一种具有临床相关性的猪慢性心肌缺血模型：通过放置动脉缩窄环并结合同步灌注成像

摘要

本项目旨在详细阐述一种经过严格验证的手术方案，即在左回旋冠状动脉（LCx）近端放置缩窄环，从而诱导慢性冠状动脉疾病，并利用同位素标记的微球精确绘制缺血区域。

摘要

尽管在心血管疾病治疗的药物和介入疗法方面已取得突破，但仍需借助可转化的大动物模型来研究诊断工具和治疗策略。猪是研究人类心血管疾病的极为准确且合适的模型，其心脏解剖结构和生理特征与人类高度相似，代谢和蛋白质组学特征也相近。通过使用缩窄环（ameroid constrictor）诱导心肌特定区域产生慢性心肌缺血，可准确且简便地模拟人类动脉粥样硬化发展过程及其后续的心肌反应。过去50年来，缩窄环已被广泛研究，其应用具有充分的科学依据；此外，我们在高效、一致地实施该手术方面已有二十多年的经验。本方案中的关键步骤之一是进行冠状动脉血流显像，通过注射同位素标记的微球来确定缺血最严重的区域以及无缺血的区域。冠状动脉血流显像技术避免了为灌注研究和确定缺血区域而必需进行的、耗时费力的心脏磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）检查。本论文的目的是详细阐述在左回旋支（LCx）近端正确放置缩窄环以及后续进行冠状动脉灌注显像的方法。

引言

全球范围内，缺血性心脏病（IHD）的死亡率及其对患者和医疗系统的负担持续增加。根据美国心脏协会的数据，从1990年到2021年，全球因缺血性心脏病导致的死亡人数增加了74%¹。在美国，这一趋势同样显著，美国疾病控制中心指出，每20名成年人中就有1人被诊断为冠状动脉疾病（CAD），约每5例死亡中就有1例死于心血管疾病，相当于每33秒就有一人死于心血管疾病²。这种疾病负担给医疗系统带来了巨大压力，仅在2019年至2020年期间，用于心血管疾病患者的支出就超过2500亿美元²。鉴于心血管疾病的普遍性及其对患者和医疗服务提供者造成的严重负担，持续开展创新性和新型治疗手段的研究至关重要。

为实现这些目标，必须采用具有临床相关性的动物模型，并严格审查其是否符合可重复性和可转化性研究的标准。动物模型因多种原因受到质疑，包括使用不同动物物种导致药代动力学差异、诱导目标疾病状态的方案不一致、药物剂量与给药方案各异、动物随机分组缺乏标准化、随访时间长短不一以及研究者盲法实施不足，最后还有实验分组过小等问题³。我们已在实验中优化并标准化了整体动物模型以准确模拟缺血性心脏病（IHD），同时对其中的手术操作流程、动物随机分组、药物递送方式与持续时间以及后续结局指标进行了系统规范。在IHD研究方面，猪是理想的动物模型，因其心脏解剖结构和生理特征与人类高度相似。尤为重要的是，猪的冠状动脉分布与人类相近，且侧支循环极少，这使得缺血的诱导能够可靠地反映人类动脉粥样硬化的发展过程。此外，猪的代谢特征、蛋白质组谱型以及免疫系统也与人类相似，从而使治疗手段的分子效应分析更具意义⁴。基于上述优势，本方案所采用的动物模型最适用于可重复地模拟人类心血管疾病的病理生理过程。

本实验室采用在外侧冠状动脉（LCx）上手术放置缩窄性暗环（ameroid constrictor）的方法，以实现心肌缺血的慢性诱导。与急性结扎相比，利用该技术诱导慢性缺血具有独特优势。其一，该装置已有数十年的广泛研究文献支持⁵；此外，该方法能够可靠地模拟人类因动脉粥样硬化发展所致的冠状动脉渐进性狭窄，最终还可通过保留原本会因完全血流中断而受损的心肌，降低动物死亡率⁶。缩窄性暗环由两部分组成：外层为钛金属环，内层为吸湿性塑料材料。当其被安置于冠状动脉周围后，在2至4周内，内层材料会逐渐吸收体液，并因外部金属套管的限制而向内膨胀⁷。将该装置置于LCx处具有降低死亡率的优势，因为LCx是三条主要冠状动脉中最小的一支，其供血区域约占心肌总量的20%⁷。为一致地产生缺血区域，应在LCx起始段、即在发出钝缘支动脉之前的位置放置缩窄环。

