本文介绍了一种创新的方法，用于构建可扩展的脑组织基质，以制备新生仔猪脑组织的冠状切片或矢状切片。该方法成本低廉，利用琼脂糖凝胶脑模的模板加工丙烯酸板，适用于多种物种，并可根据脑组织的生长进行扩展。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，新生仔猪作为新生儿发育与病理研究模型的兴趣日益增加，这促使人们需要一种能够精确获取组织学切片的脑部切片矩阵。然而，新生脑组织的快速生长限制了 commercially available（商用）切片矩阵的有效使用时间，仅适用于狭窄的发育阶段。因此，本研究开发了一种可调节的脑切片矩阵构建方法。首先，将一个玻璃容器置于湿冰上，并在底部铺一层4%琼脂糖凝胶。随后，将经福尔马林固定的脑组织放置于该凝胶层上，并用4%琼脂糖凝胶包埋。待凝胶完全凝固后，小心去除脑组织上方多余的凝胶，然后取出脑组织。将留下的空腔用含2%印度墨水的4%琼脂糖凝胶填充。待其再次凝固后，将凝胶块按所需厚度（2 mm 或 5 mm）和方向（冠状面或矢状面）切成相应切片，并在比例纸上打印出脑组织模板。将这些模板复制到一系列透明丙烯酸板（厚度为2 mm 或 5 mm）上，并使用带锯按轮廓切割。最后，通过预先钻好的对准孔，用三组螺栓和螺母将各板组装并固定，从而构建出可定制的脑切片矩阵。本文展示了针对出生后第5天仔猪脑组织的冠状面和矢状面切片矩阵的构建过程（步进厚度为2 mm），以及针对出生后第32至38天仔猪脑组织的冠状面切片矩阵（步进厚度为5 mm）。通过增加或移除适当的丙烯酸板，该矩阵可调节以适应不同大小的仔猪脑组织。因此，本研究向神经科学研究领域介绍了一种简单且成本低廉的方法，可用于为不同体型的大型动物定制脑切片矩阵。
引言
仔猪的大脑发育过程与人类高度相似1,2,3,4。因此，使用仔猪开展神经发育障碍、新生儿及儿科疾病和损伤的临床前研究正受到越来越多的关注（图1A，B）5,6,7,8,9,10。如图1所示，作为大型动物模型，新生仔猪的颅骨和脑部大小更接近早产人类胎儿（图1A，B），而成年小鼠和大鼠的颅骨至少小两个数量级。
然而，与更常用的啮齿类模型相比，使用较大型哺乳动物进行生物医学研究存在一些挑战。新生仔猪的大脑在出生后的前3个月内生长迅速。在出生后的前5周内，仔猪大脑的重量几乎增加一倍，体积则增至原来的三倍（图1C）4,11,12,13。在出生后第5天至第38天（p5至p38）期间，大脑的生长以及脑回和脑沟的发育尤为显著（图1C）。p5仔猪大脑的重量和体积分别为29.5 g和18.9 mL，而两只p32仔猪的大脑重量分别为51.4 g和52.6 g，体积分别为49.6 mL和53.5 mL。到第38天时，大脑生长至53.7 g和52.5 mL，与p5相比，重量增加了80%，体积增加了170%。新生仔猪大脑的这种快速生长给使用单一脑切片模具对不同年龄、品系或性别的仔猪大脑进行精确组织学切片带来了挑战。
商品化的仔猪脑切片模具每个价格约为1000至3600美元，仅提供一种尺寸，专为2周龄及以下的仔猪设计。尽管已有少数研究利用3D扫描和3D打印技术为斑马鱼、小鼠和鸟类制作了多种脑切片模具14,15,16，但这些模具的规模相对较小。目前尚无针对新生仔猪（尤其是2周龄及以下）的标准化MRI成像序列或详细的脑部生长图表。因此，我们基于采集自出生后第5天至第38天的仔猪脑组织，制作了多个脑切片模板，并据此建立了一套可调节的脑切片模具系统。
本方案描述了一种建立新生仔猪脑模板的创新方法，并开发了基于丙烯酸板的可定制脑切片矩阵构建技术，可用于不同大小脑组织的冠状面或矢状面切片。
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方案
本文中，四只仔猪脑组织在实施人道安乐死后获取，并进行组织学染色前的处理。安乐死操作遵循肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准的另一项研究方案。所有涉及动物的实验程序均已获得批准，并采取了适当的动物护理措施，以尽量减少治疗或安乐死过程中可能引起的应激或疼痛。
1. 动物
- 获取四只新生（出生后第4天，p4）未经处理的雄性仔猪（体重1.5–1.8 kg），其遗传背景为62.5%长白猪、25%大白猪和12.5%约克夏猪。
- 将动物集中饲养在猪舍内的专用房间中，使用加热灯并铺设毛巾覆盖的地面以提供保暖。喂食它们 随意摄取 第一周使用代乳粉喂养，2至3周时逐渐过渡到颗粒饲料。
- 在异氟烷麻醉下监测生理活动和体重，并每周进行一次MRI扫描。
- 以戊巴比妥钠过量实施安乐死，随后经心脏灌注肝素化生理盐水，再灌注10%中性缓冲甲醛。
- 从颅骨中取出大脑17用甲醛固定过夜，然后置于含30%蔗糖的PBS溶液中3天以进行冷冻保存。
2. 琼脂糖凝胶制备
- 浸入一个 将玻璃容器放入装有湿冰的桶中，至其高度的一半图 2A).
