大型动物慢性心肌缺血模型的终末收获流程：血流动力学表征与灌注分析

摘要

以下手术方案代表了在猪模型中成功诱导慢性心肌缺血后，为研究新型治疗方法而全面且可靠地表征心脏功能和心肌灌注的第二步及最终操作步骤。

摘要

可重复性与科研诚信是科学发现的基石，这些发现依赖于成熟、经过验证的原理和方案。此外，鉴于心血管疾病（CVD）对个体和社会造成的负担日益加重，建立可靠且经过验证的研究模型显得尤为必要。我们课题组在猪模型中采用一种双手术方案，该方案在过去二十年中不断优化：首先通过植入缩窄性狭环诱导慢性心肌缺血，以模拟人类冠状动脉疾病（CAD）的病理生理过程。第二次也是最终的手术操作，系统而严谨地采集心脏血流动力学参数及局部冠状动脉灌注数据，随后进行跳动心脏状态下的安乐死，并对心脏进行精细解剖。本实验室采用同位素标记微球法分析缺血区域的心肌血流量，以此作为评估实验性治疗药物促进侧支循环形成能力的有力手段。此外，可能也是最重要的一项可量化的心血管结局指标，我们采用左心室压力-容积（PV）环导管技术，测量多种血流动力学参数。我们希望通过详尽阐述该猪慢性心肌缺血模型的心脏分析流程，帮助其他研究人员改进并发展自身的实验方案与治疗方法，从而推动心血管疾病的防治研究。

引言

在美国，近一半的个体至少具有一种心血管疾病（CVD）的组分，这些组分构成了涉及心脏和血管的一大类疾病状态¹。预计到2060年，包含心血管疾病的多种诊断的患病率将比2025年显著上升。例如，心肌梗死的患病率预计增长30%，缺血性心脏病（IHD）增长31.3%，心力衰竭增长33%²。当结合心血管危险因素的类似预测来看，这些惊人的统计数据更加令人担忧，其中糖尿病患者的数量预计上升39.3%，血脂异常上升27.5%，高血压上升27.2%²。总体而言，这凸显了迫切需要建立可靠且可重复的研究模型，以有效探索针对心血管疾病及其危险因素的创新疗法。我们已展示了在猪体内建立的与生理状态相似的冠状动脉疾病（CAD）模型³。使用猪有助于提高研究模型在准确模拟人类CAD状况方面的有效性，而既往的临床前研究常因可转化性不足而受到批评。猪的冠状动脉解剖结构、心脏生理、心肌蛋白质组及代谢均与人类相似⁴。此外，本模型的一个关键要素是能够准确评估实验性治疗所引发的后续生理、心肌及分子层面的变化。

通常，临床试验用于实施新型药物或外科疗法，以观察其是否具有心血管方面的益处，这些益处仅通过观察获得。这一点在多项针对新型降糖药物心血管影响的里程碑式试验中尤为明显。例如，在SUST....

方案

本手术程序已获得罗德岛医院和布朗大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 #23-08-0005）。

1. 动物模型

1. 选择此前已在左回旋冠状动脉近端（LCx）周围放置缩窄型氨甲酰环以诱导慢性心肌缺血，并随后接受实验性治疗药物干预的约克夏猪。首次手术放置氨甲酰环与最终处死取材之间应间隔约7周。给予约2周时间使氨甲酰环完成闭合，并确保猪在之后接受实验性治疗。确保猪在最终处死取材时年龄约为18周，体重约为40 kg，并且实验组与对照组在性别上相匹配。
   注：代表性图示展示了我们所采集心脏的解剖结构，包括此前氨甲酰环的放置位置以及预期的缺血心肌区域（图1）。

2. 术前操作

1. 在手术当天早晨禁食。
2. 通过肌肉注射替拉唑（telazol，4.4 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，2.2 mg/kg）对猪进行麻醉，并使用带套囊的气管导管进行气管插管。
3. 使用丁丙诺啡（0.03 mg/kg）开始镇痛。
4. 在一只较大的耳缘静脉中放置静脉（IV）导管（20–22 G），并以约5–10 cc∙kg^-1∙h^-1的速度开始输注0.9%生理盐水....

结果

首先，通过将同位素标记的微球注入左心耳，测量局部心肌灌注。为计算心肌血流量，当采用6.67 mL/min的恒定速率抽取参考血液时，可应用以下公式：心肌血流量 = （参考血液抽取速率 [6.67 mL/min] / 组织重量）×（测定组织微球计数 / 测定血液参考微球计数）。简言之，特定心肌节段中测得的微球数量与以特定速率采集的血液中定量的微球数量之比，可推导出该心肌区域的血流速率。组织和血液干燥后，由BioPAL系统计算微球数量。静息心率时使用镥（lutetium），起搏心脏时使用钐（samarium）。在心脏起搏时使用钐是本方案中的关键步骤，因为先前研究发现，在7周的时间过程中形成的侧支血管可能足以在静息状态下恢复血流；但在应激状态下可能不足以维持充分灌注¹⁰。这一生理指标非常重要，因其对应于人类心绞痛的发作。结合首次手术期间使用金微球进行的心肌灌注成像，对最缺血区域的相对心肌血流量的评估，能够有效表征实验性疗法所诱导的侧支血管形成情况。此外，通过心肌内小动脉和毛细血管密度的组织学评估可进一步增强该表征效果。

