本文介绍一种简单、实用且可靠的直接球形共培养人肺上皮细胞与成纤维细胞的实验方案，该方法无需依赖基质。
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本文介绍一种简单、实用且可靠的直接球形共培养人肺上皮细胞与成纤维细胞的实验方案，该方法无需依赖基质。
三维（3D）培养系统因其能够重现细胞的天然特性和结构，从而在体外模拟类似组织的结构而日益受到关注。in vitro。在这些模型中，将球形细胞聚集体（即所谓的类球体）嵌入半固体细胞外基质（ECM）中的培养方法代表了一种先进的接近in vivo的细胞培养模型，因为它能够通过细胞-细胞和细胞-ECM相互作用以及氧气和营养物质梯度，实现多种功能性细胞状态。由于类球体在技术上要求较低且获取成本相对低廉，因此常被用于药物筛选和毒性测试，可在临床前阶段实现高内涵筛选以评估新药。为此，通常会重建多种肿瘤的三维结构。与此同时，Matrigel 目前是最广泛使用的 ECM 之一，被视为类球体和类器官培养的金标准，但该基质基于小鼠实验，其提取过程——与动物实验整体一样——存在重大的伦理问题。本文介绍一种无需基质的方案，用于直接共培养人支气管上皮细胞与成纤维细胞，形成类球体，该方法可被视为一种优化的共培养技术，尤其适用于研究上皮细胞与成纤维细胞在相应类球体内的通讯与相互作用，且不依赖于（动物来源的）载体基质。通过建立这种悬浮生长的上皮-成纤维样类球体共培养体系作为面向患者的in vitro平台，用于模拟癌症治疗手段对正常（肺）组织的毒性，不仅可减少实验动物的使用数量，还可实现对相应动物实验的有效且有意义的替代。
二维（2D）细胞培养是一种将扁平单层细胞进行培养、扩增后接种用于基于细胞的研究检测的方法，因其操作简便、成本低廉且易于实施，仍是标准临床前筛选流程中广泛使用的技术1,2研究不同类型细胞之间的相互作用（旁分泌）信号交流 体外一种细胞类型的条件培养基可用于刺激另一种细胞类型。此外，多种共培养方法相继出现，例如间接共培养法，即通过微孔膜在物理上分离共培养的细胞。这类“Transwell系统”包含一个插入式微孔膜，可置于传统的二维细胞培养板中。一种细胞类型接种并生长在膜上，与相邻小室中生长的另一类细胞共享培养基，从而实现双向旁分泌通信2两种细胞类型甚至可以接种于膜的两侧，形成更直接的细胞间接触共培养体系，适用于屏障结构组织的研究。3,4.
然而，这些即使是较为先进的二维细胞培养系统的细胞反应，也并不总能反映相应动物实验甚至临床研究的结果，其原因包括不同细胞类型之间缺乏直接的信号交流，从而导致缺乏 体内类细胞结构。因此，三维（3D）培养系统因其能够模拟组织样结构并维持类似天然的细胞特性和架构而日益受到青睐 体外5
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所有步骤均在无菌条件下（生物安全柜内）进行。本研究中所用培养基的组成详见表1。
1. 实验材料的准备
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该简单方案可实现人支气管上皮细胞与成纤维细胞在超低吸附培养板上的无基质球形共培养（图1A）。在培养过程中，最初形成的球体逐渐发育为更复杂的肺类球体结构，形态学分析（通过活细胞成像（图1B）、免疫组织化学（图1C）和免疫荧光（图1D））显示，不同上皮和成纤维结构高效形成，体现了细胞间的直接相互作用。为区分共培养中的上皮细胞，使用了荧光标记的人HS5成纤维细胞，该细胞通过携带表达Turquoise2（青色）荧光蛋白基因的（“空”）慢病毒SIN载体进行转导16。在主要球体结构中，成纤维细胞嵌入上皮细胞内部（图1B-D），同时成纤维细胞还以附属小球体的形式持续增殖。细胞活力检测（图1E
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已提出三维细胞培养模型用于弥合二维培养与体内研究之间的差距，因为此类（共）培养体系能够更好地模拟体内存在的生理、形态及病理特性，其原因在于具备更接近体内状态的细胞间相互作用、细胞-细胞外基质（ECM）相互作用、对刺激的响应、基因表达、蛋白表达以及分化特征17,18。除了数量众多且有时结构极为复杂的肿瘤类球体外10,15,19,20，这些类球体也正越来越多地被用于正常组织的检测研究11,21,22。特别是多细胞类球体模型，即人支气管.......
