生成游离型正常人上皮细胞-成纤维细胞球体共培养物

摘要

本文介绍一种简单、实用且可靠的直接球形共培养人肺上皮细胞与成纤维细胞的实验方案，该方法无需依赖基质。

摘要

三维（3D）培养系统因其能够重现细胞的天然特性和结构，从而在体外模拟类似组织的结构而日益受到关注。in vitro。在这些模型中，将球形细胞聚集体（即所谓的类球体）嵌入半固体细胞外基质（ECM）中的培养方法代表了一种先进的接近in vivo的细胞培养模型，因为它能够通过细胞-细胞和细胞-ECM相互作用以及氧气和营养物质梯度，实现多种功能性细胞状态。由于类球体在技术上要求较低且获取成本相对低廉，因此常被用于药物筛选和毒性测试，可在临床前阶段实现高内涵筛选以评估新药。为此，通常会重建多种肿瘤的三维结构。与此同时，Matrigel 目前是最广泛使用的 ECM 之一，被视为类球体和类器官培养的金标准，但该基质基于小鼠实验，其提取过程——与动物实验整体一样——存在重大的伦理问题。本文介绍一种无需基质的方案，用于直接共培养人支气管上皮细胞与成纤维细胞，形成类球体，该方法可被视为一种优化的共培养技术，尤其适用于研究上皮细胞与成纤维细胞在相应类球体内的通讯与相互作用，且不依赖于（动物来源的）载体基质。通过建立这种悬浮生长的上皮-成纤维样类球体共培养体系作为面向患者的in vitro平台，用于模拟癌症治疗手段对正常（肺）组织的毒性，不仅可减少实验动物的使用数量，还可实现对相应动物实验的有效且有意义的替代。

引言

二维（2D）细胞培养是一种将扁平单层细胞进行培养、扩增后接种用于基于细胞的研究检测的方法，因其操作简便、成本低廉且易于实施，仍是标准临床前筛选流程中广泛使用的技术^1,2研究不同类型细胞之间的相互作用（旁分泌）信号交流 体外一种细胞类型的条件培养基可用于刺激另一种细胞类型。此外，多种共培养方法相继出现，例如间接共培养法，即通过微孔膜在物理上分离共培养的细胞。这类“Transwell系统”包含一个插入式微孔膜，可置于传统的二维细胞培养板中。一种细胞类型接种并生长在膜上，与相邻小室中生长的另一类细胞共享培养基，从而实现双向旁分泌通信²两种细胞类型甚至可以接种于膜的两侧，形成更直接的细胞间接触共培养体系，适用于屏障结构组织的研究。^3,4.

然而，这些即使是较为先进的二维细胞培养系统的细胞反应，也并不总能反映相应动物实验甚至临床研究的结果，其原因包括不同细胞类型之间缺乏直接的信号交流，从而导致缺乏 体内类细胞结构。因此，三维（3D）培养系统因其能够模拟组织样结构并维持类似天然的细胞特性和架构而日益受到青睐 体外^5,6在这些模型中，将球形细胞聚集体（称为球体）培养于半固体细胞外基质中，可提供一种更为先进的细胞共培养模型，用于研究细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）相互作用后所形成的多种功能性细胞状态。 可实现氧气和营养物质的相互作用及其梯度变化⁷. 这些期望更复杂的 体内-像 体外 3D 培养应能够有效、快速、稳定且便捷地生成并维持细胞聚集体大小均一的培养体系，同时促进细胞的生长与分化^7,8.

利用细胞自身聚集和黏附的自然特性，通常采用悬滴法生成球状体（主要是肿瘤球状体）^9,10。作为最早用于生成胚胎体的技术之一，悬滴法基于重力和表面张力的原理，在使用Matrigel进行细胞外基质（ECM）包埋前，已成为广泛使用的方法，可生成大量均一的球状体；Matrigel虽源自小鼠，但被公认为细胞外基质的“金标准”。研究人员已投入大量努力开发无支架方法以生成球状体^8,11。例如，可通过使用带有搅拌装置的细胞培养瓶生成球状体，从而防止细胞贴壁，这是大规模制备球状体的最简单方法¹²。

