本文介绍了线粒体事件定位器（MEL），这是一种ImageJ插件，可用于定量分析随时间变化的线粒体分裂与融合活性的三维动态。我们还描述了一种图像处理流程，可用于在ImageJ中进行分析前对显微图像进行预处理和优化。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体是高度动态的细胞器，对任何动物的生存都至关重要。它们会根据宿主细胞的需求或应激状态频繁发生分裂和融合事件，从而导致线粒体网络持续重塑。因此，能够以三维形式并随时间推移对线粒体网络进行评估，有助于深入理解该系统如何响应诸如应激或药物干预等因素。通过荧光成像技术可对细胞中的线粒体网络进行可视化观察和动态监测。然而，目前线粒体网络常被描述为二维且静态的结构，并依赖于缺乏标准化的度量指标。为此，我们旨在介绍一种图像预处理流程，使用户能够为线粒体事件定位工具（MEL）准备图像数据。MEL 是一种 ImageJ 插件工具，可随时间以三维方式检测线粒体网络中的分裂与融合事件，从而揭示该网络所经历的动态变化。此外，我们还阐述了在分析线粒体数量变化及形态学改变背景下，理解分裂与融合事件的重要意义。
引言
线粒体是存在于所有真核细胞中的高度动态细胞器，为细胞提供能量并调控其代谢活动。因此，线粒体处于细胞生死抉择的关键节点。研究表明，线粒体在多种生物学过程中发挥着至关重要的作用，包括溶酶体酸化、分子马达活动、肌肉收缩以及突触放电等1，2。
线粒体通过频繁的分裂和融合事件来维持线粒体网络，以根据细胞的代谢需求和应激状态高效产生ATP。事实上，已有研究表明，线粒体可通过分裂促进线粒体自噬，即选择性清除受损的线粒体片段，从而确保细胞内仅保留具有活性且未去极化的线粒体3,4。然而，当细胞对ATP的需求增加时，线粒体会发生融合，以提高整个网络的ATP输出能力5,6。此外，分裂和融合过程还被证实在线粒体DNA的分配与保护中发挥重要作用7,8。需要注意的是，分裂与融合的程度必须受到精确的稳态调控，以维持健康的线粒体网络，因为任一过程过度或不足均已被证明具有不利影响。
已有研究表明，过度的线粒体分裂会导致阿尔茨海默病、帕金森病和tau蛋白病中线粒体网络的碎片化，进而导致ATP水平下降9,10,11；而分裂水平过低则可能导致去极化线粒体的积累，引发类似帕金森病的症状12。已知在应激状态下，线粒体网络会发生超融合以增加ATP的产生。然而，长期维持在此状态已被证实会升高活性氧（ROS）水平并增强自噬活性，从而导致细胞死亡的启动9,12。
因此，理解线粒体网络的状态对于揭示细胞乃至整个生物体的状态具有关键意义。鉴于线粒体网络在健康与疾病背景下的重要意义，以及其发生分裂与融合事件的能力及其对细胞健康的影响，研究人员由此推动了本实验方案及相关分析工具的开发。具体而言，目前文献中可用于表征线粒体动态的工具仍十分有限，且描述不足。
线粒体形态通常通过共聚焦显微镜结合计算分析来确定，该方法要求对原始显微图像进行一定程度的处理以提高其质量，从而更准确地描述线粒体的组织结构。通过这种方法，用户可以获取线粒体网络的多种形态计量参数，例如数量、体积、长度和长宽比13,14,15。用户可采用二维或三维显微图像进行形态学评估，但三维分析能提供更高的准确性和更深入的信息，因为线粒体网络本身具有三维结构。在分析线粒体分裂与融合时，建议使用包含z轴信息的显微图像，以更好地反映线粒体网络的三维特性16。
许多研究将线粒体分为碎片化、网状或中间状态，以此来描述线粒体网络的形态16,17。由于线粒体在细胞内具有多种三维形态，三维分析尤其有益。将三维信息纳入研究可提高结果的可信度，特别是在线粒体计数方面，因为线粒体很可能沿z轴方向上下移动。MEL 是一种依赖于三维成像的 ImageJ 插件18。本研究中，我们使用经 TMRE 和 Hoechst 染色的 GT1-7 小鼠海马神经元细胞，以同时观察线粒体网络和细胞核。随后，细胞图像经过预处理流程，以提升显微图像质量，为后续图像分析做好准备。
已有多种技术可用于基于静态指标测定线粒体形态，但其中能够包含分裂与融合活动、并实现对线粒体动态行为进行定量捕捉的方法较少13,19,20,21。本文将介绍一种在测定线粒体网络特征之前进行图像增强的实验方案，重点聚焦于线粒体的分裂与融合活性。我们将展示该技术如何补充先前已发表的线粒体形态测定方法。
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方案
1. 细胞处理与显微镜图像采集
- 在8孔培养皿中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（完全培养基）的DMEM培养GT1-7细胞。让细胞过夜贴壁，随后用含10% FBS的DMEM配制的2.5 mM盐酸二甲双胍处理72小时，并确保每24小时更换一次培养基。在成像前6小时同时加入10 µM CCCP，在成像前4小时加入400 nM巴佛洛霉素A1（Baf）进行共处理。
注意：此操作可适用于任何选定的真核细胞系。 - 成像前，配制预热的完全培养基混合液，其中包含5 nM Hoechst和100 nM TMRE。
- 将细胞处理用的培养基更换为上述成像混合液，孵育10分钟后开始成像。
注意：由于线粒体具有动态活性，应使用配备孵育腔的显微镜进行成像，孵育条件设置为37 °C和5% CO2。
