大型动物慢性心肌缺血模型的终末收获流程：血流动力学表征与灌注分析

摘要

以下手术方案代表了在猪模型中成功诱导慢性心肌缺血后，为研究新型治疗方法而全面且可靠地表征心脏功能和心肌灌注的第二步及最终操作步骤。

摘要

可重复性与科研诚信是科学发现的基石，这些发现依赖于成熟、经过验证的原理和方案。此外，鉴于心血管疾病（CVD）对个体和社会造成的负担日益加重，建立可靠且经过验证的研究模型显得尤为必要。我们课题组在猪模型中采用一种双手术方案，该方案在过去二十年中不断优化：首先通过植入缩窄性狭环诱导慢性心肌缺血，以模拟人类冠状动脉疾病（CAD）的病理生理过程。第二次也是最终的手术操作，系统而严谨地采集心脏血流动力学参数及局部冠状动脉灌注数据，随后进行跳动心脏状态下的安乐死，并对心脏进行精细解剖。本实验室采用同位素标记微球法分析缺血区域的心肌血流量，以此作为评估实验性治疗药物促进侧支循环形成能力的有力手段。此外，可能也是最重要的一项可量化的心血管结局指标，我们采用左心室压力-容积（PV）环导管技术，测量多种血流动力学参数。我们希望通过详尽阐述该猪慢性心肌缺血模型的心脏分析流程，帮助其他研究人员改进并发展自身的实验方案与治疗方法，从而推动心血管疾病的防治研究。

引言

在美国，近一半的个体至少具有一种心血管疾病（CVD）的组分，这些组分构成了涉及心脏和血管的一大类疾病状态¹。预计到2060年，包含心血管疾病的多种诊断的患病率将比2025年显著上升。例如，心肌梗死的患病率预计增长30%，缺血性心脏病（IHD）增长31.3%，心力衰竭增长33%²。当结合心血管危险因素的类似预测来看，这些惊人的统计数据更加令人担忧，其中糖尿病患者的数量预计上升39.3%，血脂异常上升27.5%，高血压上升27.2%²。总体而言，这凸显了迫切需要建立可靠且可重复的研究模型，以有效探索针对心血管疾病及其危险因素的创新疗法。我们已展示了在猪体内建立的与生理状态相似的冠状动脉疾病（CAD）模型³。使用猪有助于提高研究模型在准确模拟人类CAD状况方面的有效性，而既往的临床前研究常因可转化性不足而受到批评。猪的冠状动脉解剖结构、心脏生理、心肌蛋白质组及代谢均与人类相似⁴。此外，本模型的一个关键要素是能够准确评估实验性治疗所引发的后续生理、心肌及分子层面的变化。

通常，临床试验用于实施新型药物或外科疗法，以观察其是否具有心血管方面的益处，这些益处仅通过观察获得。这一点在多项针对新型降糖药物心血管影响的里程碑式试验中尤为明显。例如，在SUSTAIN-6随机对照试验中，接受司美格鲁肽（一种胰高血糖素样肽-1（GLP-1）激动剂）治疗的2型糖尿病患者，其主要心血管不良事件的发生率低于安慰剂组⁵。另一项研究索格列净（一种双重钠-葡萄糖协同转运蛋白1和2（SGLT-1和SGLT-2）抑制剂）的随机对照试验（RCT）也观察到类似结果，显示在患有2型糖尿病、慢性肾病以及额外心血管危险因素的患者中，主要不良心血管事件有所减少⁶。这些发现对于扩大美国食品药品监督管理局（FDA）对这类疗法的批准范围、以降低心血管危险因素和疾病的发生率至关重要。然而，这些观察性发现的一个主要局限性在于，尚不清楚这些新疗法产生此类效应的具体作用机制。这正凸显了我们的模型在探索心血管疾病（CVD）新疗法潜在机制决定因素方面的科学重要性。

通过使用大型动物模型，我们能够侵入性地表征心脏功能和心肌灌注的宏观变化，同时全面了解针对实验性治疗所引发的微观分子水平的改变。我们采用压力-容积环（PV环）导管技术来确定心脏功能的变化。PV环技术是侵入性评估心室在收缩期和舒张期功能的金标准，也为比较超声心动图或心脏磁共振成像等非侵入性影像技术提供了基准⁷。该技术使我们能够获取多项测量值以确定各个血流动力学参数，并可在实时操作中重新定位导管，以确保数据采集的可重复性。需要指出的是，该技术的局限性在于难以收集纵向数据，例如基线心脏功能、缺血起始时的心功能以及治疗过程中的心功能变化。我们认为，这一不足可通过其测量负荷无关性指标的能力得到弥补，从而获得心脏内在的功能状态。此外，在确定最严重缺血区域后，使用同位素标记的微球注射有助于识别治疗药物是否带来缺血改善效益。长期以来，微球注射法已被证实能够准确反映局部心肌血流量的变化⁸。

