通过瘤内注射金纳米棒介导近红外光的光热转换在小鼠肿瘤模型中诱导靶向性轻度高热

摘要

本方案介绍了在实体瘤模型中实施靶向热疗所必需的技术与方法。该方法利用瘤内注射的金纳米棒对近红外光的光热转换作用，从而在肿瘤微环境中诱导局部加热。

摘要

轻度热疗（42–48 °C）是一种成熟的治疗方式，可诱导受控的肿瘤细胞死亡并激发抗肿瘤免疫反应。然而，如何将热量精准传递至肿瘤组织，同时避免周围健康组织受损，仍是重大挑战。传统的热疗方法（如肢体隔离灌注）需要复杂且侵入性的操作，存在较高的局部毒性和患者并发症风险。相比之下，利用近红外光（NIR）激活的金纳米颗粒进行光热治疗，已成为实现局部热疗的一种前景广阔且侵入性更小的策略。特别是金纳米棒（GNRs），具有可调的光学特性和高光热转换效率，是精确调控肿瘤部位温度的理想候选材料。尽管该技术在浅表及易接近的肿瘤治疗中已展现出显著潜力，其递送的可重复性、空间局限性及安全性仍需进一步优化。在本方案中，我们介绍了一种经过验证并优化的方法：通过瘤内注射生物相容性金纳米棒，随后进行短时间、靶向性的近红外激光照射，以实现局部轻度热疗。该方法可在治疗温度范围内快速、可控地升温，促进免疫原性肿瘤细胞死亡，并激活先天免疫反应，这对免疫学上的“冷”肿瘤尤为重要。实时温度监测与局部给药确保了实验的可重复性、安全性以及最小的全身暴露。本简化方案为临床前研究提供了可靠且易于实施的平台，有助于进一步推动轻度热疗在癌症免疫治疗中的应用。

引言

癌症治疗仍面临诸多挑战，包括药物耐药性、免疫逃逸以及脱靶毒性，这些因素均会削弱传统疗法的长期疗效。这些局限性推动了互补治疗策略的发展，旨在克服耐药机制的同时，尽量减少对健康组织的附带损伤。轻度热疗（即组织温度升高至42–48 °C）长期以来被认为是一种有效的辅助癌症治疗手段¹。历史上，轻度热疗常与手术、化疗或放疗联合使用，通过增加肿瘤灌注、破坏间质结构以及增强恶性细胞对细胞毒性药物的敏感性，从而提高这些疗法的疗效¹。近年来，随着免疫治疗在肿瘤学领域取得日益显著的成效，人们越来越关注利用轻度热疗固有的免疫调节潜力，以增强抗肿瘤免疫应答^1,2,3。

尽管肿瘤热疗已显示出明确的临床益处，但其更广泛的应用仍受到限制，主要原因是难以实现对肿瘤的局部化、可控且可重复的加热，同时避免对非靶向组织造成损伤⁴。目前临床和实验中使用的热疗技术，如区域性肢体灌注或全身递送的纳米颗粒方法，常常存在空间精度有限、肿瘤摄取量不稳定以及潜在的系统性毒性等问题^2,5,6,7,8,9。靶向性热疗是癌症治疗领域中一种新兴的治疗模式，旨在选择性地升高肿瘤温度，同时最大限度地减少对周围健康组织的损伤。更具体而言，金纳米棒（GNRs）的靶向递送是一种有望克服当前温和肿瘤热疗在精确性和毒性方面局限性的方法。与其他金纳米结构相比，GNRs因其在近红外（NIR）区域可调的表面等离子体共振特性、高的光热转换效率以及良好的生物分布特性，特别适用于光热治疗应用^10,11。GNRs对近红外波长的响应性使其能够在较深的组织中高效吸收光能并产生局部加热，同时对周围结构造成最小损伤。因此，GNRs可在热疗中提供更高的疗效、更优的靶向性以及更好的安全性。

