使用光谱共聚焦显微镜进行高重成像，以最大限度地减少非特异性组织荧光

摘要

光谱迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 建立在基础 IBEX 技术的基础上，通过添加肝素阻断以最大限度地减少非特异性结合，并利用光谱检测和计算解混来抑制自发荧光。这种方法加速了图像采集，同时减少了背景源，从而实现了稳健的多轮、高参数空间蛋白质组学分析。

摘要

高度多重成像能够研究功能多样化的细胞及其天然组织环境中的生态位。迭代漂白扩展多重性 （IBEX） 是一种循环免疫标记和荧光团灭活技术，允许在同一组织切片上可视化多个标记物。随后可以分析捕获的图像以获取单细胞数据，以定义细胞簇、其定位和相邻细胞类型。解释这些数据依赖于将真正的标记表达与荧光显微镜固有的背景来源区分开来的能力。Spectral IBEX 是 IBEX 协议的改编版，将光谱共聚焦检测与计算解混相结合，并结合肝素阻断以减少基于电荷的脱靶结合。与传统的多轨共聚焦成像相比，这种组合提高了信噪比，抑制了组织自发荧光，最大限度地减少了渗漏，同时还缩短了采集时间。应用于人鼻息肉组织，一种以嗜酸性粒细胞含量高和自发荧光强为特征的模型，在六轮成像中证明了跨结构、免疫和细胞状态区室的 26 个标记物的可靠成像。由此产生的工作流程生成高维、空间分辨的蛋白质组学信息，捕获复杂的组织结构和细胞生态位。总之，这种优化的方法为多重成像提供了一种稳健且广泛适用的策略，特别适用于自发荧光和非特异性染色限制传统方法的组织。

引言

组织由一组具有特殊功能的多样化细胞组成，这些细胞组织成三维结构，并通过相互作用协调生命所必需的生物过程。当细胞组成或组织结构的破坏干扰这些相互作用并损害组织稳态时，就会出现病理学¹。为了了解人类健康和疾病背后的生物学原理，需要了解众多特殊细胞类型如何在我们的组织内定位和相互作用。

单细胞分析技术在转录组学、表观基因组学和蛋白质组学水平上的进步揭示了特殊细胞类型的异常多样性。^2,3 单细胞RNA测序和光谱流式细胞术等技术可以测量表征这些异质群体所需的参数数量。然而，这些方法缺乏空间信息，因为细胞必须从其天然组织环境解离成单细胞悬浮液^4,5。因此，已经确定了与各种疾病背景相关的细胞类型，但它们在组织内的相互作用以及它们对疾病延续的贡献仍不清楚。

为了解决其中一些限制，已经开发了几种空间组学技术来捕获组织内的细胞异质性，同时保留每个细胞的位置⁶。例如，可以通过在组织切片的光栅化点（例如Visium）处扩增RNA，或使用靶向以单细胞分辨率成像的特定基因组（例如Xenium^）的RNA杂交探针来测量基因转录^7,8。这些方法对于追踪组织内的转录模式和调控机制是有效的。然而，转录谱通常与蛋白质表达相关性较差，蛋白质表达更直接地反映了细胞的功能能力⁹。蛋白质表达可以使用与荧光团偶联的特异性抗体来鉴定，荧光团可以通过荧光显微镜^10,11检测。使用传统的荧光显微镜可以对六种以上的抗体偶联荧光团进行离散成像。然而，这些荧光团的重叠激发和发射曲线导致任何给定通道中荧光信号的起源的不确定性¹²。

迭代漂白扩展多重性（IBEX）是一种高内涵成像方法，旨在克服荧光显微镜的这一局限性13,14,15。IBEX 使用硼氢化锂 （LiBH₄） 在成像后对荧光团进行化学灭活，从而允许在重新成像之前用后续一轮荧光团偶联抗体对相同的组织样本进行重新染色。IBEX 保持组织完整性，使多轮成像能够在同一组织切片上可视化理论上无限数量的标记物。获取图像的计算比对提供单细胞分辨率的组学级表征，同时保留空间数据以揭示细胞生态位。该数据还可以揭示假定的细胞相互作用，尽管这些相互作用应该使用其他技术进行验证¹⁶。IBEX 是一种开源方法，与市售荧光团兼容，并得到国际研究人员社区的支持，他们已经验证了试剂并公开共享数据，以促进可访问性、快速采用和高质量数据生成^17,18。