在建立具有生理学价值的系统时，细胞培养过程中最困难的问题在于 体内-样 体外 在实验室中，现有的替代方法通常是包含多个不同步骤的复杂方案（这些步骤仍需建立）。例如，首先使用某种方法生成细胞结构，然后收获这些结构，再将其嵌入基质中，尤其是使用难以操作的基质时，这些关键步骤在方法能够被常规和批量应用之前，仍需更具说服力的验证。本文中，我们采用96孔超低吸附培养板，该培养板几乎完全阻止细胞在培养器皿表面的贴壁，从而可建立肺上皮细胞与成纤维细胞的复杂三维球体结构。所形成的球体在24小时内即可高度均一且快速地形成，显著缩短了实验周期。整个培养过程中，细胞的长期培养、稳定生长与分化均在同一孔中完成，因此在初始接种后，整个培养期间仅需定期更换培养基。基于此，我们提出了一种极为简单、快速且高度实用的方案，用于生成在形态学和功能上接近生理状态的人肺球体模型。另一优势在于，该方案可轻松拓展应用于其他类型细胞。

方案

所有步骤均在无菌条件下（生物安全柜内）进行。本研究中所用培养基的组成详见表1。

1. 实验材料的准备

1. 在标准细胞培养塑料培养皿（T75 培养瓶）中，使用普通上皮细胞生长培养基和标准培养箱培养并扩增人正常肺上皮细胞（HBEC3-KT）¹³ （参见 表1).
   注意：为促进更好的生长，可在培养基中额外添加10%胎牛血清（FCS）。
2. 在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的RPMI培养基中培养人成纤维细胞（HS-5）^10,14 （参见 表1).
3. 通过在DMEM/F12培养基中添加N-2、B27、青霉素-链霉素、牛血清白蛋白、巯基甘油、抗坏血酸、KGF/FGF7、FGF10、ATRA和CHIR99021，配制支气管肺类器官培养基（BLO-培养基）。（参见 表1 和 材料表).
   注意：建议新鲜配制培养基，至少在使用前添加KGF/FGF7、FGF10、ATRA和CHIR99021。若短期内需要较多培养基，仅建议在4 °C下短期保存数天（最长1周）。 alternatively，可使用 commercially available PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium。

2. 上皮细胞和成纤维细胞的制备

注意：当两种细胞的融合度均达到约 80% 时进行使用。每种细胞类型需单独准备。

1. 移除并弃去培养基。
2. 用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）快速冲洗细胞层，洗涤细胞。
3. 加入 2 mL 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 消化上皮细胞，并在 37 °C 短暂孵育 4–8 分钟。
4. 使用 5 mL 血清移液管，加入含 10% 胎牛血清（FCS）的正常生长培养基或 PBS，收集已变圆且几乎脱落的细胞。
5. 在 T75 培养瓶中，沿生长表面将适当体积的液体上下吹打数次，以进一步分散细胞团块，并将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
6. 分别采用 TE 胰蛋白酶消化法，在 37 °C 条件下孵育 3–5 分钟，收获 HS5 成纤维细胞。
7. 通过离心（例如，室温下 300–400 × g 离心 5 分钟）将每种细胞沉淀（从而去除胰蛋白酶），并在计数前用 1–2 mL 正常上皮细胞生长培养基重悬（包括上皮细胞和成纤维细胞）。
8. 取适量重悬的细胞悬液，用 0.4% 台盼蓝染液按 1:5 比例稀释，在显微镜下使用血球计数板（Neubauer 计数室）测定活细胞数量。

3. 上皮-成纤维细胞三维球体培养物的生成

1. 将所需数量的细胞稀释于 使用15 mL离心管，以正常上皮细胞生长培养基重悬细胞。每孔96孔板中加入100 µL培养基，其中含2000个上皮细胞和50个成纤维细胞。配制总量为10 mL的正常上皮细胞生长培养基，其中包含200,000个HBEC细胞和5,000个HS5成纤维细胞，足以用于一整块96孔板。
2. 使用10 mL无菌血清移液管轻轻混匀。
3. 将细胞悬液转移至多通道移液器用的无菌试剂储槽中。
4. 使用多通道移液器（12通道）将100 µL细胞悬液转移至超低吸附培养板的每个孔中，进行细胞接种。
5. 在37 °C和5% CO₂的标准细胞培养条件下孵育₂ 在湿润的环境中。
   注意：类球体的形成通过倒置显微镜定期进行显微观察，并在每个期望的时间点对类球体进行拍照以评估。
6. 4天后，向每个含有生成的球状体的孔中加入100 µL BLO培养基。
7. 在37 °C和5% CO₂的标准细胞培养条件下继续孵育₂ 在湿润的环境中。

