通过动态和三维荧光显微照片了解线粒体形态的变化

Summary

在这里，我们描述了线粒体事件定位器 （MEL），这是一个 ImageJ 插件，可用于量化线粒体裂变和融合活动随时间变化的 3 维变化。我们还描述了一种图像处理管道，可用于在 ImageJ 中进行分析之前清理显微照片。

Abstract

线粒体是高度动态的细胞器，对任何动物的生存都至关重要，会根据宿主的需要或压力定期发生裂变和融合事件，从而导致线粒体网络的不断重塑。因此，能够在三个维度上以及随时间评估线粒体网络，有助于了解系统如何应对压力或药物干预等因素。细胞线粒体网络的荧光成像能够可视化和监测这些变化。然而，线粒体网络通常被描述为由非标准化指标定义的二维静态结构。因此，我们着手描述一种管道，使用户能够为线粒体事件定位器（MEL）准备图像，这是一种ImageJ插件工具，可以检测线粒体网络中随时间变化的裂变和融合事件，并以3维方式，从而提供对该网络所经历的动态变化的洞察。此外，我们还描述了根据线粒体计数和形态变化的变化来理解裂变和融合的好处。

Introduction

线粒体是存在于所有真核细胞中的高度动态细胞器，为它们提供能量并调节其新陈代谢。因此，线粒体处于细胞死亡和生存的十字路口。线粒体已被证明对多种过程至关重要，从溶酶体酸化和分子运动作用到肌肉收缩和突触放电 ^1,2。

线粒体定期经历裂变和融合事件，以维持线粒体网络，有效产生 ATP 以响应细胞的代谢需求和压力。事实上，线粒体已被证明会发生裂变以促进线粒体自噬，即线粒体片段的选择性去除。因此，^{细胞系统中}只剩下活跃呼吸而不是去极化的线粒体^3,4。然而，如果需求增加，聚变是增加网络^ATP 输出的一种手段 ^5,6。此外，裂变和融合也被证明在线粒^体DNA的分配和保护中发挥着重要作用^7,8。应该指出的是，裂变和融合的程度需要仔细的稳态控制，以确保健康的线粒体网络，因为任何一个过程过多或过少都已被证明是有害的。

过度裂变已被证明会导致线粒体网络支离破碎，随后在阿尔茨海默病、帕金森病和 tau 蛋白病中^ATP 水平降低 ^9,10,11，低水平的裂变可能导致去极化线粒体的积累，从而导致帕金森病样症状¹².已知网络的过度融合会在压力时期发生，以增加 ATP 输出。然而，长期处于这种状态已被证明会增加 ROS 水平和自噬活性，导致细胞死亡 ^9,12。

因此，很明显，了解线粒体网络的状态为了解细胞状态以及生物体的状态提供了关键见解。在健康和疾病背景下了解线粒体网络、其经历裂变和融合事件的能力及其对细胞健康的影响的明显重要性是推动该协议和相关分析工具的开发的原因。具体来说，能够表征线粒体动力学的工具在很大程度上是有限的，并且在文献中描述得很少。

线粒体形态通常使用共聚焦显微镜确定，然后进行计算分析，这需要原始显微照片经过一定程度的处理以提高其评估质量，因为这最能描述线粒体组织。通过这种方式，用户可以确定线粒体网络的许多形态学结果，例如计数、体积、长度和纵横比 13,14,15。用户可以使用 2D 或 3D 显微照片进行形态学评估，尽管 3D 分析确实提供了更高的准确性和洞察力，因为线粒体网络由 3D 结构组成。为了分析裂变和聚变，建议使用带有z轴的显微照片，因为这最好地补偿线粒体网络¹⁶的三维性。

许多研究涉及将线粒体分类为碎片化、丝状或中间状态，作为描述网络的一种手段^16,17。由于线粒体在细胞中呈现出不同的形状，因此 3D 分析特别有益。在研究中添加 3 维性可以增强信心，尤其是线粒体计数，因为线粒体可能会沿 z 轴向上或向下移动。MEL 是一个依赖于 3D 捕获图像的 ImageJ 插件¹⁸。在这里，我们利用用TMRE和Hoechst染色的GT1-7小鼠海马神经元细胞来可视化线粒体网络以及细胞核。然后通过预处理管道放置细胞，以提高显微照片的质量，为图像分析做准备。

已经有许多技术可以根据静态指标确定线粒体形态。很少有包括裂变和聚变活动并能够定量捕获线粒体的动态行为 13,19,20,21。在这里，我们将描述一种在确定网络特征之前进行图像增强的协议，重点是线粒体裂变和融合活动。我们将演示该技术如何补充先前发表的确定线粒体形态的方法。