本实验室始终使用直径为15 μm、浓度为250万个微球/mL的微球。该直径可确保心肌血流量的最精确测量，此前研究已证实，微球能够根据血流情况合理分布，且较小的直径在左心室各层之间的分布变异最小⁹。此外，为确保结果可靠，必须达到微球摄取的最低量，而本实验室所采用的高浓度条件可轻松实现这一要求。综上所述，在终末取材过程中所采用的技术能够持续且细致地分析多种实验治疗后关键的心脏生理变化。通过采集心肌组织并利用先进科技（如多组学研究）深入分析区域性的变化，可进一步强化这一表征能力，从而在心肌组织中心法则的各个层面提供可靠且定量的特征描述。

方案

本手术程序已获得罗德岛医院和布朗大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 #23-08-0005）。

1. 动物模型

1. 选择此前已在左回旋冠状动脉近端（LCx）周围放置缩窄型氨甲酰环以诱导慢性心肌缺血，并随后接受实验性治疗药物干预的约克夏猪。首次手术放置氨甲酰环与最终处死取材之间应间隔约7周。给予约2周时间使氨甲酰环完成闭合，并确保猪在之后接受实验性治疗。确保猪在最终处死取材时年龄约为18周，体重约为40 kg，并且实验组与对照组在性别上相匹配。
   注：代表性图示展示了我们所采集心脏的解剖结构，包括此前氨甲酰环的放置位置以及预期的缺血心肌区域（图1）。

2. 术前操作

1. 在手术当天早晨禁食。
2. 通过肌肉注射替拉唑（telazol，4.4 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，2.2 mg/kg）对猪进行麻醉，并使用带套囊的气管导管进行气管插管。
3. 使用丁丙诺啡（0.03 mg/kg）开始镇痛。
4. 在一只较大的耳缘静脉中放置静脉（IV）导管（20–22 G），并以约5–10 cc∙kg^-1∙h^-1的速度开始输注0.9%生理盐水。
   注意：静脉输液仅用于维持体液平衡，适用于猪的禁食状态及手术持续时间。
5. 剃除手术区域以及用于心电图监测的其他部位的毛发。
6. 将猪转运至手术台，仰卧位固定四肢，并继续使用异氟烷（0.75–3.0%）维持麻醉。
7. 开始心电图和血压监测，并在猪体表放置电刀接地垫。
8. 清洁手术区域。
   注意：本操作为终末性手术，因此无需维持无菌状态；手术区域准备和铺巾方式可根据个人习惯决定。