在这项工作中，设计了一种改进的 IBEX 方案来克服该技术的两个主要挑战：组织自发荧光和荧光团偶联抗体探针的非特异性结合（统称为背景）。当组织内源性荧光分子的激发发出的光与从抗体偶联荧光团获得的所需信号重叠时，就会产生自发荧光^19,20。荧光团偶联抗体的脱靶或非特异性结合导致不表达靶蛋白的细胞或结构发出荧光^21,22。这些伪影可能会导致细胞表达它没有真正表达的标记的不准确结论，从而使计算分析和准确的细胞类型分配复杂化。通过将基于肝素的脱靶信号电荷中和与全光谱采集和计算解混相结合，光谱 IBEX 显着减少渗漏，提高信背景比 （SBR），并将每轮采集时间减半。

方案

本研究中使用的鼻息肉组织是在汉密尔顿健康科学的鼻窦手术期间收集的，并获得了汉密尔顿综合研究伦理委员会的伦理批准。获得所有参与者的知情同意。

1. 样品采集

1. 在对慢性鼻窦炎患者进行的常规息肉切除术中获取样本。手术取出后，将样品放入装有医用生理盐水的小瓶中，放在冰上运输，并立即处理它们进行成像，以保持组织完整性。

2.试剂制备

1. 通过将得到的固定和透化溶液在PBS中以1：4稀释来制备固定和透化溶液。在PBS中制备30%蔗糖的冷冻保存溶液。在PBS中制备0.1%v / v Triton X-100的稀释缓冲液。
2. 在稀释缓冲液中制备 BSA 阻断试剂作为 1% w/v 牛血清白蛋白。将肝素阻断试剂制备为10KU肝素钠盐在1mL PBS中。通过在BSA封闭试剂中将肝素封闭试剂（1：50）与Fc封闭试剂（1：100）混合来制备封闭缓冲液。
3. 制备染色混合物作为抗体，在封闭缓冲液中以适当的稀释度滴定。通过在10mL超纯水中加入10mg LiBH₄ 来制备漂白溶液。

3. 组织加工和总加工

1. 在解剖显微镜下检查组织（通常放大倍率为 ~15 倍，尽管这可能因样品和显微镜而异），并用镊子和手术刀去除脂肪和骨骼。为了最好地保存组织，请使用干净的器械，在寒冷潮湿的表面上工作，并尽量缩短处理时间。
2. 用手术刀将 0.5 厘米厚> 4-5 毫米的粗组织²³.将切片浸入固定和透化溶液中，并在°C下旋转16小时。
   注意：该溶液和步骤 3.3 中其他溶液的体积应约为样品体积的 20 倍，在适当大小的管中。
3. 将组织移入PBS中并冲洗5分钟。将组织浸入冷冻保存溶液中，并在°C下孵育16小时。此步骤后不要清洗，因为这会将水重新引入组织。

4. 组织冷冻

1. 在每个孔上方用实验和样品详细信息标记 6 孔板，并将其放入 -20°C 冰箱中冷却至少 20 分钟。
2. 用最佳切割温度 （OCT） 化合物填充适当尺寸的冷冻模具。避免在 OCT 中产生气泡。使用针头或移液器吸头将任何大气泡拖到冷冻模具的边缘。
   注意：冷冻模具可以使用缠绕在小平底小瓶或管上的铝箔制成。
3. 从冷冻保存溶液中取出组织。在无绒纸巾上轻轻擦拭纸巾，去除多余的液体，因为这会影响冷冻。
4. 在通风橱中用大约 100-150 mL 异戊烷填充 250 mL 烧杯，并将其放入部分填充液氮的泡沫盒或冷却器中。
   注意：如果打开超过 2 小时，异戊烷会蒸发;开封后立即使用。异戊烷有助于组织的均匀和快速冷冻。异戊烷可能会随着时间的推移缓慢冻结。如果它结冰为固体，请将烧杯从液氮中取出并使其解冻。异戊烷可以倒入带盖的玻璃瓶中，重复使用多达 5 次。异戊烷的液位应高于液氮，以防止烧杯漂浮或倾倒。
5. 在解剖显微镜下根据需要在OCT内调整组织的方向。
   注意：对于鼻息肉组织，我们通常沿其长轴定向样品以获得对称的截面，以捕获尽可能大的横截面积。查阅感兴趣组织的组织学手册，以获得最佳包埋方向。
6. 将冷冻模具的底部浸入异喷烷中。当组织中心完全白色且不透明时，从异戊烷中取出冷冻模具。避免完全浸没冷冻模具;块可能会破裂，影响切片。
7. 通过对背面施加压力，轻轻地将块从冷冻模具中弹出，并将其放入-20°C的预冷6孔板中。 冷冻所有样品后，将板转移到-80°C冰箱中长期储存。
   注意：这是一个暂停点。组织可在-80°C下储存多年。