Protocol

1. 细胞处理和显微镜采集

1. 在补充有 10% FBS 和 1% Penstrep（完全培养基）的 DMEM 中的 8 个室培养皿中培养 GT1-7 细胞。让细胞附着过夜，然后用在DMEM中制成的2.5mM盐酸二甲双胍和10%FBS处理72小时，确保每24小时更换一次培养基。在成像前6小时用10μM CCCP共处理细胞，在成像前4小时用400nM的巴非洛霉素A1（Baf）共处理细胞。
   注意：这可以用任何选择的真核细胞系来完成。
2. 在成像之前，准备含有 5 nM Hoechst 和 100 nM TMRE 的预热完全培养基混合物。
3. 用成像混合物替换细胞处理培养基，并在成像前留出 10 分钟的孵育时间。
   注意：由于线粒体的动态活性，应使用孵育室设置为37°C和5%CO 2的显微镜对细胞进行成像_。

2. 成像

1. 使用 100 倍 放大倍率和 1.4 NA 对细胞进行成像。
2. 调整激光功率，使功率足够低以避免光漂白，~2%。确保扫描速度高。以 512 x 512 分辨率捕获图像。
3. 将 Z 切片间隔 设置为 0.25 μm 增量。要遵循此协议，请对细胞进行成像，使其由 10 个 Z 堆栈组成。获取五个时间范围，在获取 Z 堆栈之间没有任何间隔。
   注意：一旦优化，不应在治疗组或实验组之间调整该方案，因为此处列出的宏要求在所有细胞中标准化成像方案。

3. 计算评估

注意：所有后续处理均使用 ImageJ v1.53t 完成。MEL 插件以及支持模块可以在 https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin 找到，而所有使用的宏都可以在 https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections 找到。

1. 图像准备
   1. 在 ImageJ 中打开原始文件。
   2. 要从单张显微照片中裁剪多个细胞，首先将图像复制到要分析的单个细胞数。
   3. 使用 同步 窗口工具、 手绘 工具和颜色调整，在视野中有多个单元的感兴趣单元格周围绘制感兴趣区域（补充图 S1）。
   4. 点击 编辑 |外面很干净。
   5. 将红色和蓝色通道彼此拆分，并将线粒体通道保存为 .Tiff 文件。
2. 点扩散函数生成和反卷积
   1. 要生成点扩散函数 （PSF），请使用使用嵌入显微照片信息的 PSF 生成器插件。转到插件 |PSF 生成器打开插件。此外，转到图像 |显示信息...或按 I 打开图像信息，然后滚动到底部。使用体素大小和深度，从显示信息框中，将 Pixelsize XY 更改为 166.1 nm，将 Z 步长更改为 200 nm。将波长更改为568nm，大小XYZ以匹配512 x 512的图像分辨率和10个Z切片的Z堆栈（补充图S2）。
   2. 转到插件 |宏 |编辑 |Deconvolution_time_lapse_mine.ijm 宏。
   3. 编辑输入和输出线并按运行（补充图 S3）。
3. 图像对比度增强和模糊
   1. 转到 插件 |宏 |编辑 |预处理.ijm。
   2. 在 Preprocessing.ijm 宏中，使用滚动球半径等于 6 的背景减法。将 Sigma Filter Plus 设置为半径等于 1，使用的像素等于 2，最小像素分数等于 0.2，并且插件具有异常值感知功能。调整 CLAHE 设置，使块大小为 64;将直方图条柱设置为 256，将最大斜率设置为 2.5，将 Gamma 设置为 0.8。
      注意：所有这些设置都已针对我们的数据集进行了优化，在应用之前应针对替代数据集优化值。应用西格玛滤波来平滑图像并有效混合附近的像素，以确保结构一致。应用局部对比度来增加明暗像素之间的对比度，并结合伽马的变化，增强线粒体结构的存在，同时最大限度地减少背景像素。
   3. 将输入行更改为包含经过反卷积的显微照片的文件夹（补充图S4）。
   4. 单击运行。
4. 图像阈值
   注意：虽然用户可以使用他们选择的任何阈值工具，但我们推荐 Qingzong Tseng （https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold） 的自适应阈值插件。
   1. 打开已在 ImageJ 中被 Preprocessed.ijm 宏修改的感兴趣文件。
   2. 转到 插件 |adaptiveThr。
   3. 根据用户的偏好，将 局部阈值 设置为加 权平均值 和像素块大小。
      注意：细胞之间的像素块大小应保持一致，因为该值会影响线粒体尺寸评估，例如体积或纵横比。
   4. 要优化时间，请单击 预览 并调整 块大小 ，以便尽可能清楚地包含尽可能多的线粒体。还要调整每个单元格的减去值以消除不必要的背景。将显微照片文件保存在与减去值关联的文件夹中（补充图S5）。
      注意： Threshold.ijm 宏包括一个大小过滤器，用于消除较小的颗粒。
   5. 选择 插件 |宏 |编辑 |阈值.ijm。
   6. 编辑宏脚本中的input_path和output_path行，以及blockSize，减去行（补充图S6）。
   7. 单击运行。
5. 通过线粒体事件定位器 （MEL） 插件检测裂变和融合事件
   注意：MEL 旨在处理由单个通道组成的 z 堆栈延时序列，一次保存为单个 Tiff。虽然这可以通过将输入行更改为感兴趣的阈值 Tiff 文件来完成，但我们还将演示一种使用 ImageJ 中的 串联 函数一次处理多个 Tiff 文件的方法。
   1. 打开多达 10 张属于相同治疗条件的阈值显微照片。
      注意：显微照片必须具有相同数量的 z 切片才能发挥作用。
   2. 转到 图片 |堆栈 |工具 |连接并 按 确定。
   3. 要删除阈值留下的剩余小点，请转到 插件 |集成图像归档器 |删除异常值。使用 预览 设置 X 和 Y 大小以删除必要的片段。
   4. 将串联的文件另存为 Tiff。
   5. 转到 插件 |宏 |编辑 |Quicktest_new.ijm 并根据需要编辑输入和输出路径（补充图 S7）。
      注意：完成后，将在输出文件夹中找到一个名为“MEL_results”的文件夹，其中包含所有 MEL 结果。这些显示为在每个时间点检测到的裂变和聚变事件，并且由于MEL的工作方式，应始终删除最后一个时间点¹⁸。