本方案的另一重要考虑是通过冠状动脉血流显像来确认缺血的诱导以及在研究治疗手段对心肌影响时正确识别相关心肌区域。为此，我们在放置缩窄环的同时，即左回旋支（LCx）完全闭塞时，采用来自BioPhysics Assay Laboratory, Inc.的金微球进行注射。金微球定量最少的区域即代表左心室中缺血最严重的区域。在确定实验治疗所引起分子改变的过程中，血流显像的重要性不容忽视。此外，与心脏磁共振成像相比，使用同位素标记的微球是一种更为经济有效的心肌灌注检测方法⁸。

最后，本文所述模型考虑了在心血管疾病发展及后续治疗反应方面已知的性别差异。以往许多临床前动物模型未能真实反映人类群体中的差异；因此，我们在雌性猪和完整雄性猪之间匹配对照组和实验组所使用的猪的性别。我们此前已采用此方法来确定基于性别的治疗反应⁹。此外，通过随机分配治疗组以及对分析每头猪心脏功能和心肌灌注参数的研究人员实施盲法，进一步提高了本方案的可转化性。

方案

以下手术程序已获得罗德岛医院和布朗大学机构动物照护与使用委员会的批准。

1. 动物模型

1. 使用幼年雌性及完整雄性约克夏猪，理想年龄约为11周，体重通常约为15 kg。

2. 术前准备

1. 确保猪在术前1天开始至术后5天每日服用阿司匹林（10 mg/kg），术前和术后均需给药。
2. 确保猪在手术当天早晨禁食。
3. 手术当天，通过肌内注射替拉唑（telazol，4.4 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，2.2 mg/kg）诱导麻醉。
4. 使用合适尺寸（通常为7-0号）带套囊的气管导管对猪进行气管插管。
5. 同时给予布托啡诺（0.03 mg/kg）以实现镇痛，并贴敷芬太尼透皮贴剂（4 μg/kg）。
6. 在耳缘大静脉处放置20–22 G的静脉（IV）导管。
7. 以5 mL/kg/h的速度开始输注静脉液体（0.9%生理盐水）。
8. 给予头孢噻呋（ceftiofur），这是一种广谱头孢菌素类抗生素，通常在切口前30分钟内单次肌内注射给药。
9. 剃除猪手术区域（从左侧肩部至脐部）以及心电图（ECG）监测导联放置部位的毛发。
10. 将猪转运至手术室，并使用0.75–3.0%异氟烷维持麻醉。
11. 将猪连接至心电监护仪，并贴附电灼接地垫。
12. 正确摆放猪在手术台上的体位：右侧卧位，左前肢伸展并固定于手术台上，手术台右侧抬高。
13. 使用2%氯己定溶液对手术区域进行消毒擦洗。
14. 用四个小型粘贴巾和一个大型腹部手术巾覆盖切口区域。

