关的混杂因素。最后，该测试可在光照期进行，减少了实验限制（如倒置光周期、红外记录）。

然而，要成功实施本方案，某些技术步骤至关重要。首先，实验必须在高度可控且无应激的环境中进行：光照应均匀且不宜过亮，实验室内不得有干扰性的声音或气味。小鼠每天可在实验区域内测试一次，且测试时间应尽量固定在每天的同一时段。此外，建议由同一名实验人员完成这些实验操作，以减少动物的应激反应。

其次，必须确保小鼠在适应期充分探索实验区域。如果在适应期间，小鼠在任一放置培养皿区域的平均停留时间少于50秒，则可在正式测试气味前增加一到两天的额外适应时间。如果小鼠仍然未能充分探索实验区域，则应将其从分析中剔除。如果在适应期间，不同实验组对"气味区域"的初始探索存在不对称情况，可对偏好指数的计算方法进行调整，以校正各组间自发偏好差异带来的偏差，例如根据各组在适应期间的停留时间进行归一化处理，或基于个体自身在适应期间的探索情况进行归一化。事实上，另一个可能的问题是实验组间存在较高的变异性。若出现此类问题，为降低个体内的变异性，可连续两天使用相同气味对小鼠进行测试，并将两天的结果取平均值。重要的是，连续测试嗅觉反应不应显著影响其探索行为14。

关于气味准备，溶液的配制必须在与测试区域不同的房间进行，实验人员应注意避免溶液在行为学实验室内过度扩散。此外，溶液最好在测试前短时间内配制，并储存于无气味的玻璃小瓶中，以防止气味挥发或受到污染。对于某些具有较强吸引力的气味（如雄性和雌性小鼠尿液），如果对照组小鼠未表现出与高度正性效价相关的探索行为，则应检查溶液质量。特别是小鼠尿液，必须在测试前不久（最多提前2-3天）从年轻小鼠（不超过5月龄）新鲜采集，并在4 °C下保存，以维持其嗅觉特性。值得注意的是，为避免雌性小鼠动情周期不同阶段带来的影响，应连续多天收集尿液样本。如有必要，尿液可于-20 °C长期保存，但此方法不推荐，因其会明显降低气味强度。同样，花生油的感知愉悦度也可能因批次或品牌不同而存在差异。重要的是，可在两个分区中分别加入两种不同的气味或不同浓度的同种气味，替代非气味刺激的"对照区"，以测量动物对两种气味溶液的偏好性。

最后，嗅觉偏好测试可通过多种方式进行改进，以优化其设计并拓展潜在应用范围。事实上，除了运动行为的读数外，还可结合不同技术来测量情绪的多个组分，从而提升通过该测试对情绪反应的评估效果6。例如，可在实验区域旁放置超声麦克风，记录超声发声，这些声音可能在对某些正性或负性刺激产生反应时发出24,39。此外，可使用红外相机或可植入式实时遥测发射器监测体温40,41,42。部分此类发射器甚至能够获取心率和呼吸频率数据43,44,45。结合使用这些工具将有助于构建更为精细的行为学评估体系，以全面反映情绪反应。嗅觉偏好测试还可便捷地与其他技术联用，进一步阐明情绪调节障碍背后的神经机制，例如光遗传学、光纤光度法、微型显微镜活体成像或在体电生理记录技术。最后，该方案可轻松转化至临床应用，通过将感觉偏好及愉悦性嗅觉反应的评估整合到人类研究中，甚至可作为诊断工具或治疗反应性的评估手段。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche, ANR）管理的“未来投资计划”资助，项目编号为 ANR-11-IDEX-0004-02 和 ANR-10-LABX-73， 法国国家科研署（ANR-AAPG2021 "EMOKET"），以及人寿保险公司"AG2R-La Mondiale"， 同时获得博士研究生院 158（ED3C：索邦大学、巴黎大学、巴黎科学与文学大学）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4,5-三甲基噻唑Sigma-AldrichW332518-100G-K
2-反式-辛烯醛Sigma-Aldrich52464-1ML
蓝丁胶UHUN/A
滤纸Fisher Scientific1171012542.5 mm
玻璃小瓶DUTSCHER DOMINIQUE958983
矿物油Sigma-AldrichM5904-500ML
Noldus EthovisionNoldus EthovisionVersion 17.5也可使用开源 ICY 软件中的 Single Mouse Tracker 或 Deeplabcut
培养皿Falcon35100760 mm × 15 mm 培养皿，带有 7 个直径为 5 mm 的定制孔
有机玻璃实验箱Custom made N/A45 cm × 50 cm × 25 cm 的有机玻璃实验箱，中间由一块 37 cm × 25 cm 的隔板分为两个腔室

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一种用于测量抑郁小鼠模型中嗅觉享乐偏好的嗅觉偏好测试
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