2. 成像
- 使用100倍放大倍数和1.4 NA物镜对细胞进行成像。
- 调节激光功率，使其足够低以避免荧光淬灭，约为2%。确保扫描速度较高。以512 × 512分辨率采集图像。
- 将Z轴切片间隔设置为0.25 µm步进。按照本方案，对细胞进行成像时应包含10个Z层堆栈。在无时间间隔的情况下连续采集五个时间帧的Z堆栈图像。
注意：一旦优化完成，该成像方案在不同处理组或实验组之间不应再进行调整，因为此处列出的宏要求所有细胞的成像协议保持一致。
3. 计算评估
注意：所有后续处理均使用 ImageJ v1.53t 完成。MEL 插件及支持模块可在 https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin 获取，而所用的所有宏程序可从 https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections 获取。
- 图像准备
- 在 ImageJ 中打开原始文件。
- 若需从单张显微图像中裁剪多个细胞，请先将图像复制多份，复制数量等于待分析的单个细胞数量。
- 使用同步窗口工具、自由手绘工具以及颜色调整功能，在视野中包含多个细胞的情况下，围绕目标细胞绘制感兴趣区域（补充图 S1）。
- 点击编辑 | 清除外部。
- 将红色和蓝色通道分离，并将线粒体通道保存为 .Tiff 文件。
- 点扩散函数生成与去卷积
- 为生成点扩散函数（PSF），使用嵌入显微图像信息的PSF 生成器插件。前往插件 | PSF 生成器以打开该插件。此外，前往图像 | 显示信息…或按 I 键打开图像信息窗口，并向下滚动。根据显示信息框中的体素尺寸和深度，将像素尺寸 XY设置为166.1 nm，Z 步长设置为200 nm。将波长设为568 nm，尺寸 XYZ设为匹配图像分辨率512 × 512，Z 堆栈设为10 个 Z 层面（补充图 S2）。
- 前往 插件 | 宏 | 编辑 | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm 宏。
- 编辑输入和输出行，然后点击运行（补充图 S3）。
- 图像对比度增强与模糊处理
- 前往插件 | 宏 | 编辑 | Preprocessing.ijm。
- 在Preprocessing.ijm宏中，使用背景减除方法，滚动球半径设为6。设置Sigma Filter Plus，使半径为1，使用的像素数为2，最小像素比例为0.2，且插件为异常值感知型。调整CLAHE设置，使区块大小为64；将直方图区间数设为256，最大斜率设为2.5，Gamma设为0.8。
注：以上所有参数均针对我们的数据集进行了优化，应用于其他数据集前应进行相应优化。Sigma 滤波用于平滑图像，有效融合邻近像素，以确保结构连续性。局部对比度增强用于提高明暗像素之间的对比度，结合 Gamma 值调整，可增强线粒体结构的可见性，同时最小化背景像素。 - 将输入行更改为包含已完成去卷积处理的显微图像的文件夹（补充图 S4）。
- 点击运行。
- 图像阈值分割
注：尽管用户可自由选择任何阈值分割工具，我们推荐使用 Qingzong Tseng 提供的自适应阈值插件（https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold）。- 在 ImageJ 中打开经Preprocessed.ijm宏处理后的目标文件。
- 前往插件 | adaptiveThr。
- 将局部阈值设为加权均值，像素区块大小根据用户偏好设置。
注：细胞间应保持像素区块大小一致，因为该值会影响线粒体尺寸评估指标（如体积或长宽比）。 - 为节省时间，点击预览并调整区块大小，尽可能清晰地包含所有线粒体。同时为每个细胞调整减除值以消除不必要的背景。将显微图像文件保存至与减除值对应的文件夹中（补充图 S5）。
注：Threshold.ijm宏包含尺寸滤波器，用于消除较小颗粒。 - 选择插件 | 宏 | 编辑 | Threshold.ijm。
- 在宏脚本中编辑 input_path 和 output_path 行，以及 blockSize 和 subtract 行（补充图 S6）。
- 点击运行。
- 使用线粒体事件定位插件（MEL）检测分裂与融合事件
注：MEL 旨在处理由单通道组成、以单个 Tiff 文件形式保存的时间序列 Z 堆栈。虽然可通过将输入行更改为目标阈值化 Tiff 文件实现处理，我们还将演示使用 ImageJ 中的拼接功能一次性处理多个 Tiff 文件的方法。- 打开最多 10 个属于相同处理条件的阈值化显微图像。
注：为确保操作成功，这些显微图像必须具有相同数量的 Z 层面。 - 前往图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接，然后点击确定。
- 为去除阈值化后残留的小型点状结构，前往插件 | 积分图像滤波器 | 去除异常值。使用预览功能设置 X 和 Y 尺寸以去除必要碎片。
- 将拼接后的文件保存为 Tiff 格式。
- 前往插件 | 宏 | 编辑 | Quicktest_new.ijm，并根据需要编辑输入和输出路径（补充图 S7）。