Results

选择合适的细胞
用户应注意线粒体网络会根据细胞的有丝分裂状态而变化。如果细胞核呈哑铃形或 U 形，或者细胞核附近有一个缺乏荧光信号的空间，那么这可能表明细胞接近有丝分裂。在这种状态下，线粒体可能由于细胞分裂而发生裂变，而不是因为治疗干预及其对网络的影响（补充图S8）。

二甲双胍是一种抗糖尿病药物，已被证明可以诱导线粒体融合²²。GT1-7小鼠下丘脑细胞用400nM的巴非洛霉素（Baf）处理4小时以抑制线粒体降解，10μM CCCP处理6小时以引起线粒体去极化，用5mM盐酸二甲双胍（Metf）处理72小时，然后在DMEM中含有TMRE和Hoechst的混合物中孵育。原始图像由 10 张 z 步长宽度为 0.25 μm 的显微照片组成，这些显微照片是使用 405 nm 和 561 nm 激光在五个时间范围内捕获的。每个时间点需要 30 秒来捕获，并且在获取 z 堆栈后，时间点之间没有使用间隔。显示的数据表示了四个实验的平均值±标准差，每个治疗组总共 n 个 12。<...

Discussion

尽管存在越来越多的方法来描述线粒体形态，但可用于以定量方式充分捕捉线粒体动力学的技术有限。此外，应该注意的是，线粒体网络形态以及控制这种形态的机制在本质上是多种多样的。这导致了与细胞需求相关的网络，从用于增强能量输出的分支形成到时间上不同的裂变区域以促进线粒体自噬^24,25。该协议旨在测量细胞中线粒体裂变和融合事件的变化，从而深入了解 3D 和随时间变化的动态线粒体变化。采集和分析管道提出了补偿TMRE染色线粒体潜在光漂白的尝试，从而在必要时允许延长成像时间。

图像采集后，通过任何首选工具处理显微照片以进行形态学评估。这使得我们的管道在制备用于 3D 分析的显微照片方面非常有用。图像预处理管道由三个步骤组成，用于准备用于 MEL 和任何其他评估的显微照片（图 1）。显微照片经过反卷积以补偿光散射效应并锐化线粒体结构。然后应用模糊和对比度增强...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 个室内碟形天线	赛默飞世尔	#Z734853
调整后的阈值			https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
巴非洛霉素 A1	LKT 实验室	#B0026
羰基氰化氯苯腙 （CCCP）	默 克	#C2759
共聚焦显微镜	卡尔蔡司股份公司		LSM780 ELYRA PS.1超分辨率平台
Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）	赛默飞世尔	#341956062
胎牛血清 （FBS）	西格玛-奥尔德里奇	#F0679
Github链接			https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
GraphPad 棱镜 v7.06
GT1-7 电池	ATCC	SCC116
霍克什特	西格玛-奥尔德里奇	H6024型
图像J v1.53t	斐济
宏			https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
二甲双胍	欧洲药典	M06050000
青霉素/链霉素 （PenStrep）	西格玛-奥尔德里奇	#P4333
T25	生物智能科学	#70025
TMRE网站	赛默飞世尔	#T669
胰蛋白酶	西格玛-奥尔德里奇	#T4049