5. 载玻片制备和冷冻切片

1. 将 10-1 μL 铬明矾明胶粘合剂移液到载玻片上;均匀涂抹并风干 15 分钟。为获得最佳附着力，将铬明矾明胶粘合剂涂在腔室盖玻璃上 2x-3 次，每次涂抹添加 5 μL（总共 15 μL）。
2. 干燥后，将载玻片放入80°C的烘箱中1小时，以确保完全干燥。如果使用腔室盖板玻璃，请将其在 37 °C 下干燥过夜，因为塑料可能会在 80 °C 下熔化。
   注意：载玻片涂覆并干燥后，可以在室温下储存数天，直到使用。它们应该被盖住以避免灰尘。
3. 将组织从 -80 °C 转移到 -20 °C（或在切割温度下进入低温恒温器）以平衡，并在切片前预冷 1 小时。在低温恒温器上切割 10-2 μm 切片²⁴。
   1. 如果切片到带腔的盖玻璃中，请在提起防滚板后用镊子轻轻拾取该部分。用画笔将其平放在腔室内的玻璃上。将拇指按压盖玻璃底部样品下方，将该部分熔化到玻璃上。
4. 在3°C下干燥载玻片1小时或在室温下干燥24小时。
   注意：如果立即使用载玻片，可以在室温下暂时存放在载玻片盒中，以保护它们在准备染色时免受灰尘的影响。但是，如果不立即使用，请将它们储存在 -80°C 以保持组织完整性。这是一个暂停点。如果载玻片储存在-80°C，则可以在此处暂停该过程。

6. 封闭和抗体免疫标记

1. 使用巴氏笔在组织周围的玻璃上画一个圆圈，以形成疏水屏障，在染色或其他步骤中包含液体。不要在 OCT 上绘制，因为当 OCT 溶解时，疏水油墨会被冲走。
   注意：腔室盖玻璃不需要此步骤，因为壁将液体固定在孔中。
2. 向每个组织中加入~100μL的PBS，并在室温下孵育~2分钟，以使组织再水化并洗掉OCT。使用~1mL的PBS作为腔室盖玻璃。
   注意：为避免组织从玻璃上抬起，请勿将液体直接移液到样品上。
3. 吸出PBS并加入100μL封闭缓冲液。在室温下在有盖的湿度室中孵育1小时。对腔室盖板玻璃使用 ~400 μL 封闭缓冲液。
4. 吸出封闭缓冲液并加入 100 μL 染色混合物。在有盖的湿度室中孵育，置于冰箱（4°C）内过夜。将 ~400 μL 染色混合物用于腔室盖板玻璃。准备仅用面板中的一个荧光团染色的切片，以及没有任何染色剂的阴性对照，以定义荧光团的光谱和组织的自发荧光。
   注意：抗体稀释液应通过滴定至 1：50、1：100 和 1：200 或根据需要进行其他稀释来进行实验优化。选择能够产生最佳信号的最小抗体量。目标是使组合中所有抗体的强度大致相等，以最大限度地提高光谱解混效果。在此步骤之后保护样品免受光线照射，以尽量减少荧光团的光漂白。
5. 吸出染色混合物并用PBS（10μL，每次2分钟）洗涤3次，每次洗涤之间吸出液体。将 ~1 mL PBS 用于室盖玻璃。
6. 向每个切片中加入~10μL封固剂。缓慢移液以避免气泡在成像时产生光学像差。使用移液器吸出形成的任何气泡。对于腔室盖玻璃，向每个孔中加入 1 mL 封固剂。
   注意：带腔盖玻璃不需要以下步骤 6.7 和 6.8。
7. 将 1 号 22 mm x 50 mm 盖玻片轻轻放在试样上。
   注意：通过将盖板玻璃的一端用力压在封片介质上并让玻璃落到样品上，均匀地铺开介质，可以最大限度地减少气泡。盖板玻璃的厚度应与物镜的规格相匹配（例如，大多数高数值孔径物镜的 #1.5 盖玻片）。如果物镜有校正环，请确保将其调整到正确的盖玻片尺寸。使用错误的厚度或环设置可能会导致球面像差并导致图像模糊或扭曲。
8. 将载玻片翻转过来，轻轻按下无绒湿巾，以排出多余的封片介质。
   注意： 避免在滑轨上用太大的力向下推。用力过大可能会损坏或变形组织，从而影响成像回合之间的对齐。

7. 显微镜设置和成像

注意：该协议特指蔡司 LSM980 和其他蔡司系统。这些步骤在其他系统上可能有所不同。详细介绍了两种工作流程：传统的共聚焦+解混（多轨采集与计算光谱解混事后），可在光谱探测器不可用时使用，但采集时间较长且有一些残留渗漏;以及全光谱检测（单通道、34 通道光谱采集），这是我们的首选方法，因为它提供了最佳的 SBR、接近零的串扰和最快的成像时间。