- 使用一个 使用重型塑料条作为容器内衬，确保底部和侧壁完全覆盖，两端至少高出容器顶部边缘5 cm。
- 将 150 mL PBS 加入玻璃烧杯中，加热至 90 °C °在磁力搅拌器上加热 PBS 溶液，并逐渐加入 6 g 琼脂糖，溶解后制成 4% 琼脂糖凝胶。
- 将0.5–1 cm厚的液体倒入玻璃容器中（图2B）并等待其凝固。
- 在脑组织表面局部涂抹一层薄薄的矿物油（图 2C）并将脑组织置于凝胶层上（图 2D).
- 让琼脂糖溶液冷却至 50 °C. 用冷却的琼脂糖凝胶包埋脑组织图2E）并静置使其凝固（图2F），通常在湿冰上放置约10分钟。
- 小心移除脑组织上方的琼脂糖凝胶顶层（图2G) 用外科探针探查并从已固化的模具中取出脑组织（图 2H，I).
- 将98 mL PBS加入另一玻璃烧杯中，加热至90 °在带有磁力搅拌器的搅拌加热板上，加入 4 g 琼脂糖和 2 mL 墨汁，搅拌并充分混匀。将含 2% 墨汁的 4% 琼脂糖倒入脑组织取出后留下的空腔中图2J）直至完全溶解，并在湿冰上静置15分钟使其完全凝固（图 2K).
- 使用塑料条的悬垂部分，提起塑料条，将整个琼脂糖块从容器中取出（图2L).
3. 琼脂糖凝胶块切片及模板转印至比例纸
- 为防止切片过程中纸张受潮，将一张称量纸夹在两块厚度为 0.76 mm（0.03"）的透明丙烯酸板之间（图 3A），并将该层压的纸-丙烯酸板组件放置在实验台边缘附近。
- 用夹子将角块固定在实验台上适当位置，使两块厚度为 5 mm 的丙烯酸板竖直立起，并牢固夹住凝胶块，保持所需的取向（如 图 3 所示的矢状方向）。确保每块 垂直丙烯酸板 的边缘 与称量纸上的同一条线对齐，作为切割凝胶块的参考线。在即将进行切片的相反端，使用 重物固定凝胶块（图 3B）。
- 以底层的称量纸为引导，将凝胶块从丙烯酸板之间向前移动设定的步长（2 mm 或 5 mm），双手握住切片刀，切下丙烯酸板前缘之外的部分（图 3B）。
- 收集每一片切片（图 3C），将其放置在另一张称量纸上（图 3D），轻轻按压铸型上印度墨水染色的部分，使其轮廓转印到称量纸上（图 3E），用笔描出整个凝胶切片的轮廓，移开凝胶切片后，再用笔描出印度墨水印迹的轮廓（图 3F）。注意保持每张切片及其复制模板的方向一致。
- 重复步骤 2.3 和 2.4，直至所有凝胶块均被复制到称量纸上并按顺序编号。重新检查各切片及其印迹（图 3G、H 中为冠状切片及印迹的代表性图像）。
4. 丙烯酸板雕刻
- 使用有机玻璃切割刀在大块丙烯酸板上切出凹槽，并将大板折断成 10 × 8.5 cm 的小片。
注意：所需小片总数取决于脑组织的大小、期望的切片厚度以及切片方向。通常情况下，我们为新生仔猪脑的冠状面或矢状面切片矩阵准备 25 片 2 mm 厚的丙烯酸板，为较大的脑组织准备 15 片 5 mm 厚的板，以便于操作。 - 以丙烯酸板左下角为原点（单位：mm），标记三个固定孔的位置，其 x、y 坐标分别为：(11, 42)；(45, 15)；和 (88, 42)。
- 利用角块和夹具将丙烯酸板固定在钻床平台上。按照上述坐标，使用丙烯酸板专用钻头钻出三个固定孔（图 4A）。在所有板的右侧画一条彩色线，以指示方向。
- 撕去丙烯酸板上的保护膜，将其放置在比例纸上已绘制的模板上方，使丙烯酸板的上边缘与比例纸上模板的顶线对齐。用永久性记号笔将脑轮廓描画到丙烯酸板上（图 4B）。按照模板顺序对各板进行编号。
- 在带锯上沿模板线条切割丙烯酸板（图 4C）。也可使用配备多功能切割套件和木雕钻头的旋转工具去除多余部分。
- 使用配备抛光砂磨头的旋转工具打磨切割边缘，使切割工具留下的边缘变得光滑（图 4D）。
- 将切割后的丙烯酸板与比例纸上的模板再次比对（图 4E），必要时进行修整和抛光。
- 将切割好的板按顺序叠放，预组装成矩阵，并检查各板之间的对齐情况（图 4F）。
5. 脑基质的组装与扩增
- 在亚克力板之间放置三个垫圈，每个垫圈居中对准一个固定孔（图5A）。在所有亚克力板的同一侧，使用强力胶将垫圈围绕固定孔粘合，以减少组装时间（图5A）。
- 依次堆叠亚克力板，通过每个固定孔插入不锈钢螺栓以组装矩阵，并拧紧螺母以固定（图5A）。
- 对将与脑组织接触的切割边缘进行最终抛光，使各板之间的边缘平滑过渡。