讨论

该手术操作包含四个关键步骤：暴露心脏、股动脉插管、微球注射以进行灌注分析，以及压力-容积环数据采集。在暴露心脏时，需特别注意因先前手术可能导致明显粘连的情况。进行胸骨正中切开时，心包可能与胸壁粘连，应在开始切开胸骨前先钝性分离。当接近胸骨远端最后三分之一段时，该部分显著增厚并急剧向下倾斜。此时可在胸骨该段下方放置纱布，以增加Lebsche刀与下方大血管及无名静脉之间的距离，有助于操作。若在操作过程中损伤无名静脉，应首先施加压迫并使用吸引清除术野。一旦明确损伤部位，可采用聚丙烯缝线修补血管侧壁，或用丝线结扎该血管。此外，充分暴露双侧心耳及左心室心尖部可能较为困难。应仔细进行解剖分离，通常使用梅岑鲍姆剪刀、持针器夹持花生米状海绵以及手指钝性分离，以降低医源性心脏损伤的风险。

在股动脉插管过程中，使用针头穿刺血管可能导致血管立即发生夹层。一旦形成假腔，将几乎无法再通过塞丁格技术成功进入血管。若发生此情况，我们发现最简便的处理方法是：夹闭股动脉远端，在保持近端血管环控制的同时，锐性切断一段外观正常的血管，并将导丝置入股动脉的真腔内。这种方法避免了需要转至对侧腹股沟进行操作，手术过程可继续进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#10 手术刀	Medline	MDS15310
0.9% 生理盐水	Dechra/Vetivex	17033-492-50	输注速率：术中 5–10 mL/kg
18G 针头	Patterson Veterinary	78032793	用于抽取药物/微球
2% 利多卡因	Phoenix	57319-533-05	剂量：2–5 mg/kg
4-0 聚丙烯缝线	Covidien	D9H0436Y	用于荷包缝合
所有外科器械	Steris 和 Medline	需通过销售代表采购	医院手术室中常见配备
镇痛药：布托啡诺	Hospira	商品名：Bupredine	剂量：0.03 mg/kg
麻醉药：Telazol	Zoetis	（替来他明和唑拉西泮）	剂量：4.4 mg/kg
麻醉药：赛拉嗪（Rompun）	Dechra	N/A	剂量：2.2 mg/kg
动脉鞘管	Cordis	401-711M	使用 6F 或 7F；需准备两个
蝶形针输注装置	Surflo	SV-25BLK	用于微球注射；通常选用 23–25G
氯己定 4%	BD E-Z Scrub	371073	手术区域准备，可选使用
带气囊的气管插管	RUSCH	通常选用 7-0	根据猪的体型和体重可能需选用不同尺寸
心电监护系统	MidMark	N/A	多参数监护仪
电灼器	Bovie Specialist Pro	1250S	建议尽可能准备两台
异氟烷，USP	Dechra		剂量：0.75%–3.0%
笔记本电脑	HP Microsoft	N/A	可使用个人偏好的任意笔记本电脑
Lebsche 刀	Integra	300-425	N/A
镥-177 STERIspheres 微球	BioPAL, Inc.	C-15E20	用量：每台手术 5 cc
微型白色血管环（X 射线可检测）	DeRoyal	30-711	用于分离股动脉和下腔静脉
多个 5 cc 注射器	Terumo	SS-05L	用于冲洗和微球注射
起搏器	Osypka Medical	2428001	临时起搏器
PV 环路导管	Transonic	型号：FDH-5018B-E3450，序列号：50-679	用于 PV 环路数据采集
PV 环路计算机程序	Transonic Scisense	ADV500 软件	安装在个人笔记本电脑上的程序
PV 环路数据采集系统	Transonic 和 ADInstruments	型号：FY097B 和 PowerLab 8/35	连接导管与计算机
钐-153 STERIspheres 微球	BioPAL, Inc.	C-15A20	用量：每台手术 5 cc
小锤	Integra	410-335	N/A
无菌手套	Encore	820955	仍建议使用无菌手套和手术衣
无菌生理盐水	BAXTER	G171328	稀释后配制肝素化生理盐水冲洗液
吸引系统	GOMCO	4042	优先使用本机构的壁式负压吸引系统
吸引头：Yankauer	Medline	DYND50130	在切除心脏时保持术野清晰至关重要
全身性肝素	Covetrus	82496	剂量：80 IU/kg
三通接头	Jorgensen Laboratories, Inc.	200820	用于微球注射
温水浴	Fisher		用于使用前预热导管
抽吸泵	Harvard Apparatus	70-2002	以恒定速率抽取外周血
约克夏猪	CBSET, Inc.	N/A	猪只已完成初始手术操作