1. 传统共聚焦显微镜
   1. 成像前约 30 分钟打开显微镜系统（包括激光器、探测器和计算机）的电源。
   2. 在单击显 微镜>物镜到达的显微镜控制屏幕上，选择合适的物镜（例如，20x 0.8 NA），并在必要时用镜头安全擦拭布清洁。
   3. 将样品牢固地安装在载物台上。尝试将玻璃或盖玻璃室对准载玻片支架的同一角/端，以促进连续回合的 XY 对齐。这将取决于安装的支架。
   4. 使用 GFP、YFP 或 RFP 照明上的目镜聚焦样品，然后切换到计算机屏幕上的“采集”选项卡。
      注意：使用目镜聚焦样品时，请勿使用DAPI滤光片，因为将DAPI染色剂暴露在紫外线下（使用DAPI滤光片立方体）会导致其光转化为绿色荧光分子（补充图1A）。
   5. 配置成像轨迹，以最大限度地减少重叠和交叉激光激发（补充表 1， 补充表 2 报告了此处所示的传统共聚焦显微镜实验的采集设置）。
      注意：理想的组合涉及不同的激发和发射峰，例如 DAPI 或 AF488 以及 AF594、AF647 或 AF700。
      1. 为每个轨道分配最佳激发激光器。将每个轨道的针孔尺寸调整为 1 AU 或 Airy Unit，以实现最佳光学切片。
      2. 根据轨道的荧光团，分别调整轨道中每个可调谐探测器的采集波长范围。
      3. 调整激光功率和探测器增益设置以最大化 SBR。确保很少的像素（如果有）达到最大强度。
         注意： 为避免光漂白和/或探测器曝光过度，请将激光功率保持在尽可能低的水平。优化抗体稀释度，以便在背景上方检测到强信号。
   6. 按 连续扫描模式按钮预览样品并设置扫描参数（如有必要，扫描速度、分辨率和平均值）。
      注意：对于小瓷砖并尽量减少背景，建议停留时间在 0.2-0.3 μs 之间，平均轮次为 1-2 次。为了在保持分割和单细胞分辨率的同时最大限度地提高速度，请使用最快的扫描速度（无需平均）和 0.2-0 的像素大小。微米/像素。例如，使用 20x/0.80 NA 物镜以每块 2048 x 2048 像素成像可在 424.26 x 424.2 μm² 视场上产生 0.20 μm/像素。
   7. 对每个轨道执行测试扫描，以检查串扰或渗漏。
      1. 在用所有标记染色的载玻片上，在连续扫描模式下，以低功率启动每个激光器，然后仅将其升高，直到标记清晰可见且不饱和（使用 LUT/饱和度指示器）。
         注意：如果可能，建议在对实验样品进行成像之前使用重复样品或不需要的区域来优化显微镜设置。这在用DAPI（以避免光转化风险）或快速光漂白的荧光团（例如PE）染色时尤为重要。
      2. 移动到该荧光团的单染色对照。调整激光功率和探测器增益，使信号明亮且不饱和。
      3. 在同一张单染色载玻片上，扫描所有其他检测通道。如果通道外强度超过背景，请缩小检测窗口和/或降低激励/增益。
      4. 对每个荧光团重复7.1.7.1-7.1.7.2。进行任何调整后，请简要检查先前优化的染色剂，以保持强度可比，特别是对于共定位的标记物。
   8. 启用“瓦片”功能并定义瓦片采集区域。
      1. 优化组织中心图块采集区域的焦点。找到一个独特的特征（一组特定排列的单元格）作为参考，以便在以后的轮次中进行对齐。
   9. 启用 Z 堆栈功能并转到 Z 堆栈选项卡。转到“中心”选项卡。将 Z 堆栈中的切片数设置为至少 6，切片之间的间隔至少为 1 μm。然后，单击 “中心 ”按钮将当前焦点（在步骤 6.1.8.1 中确定）定位为堆栈的中间切片。
   10. 单击“ 开始实验 ”按钮开始获取图像。通过右键单击图像缩略图并选择 另存为来保存采集设置并备份图像数据。然后，选择文件位置并为图像命名。