- 对矩阵顶部进行颜色编码，以帮助在切片过程中识别步骤。交替将板的顶部边缘涂成黑色、红色，然后留白，形成特定图案。重复此步骤，直至所有板均按相同图案完成颜色编码（图5）。
- 为调整几何结构或改变腔体尺寸以更好地适配特定脑组织，可移除或添加选定的亚克力板（图5B），以适应不同大小的脑组织，从而显著提高这些矩阵的灵活性，并节省材料与操作成本。
6. 脑组织的冠状面或矢状面切片
- 用实验室胶带将高剖面冷冻切片刀的一端包裹至少2厘米，以保护使用者的手。将脑组织牢固地放入切片模具的腔室内。手握刀片的包裹端，小心放置 将刀片置于矩阵的亚克力板之间，然后切片 用另一只手固定并支撑大脑，将大脑切成冠状面或矢状面切片（图6A，B).
注意： 注意：1） 由于脑部各区域在福尔马林固定后具有不同的质地，因此在使用刀片时应小心施加均匀的压力。 2) 此外，仔猪的大脑体积较大，因此在切割时采用切片动作比直接切割更为合适 "下推" 切割运动 3) 在切割过程中，必须用另一只手支撑，使脑组织紧密贴合于切片矩阵中，以避免任何倾斜或方向改变。应始终避免对脑组织施加过大的压力。 - 将所有切片放入盛有PBS的6孔板或不锈钢托盘中。小心地将切片以相同的方向摆放图6C，D）并根据需要进行保存或后续处理。
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结果
一只仔猪在出生后第5天（p5）因过量戊巴比妥钠实施安乐死。其余三只动物表现出正常的生理活动，并具有相似的体重增长（达到7.44–8.4 kg）。其中两只仔猪在异氟烷麻醉下每周接受一次MRI扫描，直至出生后第32天（p32）实施安乐死。第四只仔猪则一直未接受干预，直至出生后第38天（p38）实施安乐死。
新生仔猪与人类胎儿在头颅尺寸上的相似性可在图1A、B中直观体现，其尺寸至少比啮齿类大两个数量级。在图1C中可观察到新生仔猪在出生后最初几周内显著的脑部生长和皮层发育。
图2 展示了使用墨汁染色琼脂糖凝胶进行脑组织塑形的每一步骤。将涂有矿物油的脑组织首先包埋于琼脂糖凝胶中，随后取出，形成空腔后，再将该空腔填充入墨汁染色的琼脂糖凝胶。
接下来，将琼脂糖凝胶按所需的厚度...
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讨论
本方案介绍了一种经济实惠且易于构建的脑组织切片矩阵的制备方法，可用于辅助对仔猪或其他大型动物脑组织进行特定方向和厚度的切片。重要的是，与仅适用于有限脑尺寸范围的商用“固定尺寸”矩阵不同，该方法可方便地调节或扩展矩阵尺寸，以适配多种不同大小的脑组织。在本研究中，一个最初为30 g仔猪脑设计的矩阵被成功扩展，以容纳体积大80%的脑组织，并实现紧密贴合，从而确保精确的脑切片。建议在对矢状切片矩阵进行丙烯酸板增减操作时，应保持对称，以维持脑中线方向；但对于冠状切片矩阵，则不必严格对称，因为脑区各部分的生长比例相对不均。此外，该矩阵制备方法还可应用于其他大型动物物种，如猴、羊、犬、猫和雪貂。
在当前的方法中，使用脑铸型来制作模板。另一种替代方法是利用磁共振成像（MRI）图像生成系列模板。此前已获取了多项用于研究仔猪脑发育的纵向MRI扫描数据2，部分数据也来自本研究。尽管MRI是一种研究脑解剖结构与发育的高精度且灵活的方法2，但现有的猪脑MRI图像数据库仅涵盖2至24周龄阶段
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）#R21-NS114771（K.E.S.）， #R56-NS117587、#R01-EB028792、#R01-HD101508、#R21-HD091118、#R41-NS122722、#R42-MH135825（G. Y.）、美国心脏协会（AHA）#16GRNT30820006（G.Y.）和#14SDG20480186（L.C.），以及肯塔基大学神经科学重点研究领域项目（L.C.）资助。未经处理的雄性新生猪通过肯塔基大学医学院实验动物资源部（DLAR）从该校农业学院养猪中心购得。
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材料
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参考文献
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