4. 进行常规换液

1. 培养7-8天后，进行常规换液。将培养板倾斜一定角度，使类球体在重力作用下向倾斜方向沉降。
2. 使用100-200 µL移液器吸头小心并尽可能彻底地吸除上清液。
3. 将培养板重新水平放置，并向每孔加入100-150 µL BLO培养基（可使用多通道移液器）。
4. 在37 °C、5% CO₂的湿润环境中继续培养，或开始实验/处理。
   注意：类球体可培养更长时间（最长至21天），在此期间必须每周至少进行两次完全换液。

5. 下游分析（收集球状体）

1. 通过结合类球体大小测量和体积计算进行定期显微镜检查并拍照记录，最终实现对类球体生长情况及处理后潜在生长变化的定量分析。
2. 在预定时间点进行活细胞成像时，将类球体与1 µg/mL Hoechst 33342（或DAPI）共同孵育15分钟以标记细胞核，随后通过荧光显微镜进行分析。
3. 在预定时间点收获生成的类球体，使用剪去出口的200 µL移液枪头（保持无菌）以增大直径，吸出含有类球体的培养基。将类球体合并收集至2–5 mL离心管中。静置2–5分钟后，待类球体因重力沉降，吸除上清液，随后进行下游分析。
4. 为制备完整的类球体蛋白裂解液，直接向含有收获类球体的离心管中加入预冷的裂解缓冲液（150 mmol/L NaCl，1% NP40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% 十二烷基硫酸钠，50 mmol/L Tris/HCl，pH 8，添加蛋白酶抑制剂混合物）。经过两到三个冻融循环后，测定裂解液中的蛋白含量，并进行下游分析，例如Western blot分析¹⁵。
5. 为制备完整的类球体RNA裂解液，直接向含有收获类球体的离心管中加入RNA裂解缓冲液，并根据所用RNA提取试剂盒的说明书进行RNA提取。
6. 进行免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色时，请遵循步骤5.6.1–5.6.3。
   1. 用1–2 mL 4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）处理收获的类球体，固定30分钟，随后进行石蜡包埋和切片（3–5 µm）。
   2. 免疫荧光染色前，使用梯度酒精脱蜡，并用抗原修复液孵育。随后用封闭液（2% 正常山羊血清/PBS）封闭切片以减少非特异性结合，并在4 °C下与一抗孵育过夜。
   3. 使用荧光标记的二抗检测抗原，用DAPI复染细胞核。根据制造商说明书进行其他染色（如PAS染色试剂盒），用于组织学评估。
7. 制备单细胞悬液时，请遵循步骤5.7.1和5.7.2。
   1. 将收获的类球体重悬于1–2 mL含有100 U/mL DNase I的TrypLE中，在37 °C孵育15分钟。加入含2–5% FCS、2 mM EDTA和DNase I的PBS终止消化反应。
   2. 将细胞悬液通过70 µm细胞筛滤入新的锥形管中，用于后续分析（如流式细胞术或单细胞分析）。
8. 进行单细胞RNA测序分析时，请遵循步骤5.8.1–5.8.3。
   1. 根据制造商说明书，使用（人源）单细胞多重分析试剂盒对代表不同时间点或处理条件的单细胞悬液进行标记。
   2. 随后合并样本，并加载至单细胞芯片通道中，目标细胞数为10,000–40,000个。
   3. 捕获单细胞，根据制造商说明书进行逆转录和文库构建，并对分离的RNA进行测序。

结果

该简单方案可实现人支气管上皮细胞与成纤维细胞在超低吸附培养板上的无基质球形共培养（图1A）。在培养过程中，最初形成的球体逐渐发育为更复杂的肺类球体，形态学分析通过活细胞成像（图1B）、免疫组织化学（图1C）和免疫荧光（图1D）显示，不同上皮和成纤维结构高效形成，体现了细胞间的直接相互作用。为区分共培养中的上皮细胞，使用携带表达Turquoise2（青色）荧光蛋白基因的（“空”）慢病毒SIN载体转导的荧光标记人HS5成纤维细胞¹⁶。虽然主要球体表现为成纤维细胞嵌入上皮细胞内部（图1B-D），但成纤维细胞似乎还以附属小球体的形式持续增殖。活力检测（图1E）证实了所形成结构内...