   11. 使用与平铺区域采集相同的优化设置解混图像，从每个单染色对照捕获快照以获得真实信号光谱，从未染色对照捕获背景/自发荧光，如步骤6.4中准备的。
       1. 这些图像用于光谱解混;不要从多路复用样品中选择真实信号。通过首先确保强度/形态不存在或等同于未染色对照中的背景，然后匹配标记的预期定位（例如，膜 vs 核 vs 细胞质 vs 分泌模式），确认所选区域真正代表信号。
       2. 打开快照图像。单击“ Unmixing ”选项卡。使用“Unmix tools”选项卡下的区域选择工具之一在正信号周围绘制 ROI（将出现该区域的频谱）。对每个荧光团的每个快照图像重复此作，以创建用于解混的参考光谱。
          1. 将该光谱与荧光团的理论光谱进行比较，以确保所选区域代表真实信号。根据每个荧光团命名光谱并将其保存到光谱数据库中。
             注意：自发荧光的光谱可以识别并处理为单独的荧光团，以将其与其他信号分离。完成面板优化后，不需要获取新的参考文献，因为只要使用相同的方案和组织类型，就可以重复使用相同的设置。
       3. 加载平铺图像并导航到 Unmixing 工具。使用 + 按钮将每个荧光团的参考光谱添加到解混列表中，然后单击 线性解混 按钮。
   12. 保存未混合的图像以供以后分析。
       注意：输出是多平铺图像，每个标记都有一个通道。在继续之前，可以在此处暂停实验。
   13. 获取阴影参考图像
       1. 使用与样品成像的相同设置，获取 DAPI 校准载玻片的图像。保存图像，然后仅提取 DAPI 通道作为着色参考。输出是平场图像（补充图1B）。
          注意：不必为每个样品采集参考图像。只要使用具有相同设置的同一仪器，参考就应该相同。如果采集的图像没有阴影伪影，则无需此参考，如 补充图1C所示。
2. 光谱共聚焦显微镜
   1. 打开显微镜系统（包括激光器、探测器和计算机）的电源。选择合适的物镜（例如，20x 0.8 NA 或任何其他物镜）并在必要时进行清洁。
   2. 将样品牢固地安装在载物台上。确保盖玻片面向物镜。
   3. 使用明场或 DIC 聚焦样品，然后切换到荧光模式。配置光谱采集。 补充表3 报告了此处所示的光谱共聚焦显微镜实验的采集设置。
      1. 分配正确的激光器。
         注意：一些激光器可以激发多个荧光团。因此，可能没有必要为每个荧光团配备唯一的激光器。
      2. 选择适合所用激光线的分束器。使所有探测器能够捕获尽可能多的光谱。将针孔尺寸调整为 1 AU，以获得最佳光学切片。
   4. 优化激光设置
      1. 使用用所有标记染色的切片，以低功率的激光启动连续扫描模式。调整每个激光的强度，直到可以在良好的 SBR 下识别标记。
         注意：虽然这不允许对光谱重叠的荧光团进行精确调整，但它将有助于最大限度地减少必须将单染色载玻片切换到显微镜上的次数。
      2. 使用单染色切片微调每个荧光团的激光强度。从单染色部分迭代切换回具有所有标记的部分，直到每个标记的信号可以可视化而不会过饱和。
         注意：每次调整激光强度或增益设置时，请重新访问之前优化的单染色载玻片，以确保信号保持最佳状态。为了实现最佳的解混，标记之间的信号强度水平应尽可能相似，尤其是在共定位的标记之间。如果可能，建议在对实验样品进行成像之前使用重复样品或不需要的区域来优化显微镜设置。这在用DAPI（以避免光转化风险）或快速光漂白的荧光团（例如PE）染色时尤为重要。
   5. 执行步骤 7.1.8 - 7.1.14。