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作者声明不存在个人或机构利益冲突。
感谢Mohammed Benchellal、Eva Gau、Sabine Senkel和Olga Kruse提供的出色技术协助。本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）（LuOrgNTT：16LW0293，资助D.K.；SeniRad：02NUK086C，资助V.J.、D.K.）以及德国研究基金会（DFG）研究培训组2762资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 无菌血清移液管 | ThermoFischer | 170356N | Nunc 无菌血清移液管或同等产品 |
| 15 mL 锥形管 | Corning | 430052 | 或同等产品 |
| 37 °C / 5% CO2 湿化培养箱 | |||
| 5 mL 无菌血清移液管 | ThermoFischer | 170355N | Nunc 无菌血清移液管或同等产品 |
| 50 mL 锥形管 | Corning | CLS430829 | 或同等产品 |
| ATRA（全反式维甲酸） | StemCell Technologies | Cat#72262 | 50 nM |
| B-27 添加剂（50 倍浓缩液） | ThermoFischer/Gibco | Cat#17504044 | 1 倍工作浓度 |
| BD Rhapsody WTA 扩增试剂盒 | BD Bioscience | Cat#633801 | 按照制造商说明书使用 |
| 生物安全柜 | |||
| 牛血清白蛋白 | Roche | Cat#BSAVHS-RO | 0.4% (v/v) |
| 细胞筛 | Corning | 352350 | Falcon 70 µm 细胞筛，白色，无菌，独立包装 |
| 离心机 | Eppendorf | https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001 | 例如，Eppendorf Centrifuge 5804 — 台式离心机 |
| DMEM/F12 | Invitrogen | Cat#11330-032 | 500 mL |
| DNase I，无 RNase（1 U/μL） | ThermoFischer | Cat#EN0521 | 100 U/mL |
| EDTA（0.5 M），pH 8.0，无 RNase | ThermoFischer | AM9260G | 2 mM |
| Eppendorf Research plus 12 通道多通道移液器 | Eppendorf | 例如，#3125000044（10–100 µL）或 #3125000060（30–300 µL） | |
| 胎牛血清 | ThermoFischer/Gibco | Cat#A5256701 | 10% (v/v) |
| HBEC3-KT | ATCC | CRL-4051 | 人正常肺上皮细胞系 |
| 肝素溶液（0.2%） | StemCell Technologies | Cat#7980 | 0.8 mL |
| Hoechst 33342 | ThermoFischer | Cat#H1399 | 1 µg/mL |
| HS-5 | ATCC | CRL-3611 | 人基质成纤维细胞 |
| 人重组 FGF-10（KGF-2）ACF | StemCell Technologies | Cat#78173.1 | 10 ng/mL |
| 人重组 FGF-7（KGF）ACF | StemCell Technologies | Cat#78186.1 | 10 ng/mL |
| 人单细胞多重检测试剂盒 | BD Bioscience | Cat#633781 | 按照制造商说明书使用 |
| 氢化可的松储备液 | StemCell Technologies | Cat#7926 | 每 500 mL 加 0.5 mL |
| Laduviglusib（CHIR-99021） | Biozol/Selleckchem | Cat#S1263 | 3 µM |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | Cat#A92902 | 50 µg/mL |
| 显微镜 | ZEISS | ||
| 单硫代甘油 | Sigma-Aldrich | Cat#M6145 | 0.4 µM |
| N-2 添加剂（100 倍浓缩液） | ThermoFischer/Gibco | Cat#17502048 | 1 倍工作浓度 |
| Neubauer 计数板 | Merck | BR718605 | 例如，BRAND 计数板 BLAUBRAND Neubauer 型 |
| 正常山羊血清 | ThermoFischer | Cat#31873 | 在 PBS 中稀释至 2% (v/v) |
| NP-40 | Merck/Millipore | Cat#492016 | NP-40 替代物，1% |
| PAS 染色试剂盒 | Sigma Aldrich | Cat#1016460001 | 按照制造商说明书使用 |
| PBS | ThermoFischer | Cat#10010023 | 1 倍工作浓度 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100 倍浓缩液 | ThermoFischer/Gibco | Cat#15140122 | 1 倍工作浓度 |
| PFA | ThermoFischer | Cat#J61899.AK | 多聚甲醛，PBS 中 4% |
| PneumaCult 气道类器官分化培养基（ODM） | StemCell Technologies | Cat#05060 | PneumaCult 气道类器官基础培养基（#05061，360 mL）和 PneumaCult 气道类器官分化添加剂*（#05063，40 mL） |
| PneumaCult Ex Plus 培养基 | StemCell Technologies | Cat#5040 | 试剂盒包含 PneumaCult-Ex Plus 基础培养基（#05041，490 mL）和 PneumaCult-Ex Plus 50 倍浓缩添加剂*（#05042，10 mL） |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck/Roche | Cat#4693132001 | 每 10 mL 加 1 片 |
| Rhapsody cDNA 试剂盒 | BD Bioscience | Cat#633773 | 按照制造商说明书使用 |
| RPMI 1640 培养基 | ThermoFischer/Gibco | Cat#11875093 | 500 mL |
| 氯化钠 | Merck/Sigma-Aldrich | S9625 | 150 mmol/L |
| 柠檬酸钠 | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#1613859-1G | 0.10% |
| 脱氧胆酸钠 | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#30970 | 0.50% |
| 十二烷基硫酸钠 | Merck/Sigma-Aldrich | Cat#11667289001 | 0.10% |
| 多通道移液器用无菌试剂储液槽（例如 60 mL） | ThermoFischer | 9510037 | 或同等产品 |
| TC-96 孔板 BIOFLOAT，每板 4 个支架ück | Sarstedt（或 facellitate） | 83.3925.400（或 F202003） | 超低吸附板 |
| Tris/HCl | ThermoFischer | Cat#AM9855G | 50 mmol/L，pH 8 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat#X100-5ML | 0.05 % |
| 台盼蓝染液（0.4%） | ThermoFischer | Cat#15250061 | 与 NGM 按 1:5（v/v）混合 |
| TrypLE | ThermoFischer | Cat#12604013 | 1 倍工作浓度 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5 %） | ThermoFischer | Cat#15400054 | 将 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（TE）溶液用磷酸盐缓冲液（不含钙和镁）无菌稀释至 1 倍工作浓度 |
| WST-1 试剂 | CELLPRO-RO, Roche | Cat#5015944001 | 细胞增殖检测试剂 |
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