本文介绍了一种创新的方法，用于构建可扩展的脑组织基质，以制备新生仔猪脑组织的冠状切片或矢状切片。该方法成本低廉，利用琼脂糖凝胶脑模的模板加工丙烯酸板，适用于多种物种，并可根据脑组织的生长进行扩展。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，新生仔猪作为新生儿发育与病理研究模型的兴趣日益增加，这促使人们需要一种能够精确获取组织学切片的脑部切片矩阵。然而，新生脑组织的快速生长限制了 commercially available（商用）切片矩阵的有效使用时间，仅适用于狭窄的发育阶段。因此，本研究开发了一种可调节的脑切片矩阵构建方法。首先，将一个玻璃容器置于湿冰上，并在底部铺一层4%琼脂糖凝胶。随后，将经福尔马林固定的脑组织放置于该凝胶层上，并用4%琼脂糖凝胶包埋。待凝胶完全凝固后，小心去除脑组织上方多余的凝胶，然后取出脑组织。将留下的空腔用含2%印度墨水的4%琼脂糖凝胶填充。待其再次凝固后，将凝胶块按所需厚度（2 mm 或 5 mm）和方向（冠状面或矢状面）切成相应切片，并在比例纸上打印出脑组织模板。将这些模板复制到一系列透明丙烯酸板（厚度为2 mm 或 5 mm）上，并使用带锯按轮廓切割。最后，通过预先钻好的对准孔，用三组螺栓和螺母将各板组装并固定，从而构建出可定制的脑切片矩阵。本文展示了针对出生后第5天仔猪脑组织的冠状面和矢状面切片矩阵的构建过程（步进厚度为2 mm），以及针对出生后第32至38天仔猪脑组织的冠状面切片矩阵（步进厚度为5 mm）。通过增加或移除适当的丙烯酸板，该矩阵可调节以适应不同大小的仔猪脑组织。因此，本研究向神经科学研究领域介绍了一种简单且成本低廉的方法，可用于为不同体型的大型动物定制脑切片矩阵。
引言
仔猪的大脑发育过程与人类高度相似1,2,3,4。因此，使用仔猪开展神经发育障碍、新生儿及儿科疾病和损伤的临床前研究正受到越来越多的关注（图1A，B）5,6,7,8,9,10。如图1所示，作为大型动物模型，新生仔猪的颅骨和脑部大小更接近早产人类胎儿（图1A，B），而成年小鼠和大鼠的颅骨至少小两个数量级。
然而，与更常用的啮齿类模型相比，使用较大型哺乳动物进行生物医学研究存在一些挑战。新生仔猪....
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方案
本文中，四只仔猪脑组织在实施人道安乐死后获取，并进行组织学染色前的处理。安乐死操作遵循肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）已批准的另一项研究方案。所有涉及动物的实验程序均已获得批准，并采取了适当的动物护理措施，以尽量减少治疗或安乐死过程中可能引起的应激或疼痛。
1. 动物
- 获取四只新生（出生后第4天，p4）未经处理的雄性仔猪（体重1.5–1.8 kg），其遗传背景为62.5%长白猪、25%大白猪和12.5%约克夏猪。
- 将动物集中饲养在猪舍内的专用房间中，使用加热灯并铺设毛巾覆盖的地面以提供保暖。喂食它们 随意摄取 第一周使用代乳粉喂养，2至3周时逐渐过渡到颗粒饲料。
- 在异氟烷麻醉下监测生理活动和体重，并每周进行一次MRI扫描。
- 以戊巴比妥钠过量实施安乐死，随后经心脏灌注肝素化生理盐水，再灌注10%中性缓冲甲醛。
- 从颅骨中取出大脑17用甲醛固定过夜，然后置于含30%蔗糖的PBS溶液中3天以进行冷冻保存。
2. 琼脂糖凝胶制备
- 浸入一个 将玻璃容器放入装有湿冰的桶中，至其高度的一半图 2A<....
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结果
一只仔猪在出生后第5天（p5）因过量戊巴比妥钠实施安乐死。其余三只动物表现出正常的生理活动，并具有相似的体重增长（达到7.44–8.4 kg）。其中两只仔猪在异氟烷麻醉下每周接受一次MRI扫描，直至出生后第32天（p32）实施安乐死。第四只仔猪则一直未接受干预，直至出生后第38天（p38）实施安乐死。
新生仔猪与人类胎儿在头颅尺寸上的相似性可在图1A、B中直观体现，其尺寸至少比啮齿类大两个数量级。在图1C中可观察到新生仔猪在出生后最初几周内显著的脑部生长和皮层发育。
图2 展示了使用墨汁染色琼脂糖凝胶进行脑组织塑形的每一步骤。将涂有矿物油的脑组织首先包埋于琼脂糖凝胶中，随后取出，形成空腔后，再将该空腔填充入墨汁染色的琼脂糖凝胶。
接下来，将琼脂糖凝胶按所需的厚度.......
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讨论
本方案介绍了一种经济实惠且易于构建的脑组织切片矩阵的制备方法，可用于辅助对仔猪或其他大型动物脑组织进行特定方向和厚度的切片。重要的是，与仅适用于有限脑尺寸范围的商用“固定尺寸”矩阵不同，该方法可方便地调节或扩展矩阵尺寸，以适配多种不同大小的脑组织。在本研究中，一个最初为30 g仔猪脑设计的矩阵被成功扩展，以容纳体积大80%的脑组织，并实现紧密贴合，从而确保精确的脑切片。建议在对矢状切片矩阵进行丙烯酸板增减操作时，应保持对称，以维持脑中线方向；但对于冠状切片矩阵，则不必严格对称，因为脑区各部分的生长比例相对不均。此外，该矩阵制备方法还可应用于其他大型动物物种，如猴、羊、犬、猫和雪貂。
在当前的方法中，使用脑铸型来制作模板。另一种替代方法是利用磁共振成像（MRI）图像生成系列模板。此前已获取了多项用于研究仔猪脑发育的纵向MRI扫描数据2，部分数据也来自本研究。尽管MRI是一种研究脑解剖结构与发育的高精度且灵活的方法2，但现有的猪脑MRI图像数据库仅涵盖2至24周龄阶段
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）#R21-NS114771（K.E.S.）， #R56-NS117587、#R01-EB028792、#R01-HD101508、#R21-HD091118、#R41-NS122722、#R42-MH135825（G. Y.）、美国心脏协会（AHA）#16GRNT30820006（G.Y.）和#14SDG20480186（L.C.），以及肯塔基大学神经科学重点研究领域项目（L.C.）资助。未经处理的雄性新生猪通过肯塔基大学医学院实验动物资源部（DLAR）从该校农业学院养猪中心购得。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
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| 3 件装 3/16" (4.5 mm) 透明丙烯酸板 8" ×12" 铸塑聚甲基丙烯酸甲酯（0.177”) 厚度标称尺寸 AZM | AZM 显示 | https://www.amazon.com/4-5mm 丙烯酸-聚甲基丙烯酸甲酯-标称-AZM /dp/B082CGYSCK/ref=sr_1_12? dchild=1&关键词=亚克力板 ，4.5毫米&qid=1617572206&sr=8-12 | |
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参考文献
- Jelsing, J., et al. The postnatal development of neocortical neurons and glial cells in the Gottingen minipig and the domestic pig brain. J Exp Biol. 209 (Pt 8), 1454-1462 (2006).
- Conrad, M. S., Dilger, R. N., Johnson, R. W.
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