3. 手术步骤

1. 股动脉插管
   1. 触诊股动脉搏动。
   2. 在左侧或右侧腹股沟区域皮下注射2%利多卡因，为腹股沟切开术做准备，切口方向大致垂直于腹股沟皱襞，沿头尾方向进行。
   3. 使用#10手术刀做4-5 cm长的切口，再次保持切口方向垂直于腹股沟皱襞，从触诊到股动脉搏动的尾侧开始，向头侧延伸。（图2A）
   4. 使用电凝设备分离皮下组织，直至暴露股动脉层面。使用Weitlaner牵开器进一步撑开肌肉，充分暴露股动脉。
      注：此过程可能需要轻微分离半膜肌和股内侧肌。
   5. 使用直角钳钝性分离，环形游离股动脉周围组织。使用Metzenbaum剪刀锐性切断无法钝性分离的粘连组织。
   6. 用血管环环绕股动脉，将其隔离。
   7. 放置第二个血管环，以确保对动脉的近端和远端控制。
   8. 在插管前，系统性给予猪80 IU/kg剂量的肝素抗凝。
      注：在给予肝素及建立股动脉通路前，必须确保胸骨正中切开术和心脏暴露已完成。我们在肝素化前确认心脏已完全暴露，因为任何粘连松解都可能引起出血。肝素化的主要目的是在进入股动脉和左心室时预防血栓形成。
   9. 采用Seldinger技术，使用18G穿刺针穿刺股动脉，避免穿透动脉后壁。当回血后，将导丝经穿刺针送入动脉。撤出穿刺针，沿导丝插入7F动脉鞘。撤出导丝和血管扩张器，仅保留动脉鞘在位。
      注：股动脉可能较难穿刺，容易发生夹层。鉴于本操作为终末性实验，若发生夹层，建议使用Metzenbaum剪刀直接锐性切开股动脉，并将导丝直接插入管腔。随后可轻松沿导丝将动脉鞘送入血管。务必使用小止血钳夹闭股动脉远端部分。
   10. 确认鞘管内有血液流动。连接至Harvard Apparatus抽吸泵（图3）。
2. 胸骨正中切开术
   1. 根据参与手术的外科医生人数，此步骤可与腹股沟切开术同时进行。
   2. 皮下注射2%利多卡因，为正中胸骨切开术做准备。
   3. 使用#10手术刀从胸骨切迹至剑突做正中切口。（图2B）
   4. 使用电凝设备分离皮下组织，直至暴露胸骨，并维持止血。
   5. 使用电凝设备从侧方和下方松解剑突周围粘连组织，完全切除剑突。使用Kelly钳提起剑突，用电凝设备在其基底部水平横断。
   6. 确保胸骨切迹上方组织已充分游离，以便于切开该部分胸骨。通常需要切断部分表层的带状肌。
   7. 用手指在胸骨下方进行钝性分离。
   8. 使用Lebsche刀锐性劈开胸骨，确保沿中线进行。根据需要调整刀具角度，在到达胸骨远端最后三分之一时应缓慢操作。
      注：与人类类似，优先使用刀具而非胸骨锯，因为胸骨头侧部分倾斜角度大且较厚，使用刀具可理想地降低损伤下方大血管的风险。可在胸骨头侧下方放置纱布以保护下方大血管。
   9. 完成胸骨切开术后，钝性或锐性松解胸壁与心包或胸膜之间存在的任何粘连。
   10. 放置胸骨牵开器，撑开肋骨以暴露心脏。
   11. 使用Metzenbaum剪刀切开心包，切口向右心房延伸，并继续向尾侧延伸至左心室心尖。
   12. 继续钝性或锐性松解粘连，以暴露左、右心耳。使用Allis钳夹持花生米海绵有助于该解剖操作。
   13. 若难以解剖和识别心耳，可行胸腺切除术辅助暴露。操作时使用电凝设备切除胸腺组织。
   14. 暴露心耳后，将起搏钳分别夹在两个心耳上，并连接至单腔体外起搏器。测试起搏至150次/分钟，确保心电图上每个心跳均被捕捉。
   15. 再次通过钝性和锐性解剖，确保充分暴露左心室心尖。
   16. 最后，进入左侧胸膜腔，用大型Satinsky钳环绕下腔静脉（IVC），并用血管环隔离。
   17. 完成上述步骤后，是给予猪肝素化并建立股动脉通路的合适时机。
3. 微球注射-灌注分析
   1. 使用连接静脉输液管和三通阀的细针蝶形针穿刺左心耳。使用小止血钳引导针头并固定位置。