本方法旨在提供一种高效、低资源消耗且可重复的方案，用于实现由金纳米棒介导的温和性实体瘤热疗。该技术称为金纳米棒介导的靶向热疗（THT），通过将金纳米棒直接注射入肿瘤组织并结合外部近红外光（NIR）激活，克服了传统热疗方法的关键局限性。该策略可确保肿瘤局部具有高浓度的纳米颗粒，从而提高实验的可重复性和安全性，尤其适用于那些难以有效富集经全身给药的治疗剂的小型或血管化程度较低的肿瘤。此外，通过直接瘤内注射金纳米棒后暴露于近红外光（NIR）下，可实现对肿瘤组织的精确、可控且局限性的加热，同时最大限度减少与传统区域性热疗技术相关的全身暴露、毒性和脱靶效应。

多种癌症表现出复杂且多样的免疫逃逸机制，使其能够通过多种方式抵抗免疫治疗，最明显的表现是肿瘤微环境中免疫细胞浸润不足^2,4,5。轻度热疗与免疫治疗联合使用时可产生协同效应。除了直接的细胞毒性作用外，轻度热疗优先诱导免疫原性细胞死亡（ICD），导致肿瘤相关抗原（TAAs）和损伤相关分子模式分子（DAMPs）的释放^1,2。这些信号可激活先天免疫通路，增强肿瘤抗原呈递，促进树突状细胞成熟，并增强T细胞启动，最终增加免疫细胞向肿瘤微环境的浸润^1,6,12。在我们自己的临床前模型中，这种金纳米棒介导的靶向热疗（GNR-mediated THT）技术能够激活局部免疫反应并增强肿瘤的免疫细胞浸润¹³。当该GNR介导的THT技术与瘤内注射白细胞介素-2（IL-2）治疗或全身性抗PD1检查点抑制联合使用时，在乳腺癌和黑色素瘤模型中进一步增强了抗肿瘤免疫反应，效果优于任一单一疗法¹³。这些结果与越来越多的证据一致，表明纳米粒子介导的热疗与免疫治疗在实体瘤（包括乳腺癌^14,15,16和脑肿瘤^17,18）中具有协同作用。简而言之，通过将免疫学上的“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，GNR介导的THT可提高肿瘤对免疫治疗（包括检查点抑制剂）的响应性^1,2,12。

本文介绍的金纳米棒介导的THT方案资源消耗低、技术操作简便，且可广泛适用于皮下或浅表肿瘤。该技术特别适合开展皮下或浅表肿瘤小鼠模型研究的研究人员，包括黑色素瘤和乳腺癌模型。然而，经过少量修改后，该方法也可拓展至其他肿瘤类型和解剖部位。此外，该技术为在临床前癌症研究中整合空间可控的热疗提供了灵活的平台，尤其适用于探索免疫治疗增效策略，以及利用轻度热疗提高免疫治疗疗效或克服免疫治疗耐药性的研究。进一步而言，实施该技术所需的知识和设备易于获取，可适应多种医疗环境，从而增强了其在更广泛临床应用中的可行性³。

在本论文中，我们提供了在小鼠模型中使用860 nm近红外激光系统实施金纳米棒介导的靶向热疗（THT）方案的详细分步操作指南。该方案的成功依赖于利用适当波长的近红外光高效激活深层组织中的金纳米棒。我们还强调了在小鼠肿瘤模型中实现稳定、安全且有效的轻度高温剂量控制所需的操作要点，例如在整个过程中对肿瘤内部温度进行精确的实时监测。本方法在既往报道的纳米颗粒热疗技术基础上进行了整合与优化，为临床前癌症研究提供了一种全面、经过验证、高度精确且可重复的新方案。总体而言，该技术是一种生物学安全性高、成本较低且毒性低的肿瘤局部热疗递送方法，具有显著增强现有癌症免疫疗法疗效的潜力，并有望拓展热疗在肿瘤学中的临床应用范围。

方案

所有实验方案均经达尔豪斯大学实验动物委员会根据加拿大动物护理委员会的伦理标准批准。本研究遵循所有适用的国际、国家和机构关于动物护理和使用的指南。有关本方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表。