3. 手术步骤

1. 首先在预定切口部位皮下注射2%利多卡因。
2. 然后，使用#10手术刀从腋部皮肤皱褶附近开始，斜向向外侧做一条约5 cm的切口；该切口位于第2肋骨附近^nd 至 3^rd 肋间隙
3. 使用#10手术刀继续切开，直至穿过肌层到达筋膜层。
4. 此时，使用电灼器对皮肤和肌肉进行止血。
5. 向上钝性分离筋膜层，直至可触及锁骨。
6. 一旦达到此状态，触诊肋间隙，确保第2^nd 确定肋间隙。
   注意：通常，2^nd 肋间隙可获得稍佳的视野，便于更轻松地近端放置缩窄环。有时由于猪的解剖结构特点，第3^rd 必须进入肋间隙。
7. 用电刀在肋间肌上做切口，并用大型凯利钳进入胸膜腔。
8. 使用大号凯利钳作为引导，保护肺和心包，同时用电灼器向内侧和外侧扩大切口。
9. 引入小型Finochietto拉钩以撑开肋骨。
10. 用湿纱布将肺推回左侧胸膜腔，以扩大心包的视野。
11. 使用Debakey镊子轻轻提起心包膜，用Metzenbaum剪刀做一小切口。向内侧和外侧延伸切口，以暴露左心耳。向外侧延伸时，注意识别并保护肺组织和膈神经。
12. 根据需要使用3-0丝线缝合固定心包。
13. 使用小型Satinsky钳夹住左心耳远端部分，并用0号丝线结扎该部分。用小型止血钳牵拉心耳以暴露左回旋支（LCx）和前降支（LAD）。图1A).
14. 暴露血管后，换用Gerald镊子，用Metzenbaum剪刀在左回旋支（LCx）起始部附近覆盖于左冠状动脉主干上方的 epicardial 脂肪处做一小切口。
15. 使用Allis钳夹持小号直角和花生海绵，仔细游离LCx。用直角器械环绕血管一周后，放置血管环以完全隔离。在两端各夹一个小号止血钳。
16. 此时，以 80 IU/kg 剂量对猪进行全身肝素化，以防止血栓形成。
17. 进行心肌灌注成像。
    注意：该操作需要两名助手。其中一名必须是手术室技术人员，负责计时2分钟；另一名必须是外科助手。
    1. 指导助手轻柔地收紧血管环以完全阻断LCx。通过观察心电图监测仪上的ST段和/或T波变化来确认阻断成功。
    2. 在阻塞开始后的前30秒内，使用28 G针头将5 mL金微球注入左心耳图1B将注射器回抽至注射一半的位置，以观察是否有血液回流；这一步骤至关重要，可确保针头正确位于左心房内，从而实现后续的精确定位标测。
    3. 注射完成后，使用花生海绵对注射部位加压，直至实现止血。若加压无法止血，则使用6-0聚丙烯缝线缝合一小段八字缝合线。
    4. 指导手术助手在持续观察心电图变化的同时，全程牵拉血管环2分钟，确保左回旋支（LCx）完全闭塞。
18. 在2分钟后，待心电图改变减轻后，将一个缩窄环（ameroid constrictor）放置于左回旋支（LCx）血管近端。缩窄环的尺寸根据目测确定，通常范围为2.0 mm至2.75 mm。使用Allis钳或Kelly钳夹持缩窄环可便于操作应用（图1C确保充分润滑缩窄环。
19. 让手术助手使用杰拉德钳和/或花生海绵牵开解剖所形成的囊袋，以充分暴露术区。轻柔地将缩窄环通过钥匙孔引导至动脉上，并确认钥匙孔朝向外侧旋转（图1D).
20. 确认缩窄环的位置尽可能靠近近端。这有助于保持放置位置的一致性以及后续缺血区域的均一性。
21. 移除血管环，并将硝酸甘油局部喷雾剂（约2 mL）喷洒于动脉上，以防止进一步的血管痉挛。
22. 剪断心耳处的结扎线，使其复位。
23. 使用带反向斜面（RB）针的3-0可吸收缝线连续缝合心包。
24. 记得取出湿纱布，回缩肺组织，并检查是否有损伤。
25. 使用带钝头针的0号聚对二氧环己酮缝线（PDS）重新对合肋间间隙。
26. 用3-0可吸收缝线关闭肌层，在接近闭合时，将连接负压吸引的小号红色橡胶导管插入胸膜腔。当主刀医生打紧最后一针时，嘱患者屏住呼吸，同时让助手将红色橡胶导管从胸腔内撤出。此举可确保胸膜腔内的气体被完全排出。
27. 用3-0可吸收缝线缝合皮下层，再用连续皮内缝合的4-0 Monocryl缝线缝合皮肤。
28. 在切口处覆盖无菌敷料。

4. 术后护理与恢复

1. 开始逐渐减少异氟烷的使用。
2. 在等待猪苏醒期间，用纱布和弹性绷带固定切口敷料。
3. 当猪能够自主呼吸后，拔除气管插管。
4. 将猪置于配备加热支持的软垫恢复笼中，在兽医团队的监护下进行恢复。
5. 再次强调，阿司匹林应持续使用至术后第5天，以降低血栓形成风险。术前已贴上的芬太尼透皮贴剂用于镇痛，可持续作用3天。
6. 术后3天内每日进行两次术后检查。通常情况下，猪在此期间不会出现心律失常或梗死。
   注意：需注意术后约第14天时，更易发生早期缩窄型夹闭和/或自发性室性心律失常。各研究组可考虑在此阶段使用预防性抗心律失常药物（如胺碘酮或利多卡因）进行干预，相关内容将在讨论部分进行评述。此外，可采用持续心电图监测；但该方法劳动强度较大，且在猪身上难以长期维持。

结果

经过二十多年的上述手术操作，存活率约为80%^10,11。大多数死亡病例发生在术后约2周内，通常是由于在缩窄环闭合时发生不可逆的自发性室性心律失常所致。在多次既往尸检中，典型发现为缩窄环位置正确，左心室仅有轻微的急性瘢痕形成，从而证实了室性心律失常的诊断。该心律失常可导致突发性心脏死亡，而此类事件发生在哪些动物身上极难预测。因此，我们曾考虑在术后前2周内进行持续心电图监测；然而，评估后认为，该监测所需的侵入性操作及维持适当心电图记录的工作量超过了其实际应用价值。术后2周后，存活率接近100%。

该实验流程中最重要的结果可能是心肌灌注差异图谱的绘制。金微球定量法可用于测定左心室各节段的绝对血流量，从而明确哪些节段缺血最严重，哪些节段未发生缺血。这些测量数据构成了放置冠状动脉缩窄环时所完成的心肌灌注图谱。表1展示了金微球定量后的代表性结果，其中最缺血和最非缺血的节段已突出显示。每个节段均为左心室中层心肌组织。以红色标示的区域为最严重缺血区...

