本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体是高度动态的细胞器，对任何动物的生存都至关重要。它们会根据宿主细胞的需求或应激状态频繁发生分裂和融合事件，从而导致线粒体网络持续重塑。因此，能够以三维形式并随时间推移对线粒体网络进行评估，有助于深入理解该系统如何响应诸如应激或药物干预等因素。通过荧光成像技术可对细胞中的线粒体网络进行可视化观察和动态监测。然而，目前线粒体网络常被描述为二维且静态的结构，并依赖于缺乏标准化的度量指标。为此，我们旨在介绍一种图像预处理流程，使用户能够为线粒体事件定位工具（MEL）准备图像数据。MEL 是一种 ImageJ 插件工具，可随时间以三维方式检测线粒体网络中的分裂与融合事件，从而揭示该网络所经历的动态变化。此外，我们还阐述了在分析线粒体数量变化及形态学改变背景下，理解分裂与融合事件的重要意义。
引言
线粒体是存在于所有真核细胞中的高度动态细胞器，为细胞提供能量并调控其代谢活动。因此，线粒体处于细胞生死抉择的关键节点。研究表明，线粒体在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括溶酶体酸化、分子马达活动、肌肉收缩以及突触放电等1，2。
线粒体通过频繁的分裂和融合事件来维持线粒体网络，以根据细胞的代谢需求和应激状态高效产生ATP。事实上，已有研究表明，线粒体可通过分裂促进线粒体自噬，即选择性清除受损的线粒体片段，从而确保细胞内仅保留具有活性且未去极化的线粒体3,4。然而，当细胞对ATP的需求增加时，线粒体会发生融合，以提高整个网络的ATP输出能力5,6。此外，分裂和融合过程还被证实在线粒体DNA的分配与保护中发挥重要作用7,8。需要注意的是，分裂与融合的程度必须受到精确的稳态调控，以维持健康的线粒体网络，因为任一过程过度或不足均已被证明具有不利影响。
已有研究....
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方案
1. 细胞处理与显微镜图像采集
- 在8孔培养皿中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（完全培养基）的DMEM培养GT1-7细胞。让细胞过夜贴壁，随后用含10% FBS的DMEM配制的2.5 mM盐酸二甲双胍处理72小时，并确保每24小时更换一次培养基。在成像前6小时同时加入10 µM CCCP，在成像前4小时加入400 nM巴佛洛霉素A1（Baf）进行共处理。
注意：此操作可适用于任何选定的真核细胞系。 - 成像前，配制预热的完全培养基混合液，其中包含5 nM Hoechst和100 nM TMRE。
- 将细胞处理用的培养基更换为上述成像混合液，孵育10分钟后开始成像。
注意：由于线粒体具有动态活性，应使用配备孵育腔的显微镜进行成像，孵育条件设置为37 °C和5% CO2。
2. 成像
- 使用100倍放大倍数和1.4 NA物镜对细胞进行成像。
- 调节激光功率，使其足够低以避免荧光淬灭，约为2%。确保扫描速度较高。以512 × 512分辨率采集图像。
- 将Z轴切片间隔设置为
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结果
选择合适的细胞
用户应注意，线粒体网络会随着细胞的有丝分裂状态而发生变化。如果细胞核呈现哑铃形或U形，或者细胞核附近出现无荧光信号的区域，则可能表明细胞即将进入有丝分裂。在此状态下，线粒体的分裂很可能是由于细胞分裂所致，而非处理干预对线粒体网络造成的影响（补充图S8）。
二甲双胍是一种已被证明可诱导线粒体融合的抗糖尿病药物22。GT1-7 小鼠下丘脑细胞分别用 400 nM 巴佛洛霉素（Baf）处理 4 小时以抑制线粒体降解，用 10 µM CCCP 处理 6 小时以诱导线粒体去极化，或用 5 mM 盐酸二甲双胍（Metf）处理 72 小时，随后在含有 TMRE 和 Hoechst 的 DMEM 培养基中孵育。原始图像由 10 张显微图像组成，z 轴步长为 0.25 µm，使用 405 nm 和 561 nm 激光在五个时间点采集，每个时间点采集耗时 30 秒，在完成 z 轴层扫后各时间点之间无间隔。所示数据代表四次独立实验的均值 ± 标准差，每组处理的总样本.......
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讨论
尽管目前已存在越来越多用于描述线粒体形态的方法，但能够以定量方式充分捕捉线粒体动态变化的技术仍然有限。此外，需要注意的是，线粒体网络的形态及其调控机制在本质上具有多样性。这导致线粒体网络会根据细胞的需求而变化，从增强能量输出的分支状结构，到为促进线粒体自噬而出现的暂时性分裂区域不等24,25。本实验方案旨在测量细胞中线粒体分裂与融合事件的变化，从而揭示线粒体在三维空间和时间进程中的动态变化。所提出的图像采集与分析流程试图补偿TMRE染色线粒体可能发生的光漂白，从而在必要时允许延长成像时间。
图像采集后，可使用任何偏好的工具对显微图像进行形态学评估。这使得我们的流程在为三维分析准备显微图像方面具有实用价值。图像预处理流程包括三个步骤，用于为MEL及其他任何评估准备显微图像（图1）。首先对显微图像进行去卷积处理，以校正光散射效应并增强线粒体结构的清晰度；随后应用模糊处理和对比度增强，在不改变显微镜下细胞成像时激.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由南非斯泰伦博斯大学、南非医学研究理事会（SAMRC）、南非国家研究基金会（NRF）、加拿大卫生研究院（CIHR）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8 孔培养皿 | ThermoFisher | #Z734853 | |
| 自适应阈值调节 | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold | ||
| Bafilomycin A1 | LKT Labs | #B0026 | |
| 羰基氰氯苯腙（CCCP） | Merck | #C2759 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | LSM780 ELYRA PS.1 超分辨率成像平台 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | ThermoFisher | #341956062 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | #F0679 | |
| GitHub 链接 | https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin | ||
| GraphPad Prism v7.06 | |||
| GT1-7 细胞 | ATCC | SCC116 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| ImageJ v1.53t | Fiji | ||
| 宏命令（Macros） | https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections | ||
| 二甲双胍 | 欧洲药典 | M06050000 | |
| 青霉素/链霉素（PenStrep） | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| T25 培养瓶 | Bio-Smart Scientific | #70025 | |
| TMRE | ThermoFisher | #T669 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | #T4049 |
参考文献
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. ....
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重印与许可