讨论

已提出三维细胞培养模型用于弥合二维培养与体内研究之间的差距，因为此类（共）培养体系能够更好地模拟体内存在的生理、形态及病理特性，其原因在于具备更接近体内状态的细胞间相互作用、细胞-细胞外基质（ECM）相互作用、对刺激的响应、基因表达、蛋白表达以及分化特征^17,18。除了数量众多且有时结构极为复杂的肿瘤类球体外^10,15,19,20，这些类球体也正越来越多地被用于正常组织的检测研究^11,21,22。特别是多细胞类球体模型，即人支气管...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 无菌血清移液管	ThermoFischer	170356N	Nunc 无菌血清移液管或同等产品
15 mL 锥形管	Corning	430052	或同等产品
37 °C / 5% CO2 湿化培养箱
5 mL 无菌血清移液管	ThermoFischer	170355N	Nunc 无菌血清移液管或同等产品
50 mL 锥形管	Corning	CLS430829	或同等产品
ATRA（全反式维甲酸）	StemCell Technologies	Cat#72262	50 nM
B-27 添加剂（50 倍浓缩液）	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1 倍工作浓度
BD Rhapsody WTA 扩增试剂盒	BD Bioscience	Cat#633801	按照制造商说明书使用
生物安全柜
牛血清白蛋白	Roche	Cat#BSAVHS-RO	0.4% (v/v)
细胞筛	Corning	352350	Falcon 70 µm 细胞筛，白色，无菌，独立包装
离心机	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	例如，Eppendorf Centrifuge 5804 — 台式离心机
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 mL
DNase I，无 RNase（1 U/μL）	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
EDTA（0.5 M），pH 8.0，无 RNase	ThermoFischer	AM9260G	2 mM
Eppendorf Research plus 12 通道多通道移液器	Eppendorf		例如，#3125000044（10–100 µL）或 #3125000060（30–300 µL）
胎牛血清	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	人正常肺上皮细胞系
肝素溶液（0.2%）	StemCell Technologies	Cat#7980	0.8 mL
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 µg/mL
HS-5	ATCC	CRL-3611	人基质成纤维细胞
人重组 FGF-10（KGF-2）ACF	StemCell Technologies	Cat#78173.1	10 ng/mL
人重组 FGF-7（KGF）ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 ng/mL
人单细胞多重检测试剂盒	BD Bioscience	Cat#633781	按照制造商说明书使用
氢化可的松储备液	StemCell Technologies	Cat#7926	每 500 mL 加 0.5 mL
Laduviglusib（CHIR-99021）	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µM
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 µg/mL
显微镜	ZEISS
单硫代甘油	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µM
N-2 添加剂（100 倍浓缩液）	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1 倍工作浓度
Neubauer 计数板	Merck	BR718605	例如，BRAND 计数板 BLAUBRAND Neubauer 型
正常山羊血清	ThermoFischer	Cat#31873	在 PBS 中稀释至 2% (v/v)
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40 替代物，1%
PAS 染色试剂盒	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	按照制造商说明书使用
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1 倍工作浓度
青霉素-链霉素（10,000 U/mL），100 倍浓缩液	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1 倍工作浓度
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899.AK	多聚甲醛，PBS 中 4%
PneumaCult 气道类器官分化培养基（ODM）	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult 气道类器官基础培养基（#05061，360 mL）和 PneumaCult 气道类器官分化添加剂*（#05063，40 mL）
PneumaCult Ex Plus 培养基	StemCell Technologies	Cat#5040	试剂盒包含 PneumaCult-Ex Plus 基础培养基（#05041，490 mL）和 PneumaCult-Ex Plus 50 倍浓缩添加剂*（#05042，10 mL）
蛋白酶抑制剂混合物	Merck/Roche	Cat#4693132001	每 10 mL 加 1 片
Rhapsody cDNA 试剂盒	BD Bioscience	Cat#633773	按照制造商说明书使用
RPMI 1640 培养基	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 mL
氯化钠	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 mmol/L
柠檬酸钠	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0.10%
脱氧胆酸钠	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0.50%
十二烷基硫酸钠	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0.10%
多通道移液器用无菌试剂储液槽（例如 60 mL）	ThermoFischer	9510037	或同等产品
TC-96 孔板 BIOFLOAT，每板 4 个支架ück	Sarstedt（或 facellitate）	83.3925.400（或 F202003）	超低吸附板
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 mmol/L，pH 8
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
台盼蓝染液（0.4%）	ThermoFischer	Cat#15250061	与 NGM 按 1:5（v/v）混合
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1 倍工作浓度
胰蛋白酶-EDTA（0.5 %）	ThermoFischer	Cat#15400054	将 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（TE）溶液用磷酸盐缓冲液（不含钙和镁）无菌稀释至 1 倍工作浓度
WST-1 试剂	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	细胞增殖检测试剂