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方法文章

利用光谱共聚焦显微镜进行高重成像以最小化非特异性组织自发荧光

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DOI：

10.3791/68644

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2025年10月28日

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1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

光谱迭代漂白扩展多重性（IBEX）在基础IBEX技术的基础上，增加了肝素阻断以最大限度减少非特异性结合，并利用光谱检测结合计算解混技术来抑制自发荧光。该方法可加快图像采集速度，同时降低背景信号来源，从而实现稳健的多轮、高参数空间蛋白质组分析。

摘要

高度多重成像技术能够在原生组织环境中研究功能多样的细胞及其微环境。迭代漂白扩展多重性（Iterative Bleaching Extends Multiplexity, IBEX）是一种循环免疫标记与荧光团失活技术，可在同一组织切片上实现多个标志物的可视化。所获取的图像可进一步分析，以获得单细胞数据，用于定义细胞簇、其空间定位及邻近的细胞类型。对这些数据的解读依赖于区分真实标志物表达与荧光显微镜固有背景信号的能力。光谱IBEX（Spectral IBEX）是IBEX方案的一种改进，结合了光谱共聚焦检测与计算解混技术，并引入肝素阻断以减少基于电荷的非靶向结合。该组合可提高信噪比，抑制组织自发荧光，降低串色干扰，同时相较于传统的多通道共聚焦成像缩短了采集时间。在人鼻息肉组织（一种以高嗜酸性粒细胞含量和强自发荧光为特征的模型）中的应用表明，在六轮成像中可稳定检测26个标志物，涵盖结构、免疫及细胞状态等多个层面。该工作流程生成高维度、空间分辨的蛋白质组学信息，能够捕捉复杂的组织结构和细胞微环境。综上，这一优化策略为多重成像提供了一种稳健且广泛适用的方法，特别适用于自发荧光和非特异性染色限制传统方法应用的组织样本。

引言

组织由多种具有特定功能的细胞组成，这些细胞有序地形成三维结构，并通过相互作用协调维持生命所必需的生物学过程。当细胞组成或组织结构受到破坏，干扰了这些相互作用并损害组织稳态时，便会导致病理状态的发生1。要理解人类健康与疾病背后的生物学机制，必须了解众多特化细胞类型在组织内的定位方式及其相互作用规律。

在转录组、表观基因组和蛋白质组水平上，单细胞分析技术的进步揭示了高度多样化的特化细胞类型。2,3 单细胞RNA测序和光谱流式细胞术等技术能够检测用于表征这些异质性细胞群体所需的大量参数。然而，这些方法缺乏空间信息，因为细胞必须从其原始组织环境中解离成单细胞悬液4,5。因此，尽管已鉴定出与多种疾病状态相关的细胞类型，但它们在组织内的相互作用及其在疾病持续发展中的作用仍不明确。

为解决其中一些局限性，已开发出多种空间组学技术，可在捕获组织内细胞异质性的同时，保留每个细胞的空间位置信息6。例如，基因转录可通过在组织切片上以光栅化点阵形式扩增RNA（如Visium）来检测，或通过使用靶向特定基因组合的RNA杂....

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方案

本研究中使用的鼻息肉组织是在汉密尔顿健康科学中心（Hamilton Health Sciences）经汉密尔顿整合研究伦理委员会批准的鼻窦手术期间采集的。所有参与者均签署了知情同意书。

1. 样品采集

  1. 在对慢性鼻窦炎患者进行常规息肉切除术时获取样本。手术切除后立即将样本放入含有生理盐水并置于冰上的小瓶中进行运输，并立即处理用于成像，以保持组织完整性。

2. 试剂准备

  1. 通过将获得的固定和透化溶液按1:4比例用PBS稀释，制备固定和透化溶液。用PBS配制含30%蔗糖的冷冻保护溶液。用PBS配制含0.1% v/v Triton X-100的稀释缓冲液。
  2. 用稀释缓冲液配制含1% w/v牛血清白蛋白的BSA封闭试剂。将1 mL PBS中加入10KU肝素钠盐制备肝素封闭试剂。将肝素封闭试剂（1:50）与Fc封闭试剂（1:100）加入BSA封闭试剂中，混合制备封闭缓冲液。
  3. 将抗体用封闭缓冲液按适当稀释比例配制，制备染色混合液。在10 mL超纯水中加入10 mg LiBH4，配制漂白溶液。