讨论

使用缩窄环（ameroid constrictor）的主要优势在于其装置结构简单；然而，这种简便性也带来了局限性，即无法控制闭合速度或冠状动脉周围狭窄的程度，这可能导致心肌缺血诱导效果的变异性。替代缩窄环的方法包括使用丝线结扎、液压阻断器或连续放置血流探头^{12,13,14,15,16}。丝线结扎和阻断器常用于建立固定的狭窄模型，可精确实现特定冠状动脉的闭塞百分比，但通常伴随较高的死亡率^12,15。此外，由于植入此类装置，阻断器还可能导致动脉夹层的发生率升高¹⁴。连续使用血流探头虽可实现冠状动脉血流的标准化减少，但需要复杂的设备、多次操作以及更高的技术专长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀	Medline	MDS15310
0.9% 生理盐水	Dechra/Vetivex	17033-492-50	输注速率：术中 5 mL/kg
0 号丝线结扎线	Ethicon	SA76G	结扎左心耳
1-0 PDS II 缝线，配 CT 钝头针	Ethicon	Z359T	关闭肋间隙
2% 利多卡因	Phoenix		剂量：2–5 mg/kg
2-0 丝线缝合线，配 SH 圆锥针	Ethicon	K833H	固定心包
28 号针头	Patterson Veterinary	78032728	用于微球注射
3 支 18G 针头	Patterson Veterinary	78032793	用于抽取药物
3-0 Vicryl 缝线，配 RB 圆锥针	Ethicon	VCP215H	缝合心包
3-0 Vicryl 反向切割缝线	Ethicon	VCP442H	缝合肌肉层和深层真皮层
4-0 Monocryl 缝线	Ethicon	MCP496G	缝合皮肤
6-0 聚丙烯缝线	SharePoint	JS617N	用于心房紧急修复
所有外科器械	Steris 和 Medline	需联系销售代表	医院手术室中常见配备
Ameroid 缩窄器	Research Instruments SW, Inc.	CS-2.00-TI	类型：钛制（2.0 cm 至 3.0 cm）
镇痛药：布托啡诺	Hospira	商品名：Bupredine	剂量：0.03 mg/kg
镇痛药：芬太尼贴剂	Covetrus	77870	剂量：4 mg/kg
麻醉药：Telazol	Zoetis	（替来他明和唑拉西泮）	剂量：4.4 mg/kg
麻醉药：赛拉嗪（Rompun）	Dechra	N/A	剂量：2.2 mg/kg
4% 氯己定	BD E-Z Scrub	371073	手术区域准备
带气囊的气管插管	RUSCH	通常为 7-0 号	根据猪的体型和体重可能需要不同尺寸
心电图监测系统	MidMark	N/A	多参数监护仪
电凝设备	Bovie Specialist Pro	1250S
Excede（头孢噻呋）	Covetrus	23814	单次肌肉注射
Gold STERIspheres	BioPAL, Inc.	C-15H20	用量：每台手术 5 cc
异氟烷，USP	Dechra		剂量：0.75%–3.0%
微型白色血管环（X 射线可检测）	DeRoyal	30-711	用于隔离左回旋支（LCx）
多个 5 cc 注射器	Medline	TMOSS05L	用于多次注射
硝酸甘油	Baxter	5% 葡萄糖注射液中含硝酸甘油（200 mcg/mL）	局部喷洒 2–3 cc
红色橡胶导管	Cardinal Health	888766008	置入胸腔以排出空气
无菌手套	Encore	820955
吸引系统	GOMCO	4042	最好使用本机构的壁式吸引装置
吸引头：Yankauer	Medline	DYND50130
手术铺巾	Patterson Veterinary 普通外科手术包	78929436	4 张小粘性铺巾和 1 张大剖腹手术铺巾
外科润滑剂	SurgiLube	0281-0205-43	必须无菌
全身性肝素	Covetrus	82496	剂量：80 IU/kg
约克夏猪	CBSET, Inc.	N/A	理想年龄约为 11 周龄