8. 取下盖玻片（仅适用于载玻片，不适用于腔室盖玻片）

1. 将载玻片浸入PBS中，让盖玻片分离。请勿尝试强行取下盖玻片，因为这可能会使组织变形，从而导致后续成像轮次出现对齐问题或从载玻片上完全脱落。使用足够大的容器来容纳载玻片，并确保它可以完全浸没在 PBS 中。

9. 荧光团漂白和循环

1. 仅适用于腔室盖板玻璃：使用移液器吸出尽可能多的封片介质，注意不要损坏组织。
   注意：将腔室向一侧倾斜可以促进抽吸。
2. 用 ~1 mL（腔室盖玻片）或 ~100 μL（载玻片）PBS 洗涤 3 次 2 分钟，直到完全去除封固剂。
3. 在通风橱中准备漂白溶液。使用微刮刀将 10 mg LiBH₄ 直接称入干燥的烧杯中。小心地将 10 mL 超纯水直接加入含有 LiBH₄ 的烧杯中，搅拌直至完全溶解，制成漂白溶液。
   注意：使用前立即准备以获得最大反应性。
   注意：LiBH₄ 极易燃，因此此步骤需要格外小心 - 确保正确使用通风橱（即适当高度的窗扇、合适的 PPE 等），并且一次只能使用 <10 毫克的 LiBH₄ 。在添加 LiBH4 之前，请确保烧杯完全干燥 - 否则可能会导致火灾。
4. 使用玻璃巴斯德移液器向每个组织切片中加入~100μL漂白溶液，并在室温下在通风橱中孵育15分钟。对腔室载玻片使用 2 mL 漂白溶液。
5. 如果漂白BV染料（例如BV421，BV510等），请小心地将孔移至落射荧光显微镜。选择 DAPI 滤光片，对样品进行聚焦，然后以全功率照亮它。
   1. 使用 5 倍物镜可获得更大的照明场。将载物台降低到尽可能低，以防止损坏物镜和外壳。
6. 使用玻璃巴斯德移液器将 LiBH₄ 溶液从孔中倒出，并将其添加回 LiBH₄ 溶液的烧杯中。
   注意：这现在是废液 LiBH₄;该溶液不能储存以备将来使用。
7. 用稀释缓冲液洗涤载玻片 3 次并孵育 ~3 分钟。腔室载玻片的总体积为 2 mL。
8. 按照正常方案添加抗体混合物并染色（步骤 6.3 - 6.8）。
9. 将 2N H₂SO₄ 滴加到通风橱中的废液 LiBH₄ 中，定期混合。
   注意：LiBH₄ 会积极冒泡。这些气泡是从 LiBH₄ 释放的 H₂ 气体;H₂ 非常易燃，因此在此步骤中要格外小心，并非常缓慢地添加 H₂SO₄。
10. 当溶液不再起泡时，将其倒入吸水垫中。用超纯水冲洗烧杯，然后将其倒入吸水垫中。
    注意： 将吸水底垫放入化学品/生物危害袋中，固定好，然后根据当地化学危害指南进行处理。

10. 图像采集后处理

1. 在 Zen 软件中通过单击文件 >打开>选择参考图像，打开参考图像（从步骤 7.1.14 开始）。
   注意：采集后图像处理步骤也可以在开源软件包中执行。（例如，ImageJ）。
2. 通过单击 “处理”>“强度”>“对比度拉伸”>“自动>应用”来调整亮度和对比度以优化动态范围。
3. 通过单击“ 图像处理”>“>将像素类型转换为 32 位（浮点）将像素类型更改为 32 位>。
4. 通过单击 “处理>强度”>“归一化 （饱和像素 = 0%）” >“应用”来归一化参考图像。
5. 通过单击 处理>平滑>高斯> 输入半径（例如，2-5 像素） > 应用（补充图1B）来平滑参考图像。
   注意：通过尝试不同的值来优化高斯模糊半径。要知道正确的值，请除以原始参考图像（处理>图像计算器），将原始参考图像除以处理后的图像和生成的图像应具有均匀的强度（所有像素大致相同的值）。
6. 单击文件 >打开>选择多瓦片图像，打开要校正的多瓦片图像。
7. 使用已处理的参考应用拼接和着色校正，方法是单击具有以下参数的 处理>拼接 。
   1. 选中混合框。选中正确的阴影框，然后从下拉菜单中选择处理后的参考图像（步骤 10.5）。保持所有其他参数相同。
      注意：参数可能需要调整才能获得最佳结果。
   2. 在“输入/输出”菜单中，选择多平铺图像作为输入，选择着色参考作为参考。
   3. 按顶部的 “应用” 按钮，将生成一个校正了拼接和阴影的新图像（补充图 1D）。
      注意：拼接校正（补充图 1I-J）对于确保过程后期图像对齐的准确性是必要的。
   4. 通过单击文件 >保存>选择文件夹来保存更正后的图像。