3. 组织处理与大体检查

  1. 在解剖显微镜下检查组织（通常放大倍数约为15倍，但可根据样本和显微镜类型有所调整），使用镊子和手术刀去除脂肪....

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结果

免疫荧光成像技术面临的两个基本挑战是荧光素偶联抗体探针的非特异性结合以及组织自发荧光。本方案旨在帮助区分真实信号与背景信号，以优化多重免疫荧光技术。

肝素封闭可减少非特异性荧光团结合，同时保留信号

粒细胞因其高强度的非靶向荧光而臭名昭著，这种荧光并不符合标记物预期的形态学分布26,27。例如，在慢性鼻窦炎患者的鼻息肉组织中，使用膜淋巴细胞标记物CD3、CD4和CD20进行染色后，所有检测通道均显示出强烈的信号，并呈现出意料之外的颗粒状形态（图1A，黄色箭头）。鼻息肉组织富含嗜酸性粒细胞，这些荧光细胞中典型的双叶核结构表明嗜酸.......

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讨论

Spectral IBEX 是 IBEX 方案的一种改进，成功解决了免疫荧光成像中的两个关键问题：非特异性结合和自发荧光。通过对嗜酸性极强的组织使用肝素处理，并结合光谱解混技术以消除自发荧光及通道间的光谱重叠，显著提高了真实信号相对于背景的检出率。单次扫描即可捕获所有标记物，缩短了采集时间，可能提高 IBEX 循环的速率。尽管在缺乏光谱检测器的情况下可采用传统共聚焦采集结合计算解混方法，但仍推荐使用全光谱检测，因其可最大化灵敏度、几乎完全消除串色，并将每轮成像时间缩短一半。本文提供了 Spectral IBEX 的详细实验方案，包含建议、注意事项及相关数据，以支持在多种研究环境中实施各类 IBEX 模式。

组织自发荧光是荧光成像的主要限制因素。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）等固定和包埋方法会显著增强组织的自发荧光，从而限制了任何荧光成像技术在大量以FFPE组织块形式长期保存的临床样本中的应用37。此外，某些组织本身具有极强的自发荧光（如肝脏、脾脏、鼻息肉等），使用传统显微镜方法无法将真实信号与背景自发荧光区分开来，导致发射波长范围相.......