注：完成后，输出文件夹中将生成一个名为 "MEL_results" 的文件夹，其中包含所有 MEL 分析结果。这些结果展示了每个时间点检测到的分裂和融合事件，由于 MEL 的工作原理，最后一个时间点应始终被移除18。
- 打开最多 10 个属于相同处理条件的阈值化显微图像。
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结果
选择合适的细胞
用户应注意，线粒体网络会随着细胞的有丝分裂状态而发生变化。如果细胞核呈现哑铃形或U形，或者细胞核附近出现无荧光信号的区域，则可能表明细胞即将进入有丝分裂。在此状态下，线粒体的分裂很可能是由于细胞分裂所致，而非处理干预对线粒体网络造成的影响（补充图S8）。
二甲双胍是一种已被证明可诱导线粒体融合的抗糖尿病药物22。GT1-7 小鼠下丘脑细胞分别用 400 nM 巴佛洛霉素（Baf）处理 4 小时以抑制线粒体降解，用 10 µM CCCP 处理 6 小时以诱导线粒体去极化，或用 5 mM 盐酸二甲双胍（Metf）处理 72 小时，随后在含有 TMRE 和 Hoechst 的 DMEM 培养基中孵育。原始图像由 10 张显微图像组成，z 轴步长为 0.25 µm，使用 405 nm 和 561 nm 激光在五个时间点采集，每个时间点采集耗时 30 秒，在完成 z 轴层扫后各时间点之间无间隔。所示数据代表四次独立实验的均值 ± 标准差，每组处理的总样本...
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讨论
尽管目前已存在越来越多用于描述线粒体形态的方法，但能够以定量方式充分捕捉线粒体动态变化的技术仍然有限。此外，需要注意的是，线粒体网络的形态及其调控机制在本质上具有多样性。这导致线粒体网络会根据细胞的需求而变化，从增强能量输出的分支状结构，到为促进线粒体自噬而出现的暂时性分裂区域不等24,25。本实验方案旨在测量细胞中线粒体分裂与融合事件的变化，从而揭示线粒体在三维空间和时间进程中的动态变化。所提出的图像采集与分析流程试图补偿TMRE染色线粒体可能发生的光漂白，从而在必要时允许延长成像时间。
图像采集后，可使用任何偏好的工具对显微图像进行形态学评估。这使得我们的流程在为三维分析准备显微图像方面具有实用价值。图像预处理流程包括三个步骤，用于为MEL及其他任何评估准备显微图像（图1）。首先对显微图像进行去卷积处理，以校正光散射效应并增强线粒体结构的清晰度；随后应用模糊处理和对比度增强，在不改变显微镜下细胞成像时激...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由南非斯泰伦博斯大学、南非医学研究理事会（SAMRC）、南非国家研究基金会（NRF）、加拿大卫生研究院（CIHR）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8 孔培养皿 | ThermoFisher | #Z734853 | |
| 自适应阈值调节 | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold | ||
| Bafilomycin A1 | LKT Labs | #B0026 | |
| 羰基氰氯苯腙（CCCP） | Merck | #C2759 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss AG | LSM780 ELYRA PS.1 超分辨率成像平台 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | ThermoFisher | #341956062 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | #F0679 | |
| GitHub 链接 | https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin | ||
| GraphPad Prism v7.06 | |||
| GT1-7 细胞 | ATCC | SCC116 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| ImageJ v1.53t | Fiji | ||
| 宏命令（Macros） | https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections | ||
| 二甲双胍 | 欧洲药典 | M06050000 | |
| 青霉素/链霉素（PenStrep） | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| T25 培养瓶 | Bio-Smart Scientific | #70025 | |
| TMRE | ThermoFisher | #T669 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | #T4049 |
参考文献
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