11. 图像对齐

1. 使用 Imaris 文件转换器工具将处理后的图像从任何格式（.czs、.tif 等）转换为 Imaris 格式。
   注意： 可以按照此网站上的说明下载和安装该工具 web网站 （https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter）。
2. 启动 Imaris 扩展注册工具，将所有回合的图像注册（对齐）为具有所有通道的图像。
   注意： 要安装该工具并成功对齐图像，请按照以下网站上的说明进行作 web网站 （https://github.com/niaid/imaris_extensions）。
3. 单击 Imaris 扩展按钮 。选择 SimpleITK 实用程序 > 将通道设置导出为 CSV。
4. 单击 浏览，导航到 .ims 图像（来自其中一个轮次），选择它，然后单击 打开。
5. 单击 导出并 选择保存 CSV 文件的位置。输入名称，然后单击 保存。
6. 打开保存的 CSV 文件并验证频道名称是否正确。如有必要，请进行编辑。
7. 如果进行了编辑，请转到 Imaris 扩展> SimpleITK 实用程序>批量配置通道设置。
   注意：如果在上一步中未进行任何编辑，则不需要此步骤。
8. 单击 “浏览”，导航到 CSV 文件，选择它，然后单击 “打开”。单击 下一步，然后再次 浏览 以选择相同的 .ims 图像，然后单击 打开。
9. 单击 配置以 应用更改。对来自不同轮次的所有图像重复步骤 11.3-11.8。
10. 正确命名通道后，转到 Imaris 扩展> SimpleITK 算法>使用公共通道对 Z-Stacks 进行仿射注册。
11. 单击 浏览，导航到包含所有圆角的文件夹，选择所有图像，然后单击 打开。
12. 单击 下一步，选择注册渠道（基准渠道）。对于此协议，使用了 DAPI 通道。然后选择固定图像。
    注意：选择在整个回合中保持恒定且耐化学或光漂白的通道/标记物（例如，像 DAPI 这样的核染料）。然后选择固定图像。
13. 单击 “高级配准设置”，选中除“自动蒙版”之外的所有框，并将“高斯平滑 sigma”设置为 5.0。
14. 单击 完成，然后单击 注册以 执行对齐。注册完成后，单击 重新采样 并 保存组合图像。
15. 重采样后，选择基准通道并单击 计算相关性。输出文件包括一个对齐的 output.ims 图像、两个显示注册前后对齐质量的 PDF、一个包含用于注册的设置的 JSON 文件，以及一个包含整个过程日志的 TXT 文件。

12. 图像对齐

1. 使用 CellPose （v2.5）²⁵ 对单元格/对象进行分割
2. 对于每个单染色数据集，从标记物自己的检测通道生成一个分割掩码（示例：对于 CD20 单染色，从 AF488 检测通道（CD20 的预期通道）生成掩码）。
3. 将步骤 2 中的分割掩码应用于同一数据集中的每个通道（在 CD20 示例中，将 AF488 衍生的掩码应用于 AF488 以测量真实信号，并应用于所有其他检测通道以测量渗漏）。
4. 使用 scikit-image （regionprops_table） 和 NumPy 在 Python 中提取每个对象的强度和面积。
5. 信背景比 （SBR）
   1. 计算标记的预期检测通道中所有分段 ROI 的平均物体强度。
   2. 将背景强度定义为同一视野中 ROI 之外所有像素的平均强度，不包括零值填充或越界像素。
      SBR 计算为：
      
   3. 使用小提琴图可视化 SBR 分布，将每个对象的值显示为点（或指示的每个字段值）。
6. 渗漏定量
   1. 对于每个非预期通道，在步骤 12.2 中使用掩码的相同 ROI 计算渗漏 （%）：
      
   2. 注意：对角线条目等于 100%，因为在单染色图像的预期通道中，分子和分母是相同的（在其自己的通道中测量的真实标记信号）。

结果

免疫荧光成像技术面临的两个基本挑战是荧光团偶联抗体探针的非特异性结合和组织自发荧光。该协议旨在帮助区分真实信号和背景信号，以优化多重免疫荧光技术。

肝素阻断可减少非特异性荧光团结合，同时保留信号

粒细胞因与标记^{物 26,27} 的预期形态分布不匹配的高强度脱靶荧光而臭名昭著。例如，在慢性鼻窦炎患者的鼻息肉组织中，用膜淋巴细胞标志物CD3，CD4和CD20染色显示所有通道中都显示出强烈的信号，具有意想不到的颗粒形态（图1A，黄色箭头）。鼻息肉富含嗜酸性粒细胞，这...

讨论

Spectral IBEX 是 IBEX 方案的改编版，成功解决了免疫荧光成像中的两个关键问题：非特异性结合和自发荧光。用肝素处理高嗜酸性粒细胞组织，并使用光谱解混来消除通道之间的自发荧光和光谱重叠，显着提高了对高于背景的真实信号的检测。在一次通过中捕获所有标记可以减少采集时间，这可能会提高 IBEX 循环速率。虽然在没有光谱探测器的情况下可以使用具有计算解混的传统共聚焦采集，但建议使用全光谱检测，因为它可以最大限度地提高灵敏度，几乎消除渗漏，并将每轮成像时间缩短一半。这里提供了 Spectral IBEX 的详细协议，其中包含建议、注意事项和数据，以支持在不同研究环境中实施多种 IBEX 模式。