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披露

JFEK 和 MJ 收到来自 ALK Abello A/S 的资助。JFEK 收到来自 Merida Biosciences 的咨询费。

致谢

我们感谢Andrea Radtke博士和Ziv Yaniv博士在IBEX平台的引入和迭代过程中提供的支持。感谢João Bronze de Firmino博士和Mouhanad Babi博士在显微镜使用和故障排查方面的协助，以及麦克马斯特大学先进光学显微中心提供显微镜设备的使用权限。感谢Tina Walker、Jianping Wen和Rangana Talpe Guruge提供的技术支持。本研究得到了由加拿大卫生研究院感染与免疫研究所（CIHR-III）、加拿大卫生研究院循环与呼吸健康研究所（CIHR-ICRH）以及加拿大过敏、哮喘与免疫学基金会（CAAIF）联合资助的经同行评审的食品过敏研究基金的支持。本研究还获得了加拿大卫生研究院（PJT-198169；JFEK）、J.P. Bickell基金会医学研究基金（JFEK）、加拿大过敏、哮喘与免疫学基金会（JFEK、MJ）、加拿大过敏与临床免疫学会（VO、MJ）、Schroeder基金会（JFEK、SW、MJ）、Food Allergy Canada（JFEK、SW、MJ）、ALK Abello A/S公司（JFEK、MJ）、Zych家族（SW、MJ）、Buckrell家族（JFEK）、安大略省研究生奖学金（SD）以及麦克马斯特大学健康科学学士项目（VO）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2N 硫酸（H2SO4）溶液N/AN/A实验室现有或常用者均可
500 mL 烧杯N/AN/A实验室现有或常用者均可
6 孔板N/AN/A实验室现有或常用者均可
Bcl-6 - Alexa Fluor 647BD Biosciences561525稀释倍数 1:100
BD Cytofix/Cytoperm 固定/透化试剂盒BD Biosciences554722
台式解剖显微镜N/AN/A实验室现有或常用者均可
牛血清白蛋白（BSA）SIGMA-ALDRICHA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biosciences561352稀释倍数 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503稀释倍数 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Invitrogen53020282稀释倍数 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532稀释倍数 1:100
CD23 - PEBioLegend338507稀释倍数 1:200
CD3 - iFluor 594AAT Bioquest100320C0稀释倍数 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134稀释倍数 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0稀释倍数 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523稀释倍数 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520稀释倍数 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942稀释倍数 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113稀释倍数 1:100
铬矾-明胶粘合剂Newcomer Supply1033A
冷冻模具（Cryomold）Fisher Scientific NC9511236较大样本亦可使用货号 50-465-347
DAPI 校准玻片Agar ScientificAG2273
DAPI 溶液，1 mg/mLThermoFisher Scientific62248稀释倍数 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307稀释倍数 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228稀释倍数 1:100
Eppendorf 管或 Falcon 管N/AN/A实验室现有或常用者均可
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01
镊子N/AN/A实验室现有或常用者均可
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382稀释倍数 1:100
磨砂端显微镜载玻片ChemScienceGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282稀释倍数 1:100
肝素钠盐SIGMA-ALDRICHH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PE稀释倍数 1:200
人源 TruStain FcX（Fc 受体阻断液）BioLegend422302稀释倍数 1:100
湿盒N/AN/A实验室现有或常用者均可
带盖冰桶N/AN/A实验室现有或常用者均可
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215稀释倍数 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803稀释倍数 1:200
Imaris 文件转换器OXFORD instrumentsN/A将任意图像文件格式转换为 .ims 格式（https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter）
异戊烷（2-甲基丁烷）N/AN/A实验室现有或常用者均可
Ki-67 - Alexa Fluor 488BD Biosciences558616稀释倍数 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 细致任务擦拭纸，单层Kimtech Science06-666
大型（例如 25 cm 长）镊子N/AN/A实验室现有或常用者均可
液氮N/AN/A实验室现有或常用者均可
硼氢化锂（LiBH4）SIGMA-ALDRICH222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Invitrogen53603680稀释倍数 1:100
显微镜载玻片盖玻片 No.1 22x50 mmFisher Scientific 12-542A
超纯水（Milli-Q 水）N/AN/A实验室现有或常用者均可
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488稀释倍数 1:100
Nunc Lab-Tek 带孔盖玻片培养皿ThermoFisher Scientific155380
疏水笔（PAP pen）abcamAB2601
磷酸盐缓冲液（PBS）溶液N/AN/A实验室现有或常用者均可
手术刀N/AN/A实验室现有或常用者均可
SimpleITK Imaris 扩展插件N/AN/A用于对齐不同轮次图像的软件（https://github.com/niaid/imaris_extensions）
蔗糖SIGMA-ALDRICHS0389
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek USA4583
吐温 X-100（Triton X-100）SIGMA-ALDRICHX100
Zeiss LSM 980ZEISS MicroscopyN/A本研究中使用的成像系统
Zen BlueZEISS MicroscopyN/A用于图像采集后处理的软件

参考文献

  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics.

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