   2. 将注射器连接至三通阀，内含无菌肝素化生理盐水，回抽确认位置正确。若能顺利抽出血液，则位置正确。
   3. 将含有5 mL镥标记微球的注射器（浓度：250万个微球/mL）连接至三通阀。
   4. 指派手术室助手计时90秒。
   5. 启动Harvard Apparatus泵，经股动脉鞘以6.67 mL/min的速度抽取10 mL血液，同时开始计时。
   6. 在血液抽取的前30秒内，将镥标记微球注入左心耳（图4）。注射中途，通过回抽含微球的注射器确认针头位置。
   7. 完成注射后，用装有肝素化生理盐水的注射器冲洗管路，并再次确认位置正确。
   8. 90秒后，断开股动脉与抽吸泵之间的管路连接，重新连接新管路以在起搏期间获取分析数据。
   9. 开始以150次/分钟进行起搏。
   10. 重复步骤3.3.5、3.3.6和3.3.7，使用5 mL钐标记微球（浓度：2.5 × 10⁶ 个微球/mL）。
   11. 停止起搏，并断开股动脉鞘与Harvard Apparatus抽吸泵的连接。
   12. 拔出蝶形针，并施加压力以确保左心耳止血。
4. 压力-容积环导管插入术
   1. 在左心室心尖处使用4-0聚丙烯缝线做一个荷包缝合。
   2. 在缝线所包围区域的中央，采用上述Seldinger技术进入左心室并置入另一动脉鞘。
   3. 通过鞘管将校准过的带微型压力传感器的压力-容积转换导管插入左心室。将动脉鞘沿导管从左心室撤出，开始使用压力-容积测量系统记录压力波形。该波形可提示导管位置，例如是否位于主动脉、瓣膜复合体或左心室内。根据需要回撤导管，确保其位于左心室腔内，并调整位置以使压力-容积环形态合适（图5）。
      注：将鞘管从左心室撤出有助于更好地从导管获取压力-容积曲线信号，并更方便调整导管位置，以获得最佳的每条PV环形态。
   4. 在股动脉通路处放置另一根校准过的PV导管，用于获取收缩压、舒张压和平均动脉压。
   5. 当对PV环形态满意后，在静息状态下进行三次屏气操作，以减少呼吸对压力-容积环的影响。此步骤将测量多个负荷依赖性参数，如心输出量和每搏输出量。
   6. 随后，通过轻柔牵拉血管环阻断IVC，同时进行屏气操作，以获取负荷非依赖性参数，如收缩末期压力-容积关系（ESPVR）和舒张末期压力-容积关系（EDPVR）。重复该操作两次。
   7. 开始以150次/分钟起搏，并进行三次屏气操作，以表征应激状态下的心脏功能。
   8. 至此完成心脏功能表型分析。撤出两根导管，并结扎左心室上的荷包缝线。
5. 跳动状态下实施安乐死
   1. 移除起搏电极及胸腔内所有器械。
   2. 为助手提供吸引装置。
   3. 钝性分离心脏与胸壁之间的侧方粘连，确保左心室心尖可轻松向上提起。
   4. 要求麻醉团队加深镇静程度。
   5. 若上腔静脉（SVC）易于暴露，使用大型Kelly钳夹闭SVC，同时用大型Satinsky钳环绕并夹闭IVC。两者应同时夹闭。
   6. 立即使用#10手术刀将心脏从胸腔中取出，包括分离心脏与IVC、SVC、主动脉、肺动脉和肺静脉的连接。
      注：助手应持续吸引，尽可能保持术野清晰。
   7. 将心脏从胸腔取出，置于独立操作台上。
   8. 将心脏沿长轴切成两半：心尖部和基底部（图6A），以分离心室组织与心房及大血管。
   9. 将左心室与其他所有心肌组织分离。
   10. 根据各部分与左前降支冠状动脉（LAD）和后降支冠状动脉的相对位置，将每半心脏周向均匀分为12个节段，如图图6B所示。
   11. 采集其他所有心腔、瓣膜、大血管及外周组织（如胰腺、肝脏、肺、肾等）的组织样本。
   12. 每个左心室节段应取少量组织送至BioPAL用于微球定量分析。部分节段组织用福尔马林固定以供组织学分析，大部分组织则迅速浸入液氮中冷冻，用于后续分子研究。

