本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。
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本文内容
摘要
摘要
神经系统对肿瘤微环境的贡献，以及神经侵袭作为癌症扩散途径的重要性，正日益受到关注。癌细胞与神经元之间的相互作用可促进癌细胞在神经周围及神经内侵袭，这是多种癌症的共同特征，且常伴随不良的临床预后。体外模型可用于研究神经元与癌细胞之间的双向相互作用，为理解癌症扩散机制并探索干预策略提供了重要工具。
在此，我们描述了一种小鼠背根神经节（DRG）分离的实验方案，以及整体组织培养和解离单层培养体系的建立方法，可用于随时间观察神经元形态及神经突的生长情况。将完整的DRG置于Matrigel中进行整体培养，可在更接近体内异质性环境的条件下维持神经结构及其对刺激的反应能力 体内 神经，而分离的神经培养则更便于评估细胞间的直接相互作用。一旦建立背根神经节（DRG）培养，即可加入癌细胞以构建共培养体系，用于观察癌细胞对神经突生长及神经形态变化的影响。此外，还可评估癌细胞在神经源性信号作用下，或在促生长或抑生长条件下随时间推移的生长或运动能力变化，并可视化癌细胞与神经突起直接接触所产生的效应。
由于两种共培养模型可同时构建，本方案能够更全面地揭示癌症细胞与神经元相互作用的影响，并有助于比较不同处理条件，整合来自细胞水平和完整神经节水平的信息。该方案将促进神经-肿瘤相互作用的研究，可用于多种应用，包括细胞信号传导研究、药物筛选，或肿瘤-神经微环境异质性及肿瘤沿神经扩散机制的研究。
引言
肿瘤通过局部侵袭以及区域或远处转移而发生播散，是癌症相关死亡的主要原因。尽管研究多集中于肿瘤细胞经血管或淋巴管途径扩散，但在许多实体瘤中，包括胰腺癌1,2、前列腺癌3、头颈部肿瘤4、乳腺癌5和结直肠癌6，均常观察到肿瘤细胞的神经侵袭现象。近年来，大量研究揭示了神经在促进肿瘤生长与进展中的新兴作用，并作为肿瘤播散的途径，推动转移灶的形成7,8。在此背景下，癌症神经科学作为一个重要的研究领域应运而生，通过阐明肿瘤细胞与周围神经系统（PNS）基本组分之间的相互作用，为肿瘤学提供了新的研究视角，这些相互作用可能参与上述过程8,9。
周围神经系统（PNS）由外周神经和神经节组成，这些是包含多种细胞类型的异质性结构，包括大小和功能各异的神经元、施万细胞及其他胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、肥大细胞、黑色素细胞以及形成局部脉管系统的血管内皮细胞
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方案
所有小鼠实验均经皇后大学动物护理委员会办公室审查并批准（方案编号 2524）。动物的饲养和安乐死以获取组织的过程均遵循加拿大动物护理委员会以及英国研究中动物替代、优化与减少国家中心（National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction on Animals in Research）的伦理指南。在本方案中，我们使用了从 C57BL/6 动物分离的组织，但也成功应用了其他基因型，包括 Rag2IL2Rγc 基因敲除动物。第 1 至第 6 部分可在经表面消毒的实验台上的洁净环境中进行（见图 1），而第 7 至第 9 部分必须在生物安全柜中操作。为了便于理解，我们绘制了相关步骤的示意图（图 1）。
1. 储备液的配制
- 配制木瓜蛋白酶溶液和胶原酶IV/分散酶II溶液。将木瓜蛋白酶溶于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为30 U/mL；分装为1 mL等份，于-20 °C保存。将IV型胶原酶溶于PBS中至1.25 mg/mL，分散酶II溶于PBS中至2.5 mg/mL，分装为1 mL等份，于-20 °C保存。
- 配制含补充成分的Neurobasal培养基（F12），添加2% B27补充剂（50倍浓缩液）、10%胎牛血清（F....
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结果
本方案描述了原代小鼠背根神经节（DRG）来源细胞的分离方法，以及两种互补培养模型的建立：解离的DRG培养和整体安装的DRG培养，这两种模型使我们能够在不同复杂程度下研究神经细胞与癌细胞之间的相互作用。本方案的一个关键优势在于，两种类型的培养物均可来自同一动物的DRG，从而最大限度地减少个体间和实验间的变异性，并使各模型产生的信息更易于整合，从而更全面地揭示细胞动态及细胞间相互作用。这些培养模型可适用于多种应用，但本文重点介绍其在癌症-神经相互作用研究中的应用。
本方案提供了一种高效的流程，用于背根神经节（DRG）的解剖、提取，并将具有活性的DRG与癌细胞进行共培养，同时保持DRG结构完整性，并最大化DRG来源细胞的存活率（图1）。然而，由于在初始解剖步骤中可能携带毛发残留，DRG培养物容易受到污染，从而影响长期培养的成功率，因此防止污染的策略至关重要。在完成初始切口后、尚未直接接触DRG前，更.......