组织自发荧光是荧光成像的一个主要局限性。FFPE等固定和包埋方法大大增加了组织自发荧光，限制了任何荧光成像方式对作为FFPE块长期储存的大量临床样本的应用³⁷。此外，一些组织（肝脏、脾脏、鼻息肉等）非常自然地自发荧光，以至于使用传统的显微镜方法无法区分自发荧光上方的真实信号...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2N硫酸（H2SO4）溶液	无	无	实验室里能用到的
500毫升烧杯	无	无	实验室里能用到的
6孔板	无	无	实验室里能用到的
Bcl-6 - Alexa Fluor 647	BD生物科学	561525	稀释因子 1：100
BD细胞固定/细胞结构固定/渗透套件	BD生物科学	554722
台面解剖显微镜	无	无	实验室里能用到的
牛血清白蛋白（BSA）	西格玛-奥尔德里奇	A4503
CD11c - Alexa Fluor 700	BD生物科学	561352	稀释因子 1：100
CD138/Syndecan-1 - PE	生物传说	356503	稀释因子 1：200
CD20 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53020282	稀释因子 1：100
CD21 - Alexa Fluor 532	诺维斯生物	NBP2-60733AF532	稀释因子 1：100
CD23 - PE	生物传说	338507	稀释因子 1：200
CD3 - iFluor 594	AAT生物探索	100320C0	稀释因子 1：100
CD31 - Alexa Fluor 700	生物传说	303134	稀释因子 1：100
CD34 - iFluor 594	AAT生物探索	103400C0	稀释因子 1：100
CD38 - Alexa Fluor 700	生物传说	303523	稀释因子 1：100
CD4 - Alexa Fluor 647	生物传说	300520	稀释因子 1：100
CD45 - Alexa Fluor 532	热飞世科学	58045942	稀释因子 1：100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647	生物传说	353113	稀释因子 1：100
铬明明胶胶	新来者供应	1033A
低温霉菌	费舍尔科学公司;	NC9511236	另外，目录号50-465-347以获取更大样本
DAPI校准幻灯片	阿加科学	AG2273
DAPI溶液，1 mg/mL	热飞世科学	62248	稀释因子 1：3000
电子卡得敏/CD324 - Alexa Fluor 647	生物传说	147307	稀释因子 1：100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594	生物传说	324228	稀释因子 1：100
Eppendorf/猎鹰管	无	无	实验室里能用到的
氟含剂-G	南方生物技术	0100-01
镊子	无	无	实验室里能用到的
FoxP3 - eFluor 660	热飞世科学	50577382	稀释因子 1：100
磨砂端显微镜载玻片	化学科学	GEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488	热飞世科学	53590282	稀释因子 1：100
肝素钠盐	西格玛-奥尔德里奇	H3393	10KU
HLA-DR - PE	诺维斯生物	NB100-77855PE	稀释因子 1：200
人类TruStain FcX（Fc受体阻断溶液）	生物传说	422302	稀释因子 1：100
湿度室	无	无	实验室里能用到的
带盖冰桶	无	无	实验室里能用到的
IgD - Alexa 氟488	生物传说	348215	稀释因子 1：100
IL4Ra/CD124 - PE	生物传说	144803	稀释因子 1：200
Imaris文件转换器	牛津乐器	无	将任何图像文件格式转换为.ims格式（https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter）
异戊烷（2-甲基丁烷）	无	无	实验室里能用到的
Ki-67 - Alexa Fluor 488	BD生物科学	558616	稀释因子 1：100
Kimberly-Clark 专业 Kimtech Science Kimwipes 精致作业雨刷，单层	金科技科学	06-666
大型（即25厘米长）镊子	无	无	实验室里能用到的
液氮	无	无	实验室里能用到的
硼氢化锂（LiBH4）	西格玛-奥尔德里奇	222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488	Invitrogen	53603680	稀释因子 1：100
显微镜幻灯片盖玻璃 No.1 22x50毫米	费舍尔科学公司;	12-542A
毫-Q水	无	无	实验室里能用到的
MUC2 - Alexa Fluor 488	诺维斯生物	NB120-11197AF488	稀释因子 1：100
Nunc Lab-Tek 腔室罩玻璃	热飞世科学	155380
PAP笔	ABCAM	AB2601
磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液	无	无	实验室里能用到的
手术刀	无	无	实验室里能用到的
SimpleITK Imaris 扩展	无	无	用于对齐不同轮次图像的软件（https://github.com/niaid/imaris_extensions）
蔗糖	西格玛-奥尔德里奇	S0389
组织技术O.C.T.复合体	Sakura Finetek 美国	4583
特里顿 X-100	西格玛-奥尔德里奇	X100
蔡司LSM 980	蔡司显微镜	无	本研究所用影像系统
Zen Blue	蔡司显微镜	无	用于后采集图像处理的软件