结果

首先，通过将同位素标记的微球注入左心耳，测量局部心肌灌注。为计算心肌血流量，当采用6.67 mL/min的恒定速率抽取参考血液时，可应用以下公式：心肌血流量 = （参考血液抽取速率 [6.67 mL/min] / 组织重量）×（测定组织微球计数 / 测定血液参考微球计数）。简言之，特定心肌节段中测得的微球数量与以特定速率采集的血液中定量的微球数量之比，可推导出该心肌区域的血流速率。组织和血液干燥后，由BioPAL系统计算微球数量。静息心率时使用镥（lutetium），起搏心脏时使用钐（samarium）。在心脏起搏时使用钐是本方案中的关键步骤，因为先前研究发现，在7周的时间过程中形成的侧支血管可能足以在静息状态下恢复血流；但在应激状态下可能不足以维持充分灌注¹⁰。这一生理指标非常重要，因其对应于人类心绞痛的发作。结合首次手术期间使用金微球进行的心肌灌注成像，对最缺血区域的相对心肌血流量的评估，能够有效表征实验性疗法所诱导的侧支血管形成情况。此外，通过心肌内小动脉和毛细血管密度的组织学评估可进一步增强该表征效果。

讨论

该手术操作包含四个关键步骤：暴露心脏、股动脉插管、微球注射以进行灌注分析，以及压力-容积环数据采集。在暴露心脏时，需特别注意因先前手术可能导致明显粘连的情况。进行胸骨正中切开时，心包可能与胸壁粘连，应在开始切开胸骨前先钝性分离。当接近胸骨远端最后三分之一段时，该部分显著增厚并急剧向下倾斜。此时可在胸骨该段下方放置纱布，以增加Lebsche刀与下方大血管及无名静脉之间的距离，有助于操作。若在操作过程中损伤无名静脉，应首先施加压迫并使用吸引清除术野。一旦明确损伤部位，可采用聚丙烯缝线修补血管侧壁，或用丝线结扎该血管。此外，充分暴露双侧心耳及左心室心尖部可能较为困难。应仔细进行解剖分离，通常使用梅岑鲍姆剪刀、持针器夹持花生米状海绵以及手指钝性分离，以降低医源性心脏损伤的风险。

在股动脉插管过程中，使用针头穿刺血管可能导致血管立即发生夹层。一旦形成假腔，将几乎无法再通过塞丁格技术成功进入血管。若发生此情况，我们发现最简便的处理方法是：夹闭股动脉远端，在保持近端血管环控制的同时，锐性切断一段外观正常的血管，并将导丝置入股动脉的真腔内。这种方法避免了需要转至对侧腹股沟进行操作，手术过程可继续进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀	Medline	MDS15310
0.9% 生理盐水	Dechra/Vetivex	17033-492-50	输注速率：术中 5–10 mL/kg
18G 针头	Patterson Veterinary	78032793	用于抽取药物/微球
2% 利多卡因	Phoenix	57319-533-05	剂量：2–5 mg/kg
4-0 聚丙烯缝线	Covidien	D9H0436Y	用于荷包缝合
所有外科器械	Steris 和 Medline	需通过销售代表采购	医院手术室中常见配备
镇痛药：布托啡诺	Hospira	商品名：Bupredine	剂量：0.03 mg/kg
麻醉药：Telazol	Zoetis	（替来他明和唑拉西泮）	剂量：4.4 mg/kg
麻醉药：赛拉嗪（Rompun）	Dechra	N/A	剂量：2.2 mg/kg
动脉鞘管	Cordis	401-711M	使用 6F 或 7F；需准备两个
蝶形针输注装置	Surflo	SV-25BLK	用于微球注射；通常选用 23–25G
氯己定 4%	BD E-Z Scrub	371073	手术区域准备，可选使用
带气囊的气管插管	RUSCH	通常选用 7-0	根据猪的体型和体重可能需选用不同尺寸
心电监护系统	MidMark	N/A	多参数监护仪
电灼器	Bovie Specialist Pro	1250S	建议尽可能准备两台
异氟烷，USP	Dechra		剂量：0.75%–3.0%
笔记本电脑	HP Microsoft	N/A	可使用个人偏好的任意笔记本电脑
Lebsche 刀	Integra	300-425	N/A
镥-177 STERIspheres 微球	BioPAL, Inc.	C-15E20	用量：每台手术 5 cc
微型白色血管环（X 射线可检测）	DeRoyal	30-711	用于分离股动脉和下腔静脉
多个 5 cc 注射器	Terumo	SS-05L	用于冲洗和微球注射
起搏器	Osypka Medical	2428001	临时起搏器
PV 环路导管	Transonic	型号：FDH-5018B-E3450，序列号：50-679	用于 PV 环路数据采集
PV 环路计算机程序	Transonic Scisense	ADV500 软件	安装在个人笔记本电脑上的程序
PV 环路数据采集系统	Transonic 和 ADInstruments	型号：FY097B 和 PowerLab 8/35	连接导管与计算机
钐-153 STERIspheres 微球	BioPAL, Inc.	C-15A20	用量：每台手术 5 cc
小锤	Integra	410-335	N/A
无菌手套	Encore	820955	仍建议使用无菌手套和手术衣
无菌生理盐水	BAXTER	G171328	稀释后配制肝素化生理盐水冲洗液
吸引系统	GOMCO	4042	优先使用本机构的壁式负压吸引系统
吸引头：Yankauer	Medline	DYND50130	在切除心脏时保持术野清晰至关重要
全身性肝素	Covetrus	82496	剂量：80 IU/kg
三通接头	Jorgensen Laboratories, Inc.	200820	用于微球注射
温水浴	Fisher		用于使用前预热导管
抽吸泵	Harvard Apparatus	70-2002	以恒定速率抽取外周血
约克夏猪	CBSET, Inc.	N/A	猪只已完成初始手术操作