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讨论
本文所述方案介绍了建立背根神经节（DRG）原代神经二维（2D）和三维（3D）培养及其与癌细胞共培养应用的改进方法。该方案在先前方法的基础上进行了提升，能够同时平行建立2D和3D两种模型。由于2D和3D模型使用来自相同动物的原代神经同时建立，因此最大限度地减少了个体间和实验间的变异，使得两种模型的数据更易于比较或整合，从而有助于对细胞行为和复杂组织反应进行互补性观察。本方案进一步优化了神经解剖和解离条件，以在添加肿瘤细胞前最大程度地促进神经突生长及神经微环境的成熟。我们还提供了额外的方法学细节，以应对常见的技术难题，减少污染，并提高培养建立的效率，确保实验条件的可重复性，并拓展该方案在不同实验模型中的适用性。在这方面，我们已成功利用该方案从多种遗传背景的小鼠中建立神经培养，并在野生型近交系或远交系（如C57BL/6、CD-1）以及免疫缺陷动物（如Rag2IL2Rγc KO）中获得了类似成功，证实了该方法具有广泛的适用性。
尽管将完整脊神经节（DRG）包埋于Matrigel液滴中进行整体封片可实现在复杂的三维环境中研究生物学机制，但分离的DRG培养则使我们能够观察单个细胞的行为与结构，.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research，项目编号：PJT-178274）（LMM）的运营资助，安大略省研究生奖学金（LCBO）以及巴西高等教育人员改善协调机构（Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel - Brazil，CAPES）奖学金（资助代码：001）（ERP）的支持。LMM 是女王大学遗传学与分子医学领域的 Bracken 讲席教授。部分图像使用 Biorender 软件生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>工具 | |||
| 70 µm细胞滤筛 | Progene | 71-229483-ULT | 用于过滤细胞悬液 |
| 8孔玻璃底板载玻片 | IBidi，德国慕尼黑 | 80807 | |
| Dumont #5 细镊子 | Fine Science Tools，美国福斯特城 | 11254-20 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools，美国福斯特城 | 11252-20 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools，美国福斯特城 | 91460-11 | |
| 图案镊子 | Fine Science Tools，美国福斯特城 | 91121-12 | |
| 弹簧剪 | Fine Science Tools，美国福斯特城 | 91500-09 | |
| <强>试剂 | |||
| 1×磷酸盐缓冲液 | Sigma，美国密苏里州圣路易斯 | D8662-500ML | 用于溶解酶 |
| B-27添加剂（50倍浓缩） | 美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司 | 17504044 | 在F12培养基中以2%浓度使用 |
| 牛I型胶原蛋白 | 康宁公司，美国纽约 | 354231 | 用于包被板，工作液浓度为50 µg/mL，溶于 0.01 M HCl |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | C4-BIOC | 用 PBS 溶解至 1.25 mg/mL，分装，-20 ℃ 保存 °C |
| Dispase II | 罗氏，巴塞尔，瑞士 | 4942078001 | 用 PBS 溶解至 2.5 mg/mL，分装，-20 ℃ 保存 °C |
| DNase I | 罗氏公司，巴塞尔，瑞士 | 11284932001 | 最终浓度添加 解离过程中 0.2 mg/mL |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国 | F1051 | 在F12培养基中以10%浓度使用 |
| HBSS（Hank氏平衡盐溶液） | Sigma，美国密苏里州圣路易斯 | H6648-500ML | 用含1%青霉素-链霉素的溶液配制 |
| 基质胶生长因子减少型 | 康宁公司，美国纽约 | 356231 | 4℃解冻 °4°C 过夜，置于冰上 |
| Ham/F-12 营养混合物 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | N6658-500ML | 制备添加物培养基的基础培养基 |
| 木瓜蛋白酶 | 罗氏公司，巴塞尔，瑞士 | 10108014001 | 用 PBS 溶解至 30 U/mL，分装，-20 保存 °C |
| 青霉素-链霉素（100倍浓缩液） | Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国 | P4333-100ML | 在培养基中以1%浓度使用 |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国 | T8154-100ML | 评估细胞活力 |
| TrypLE Express | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州 | 12605-028 | 用于收集癌细胞 |
| <强>抗体 | |||
| β-微管蛋白III抗体 | Abcam（英国剑桥） | AB15568 | 稀释比例 1:200 |
| Alexa Fluor 488 | 美国马萨诸塞州，赛默飞世尔科技公司 | A-11008 | 稀释比例 1:2000 |
| Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州 | A-21442 | 稀释比例 1:2000 |
| Alexa Fluor 647 | 美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司 | A-21245 | 稀释比例 1:2000 |
| NeuN 抗体 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国 | MAB377 | 稀释比例 1:100 |
| <强>荧光染料 &和探针 | |||
| ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂（Phalloidin） | 美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司 | R37110 | 稀释比例 1:40 |
| CellTrace 钙黄绿素红-橙 | 美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司 | C34851 | 使用细胞示踪剂在荧光显微镜下观察神经元 |
| Hoechst 33342 | 美国马萨诸塞州赛默飞世尔科技公司 | H3570 | 稀释比例 1:5000 |
参考文献
- Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
- Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 ....
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