1. 激光器与治疗设施要求

1. 确保使用经过完全校准的激光系统，该系统能够提供波长为 860 ± 10 nm、强度高达 4,000 mA 的光输出，并具备适当的关闭机制。
   注：本研究中使用了自行设计的激光器。本方案所用型号配备有激光启用钥匙、紧急停止按钮和联锁跳线（该跳线可连接至安全开关，以满足安全合规要求，例如用于四类激光实验室门禁控制）。
2. 安装可插入式、经过校准的温度探针，用于肿瘤内温度监测，并可通过相应的热电偶记录软件实时传输温度数据。
3. 准备符合相应激光等级安全标准的专用激光操作室。确保工作区域畅通无阻，具备良好的通风、照明条件，并覆盖所有反光表面。激光运行期间限制人员进入，以防止意外暴露。确保所有参与研究的人员均已接受完整的激光操作与安全规程培训，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）和眼部保护装置。
4. 在激光室内设置工作区，能够就近放置麻醉机并与激光装置协调使用。确保激光器安装稳固且可调节，实验对象可被准确定位于距离激光束源约 1–2 cm 处，以实现对肿瘤部位的精确照射。
5. 将热成像相机安装在三脚架上，并调整位置，以便在整个激光照射过程中持续捕捉实验对象体表的温度读数。

2. 细胞培养与接种（肿瘤细胞注射）

1. 根据感兴趣的肿瘤类型选择合适的小鼠模型，并遵循标准化的实验室细胞培养制备与维持技术。为执行本方案，选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠用于CT26肿瘤接种。
   注意：可根据研究需求使用不同年龄和品系的免疫健全或免疫缺陷小鼠。
2. 将CT26癌细胞系培养于RPMI 1640培养基中，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM谷氨酰胺。将细胞维持在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中。每2-3天更换一次培养基，并在细胞融合度达到70-80%时以1:4至1:10的传代比例进行传代。使用早期代次的细胞（例如，≤10代）以确保稳定的生长特性和接种效率。根据需要扩增培养，以获得接种所需的细胞数量。
   注意：每只小鼠所需的细胞数量因模型而异，例如，在CT26小鼠结直肠癌模型中，每只小鼠需要5 × 10⁵ 个细胞。
3. 使用胰蛋白酶消化法使贴壁细胞脱落，并用无菌1×PBS洗涤两次。将细胞重悬于无菌1×PBS溶液中，调整浓度至5 × 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液置于无菌的2 mL微量离心管中，冰上保存，注射前最长放置时间不超过1小时。
4. 注射前，使用诱导舱以0.8 L/min的气流速度和4%气化异氟烷对小鼠进行麻醉。麻醉后，将异氟烷浓度降至2%，并在接种过程中通过鼻罩维持麻醉状态。通过脚趾夹捏试验确认麻醉深度，确保无疼痛反应。在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥并减少潜在的激光损伤。
5. 使用电动剃毛器剃除注射部位（例如，本异位CT26模型选择左侧 flank 区域）的毛发，并用酒精棉片清洁该区域，以去除碎屑并消毒皮肤。捏起注射部位的皮肤，使用26 G针头和1 mL注射器皮下注射100 µL细胞悬液（浓度为5 × 10⁶ 个细胞/mL）。注射完成后，将小鼠从鼻罩移开，并放回笼中，在保温毯上恢复1小时。

3. 肿瘤生长与测量

1. 通常从注射后第7天开始，使用肿瘤测量卡尺每日进行肿瘤测量。测量肿瘤的三个轴向尺寸：宽度、长度和高度，并采用椭球体肿瘤体积公式 π/6 × 长度 × 宽度 × 高度 计算肿瘤体积。
2. 当肿瘤体积达到约 50 mm³ (± 20 mm³) 时，计划启动金纳米棒介导的热疗（GNR-mediated THT）。
   注意：在我们的 CT26 模型中，肿瘤体积通常在肿瘤细胞注射后第10至12天之间达到该范围。
3. 在激光治疗前，确保将小鼠随机分配至对照组和治疗组。治疗组将接受瘤内注射金纳米棒（GNR），随后进行激光照射；对照组则注射与GNR相同体积的磷酸盐缓冲液（PBS）代替金纳米棒，随后同样接受激光照射。

4. 利用肿瘤内金纳米棒（GNRs）实现近红外光的光热转换

1. 在无菌生物安全柜中，使用带有31 G针头的0.3–1 mL注射器，根据每个肿瘤体积吸取相应体积的GNRs。
2. 以与注射癌细胞相同的方式麻醉小鼠（通过鼻罩输送 2% 异氟烷，流速为 0.8 L/min，并通过脚趾夹捏试验确认麻醉深度是否足够）。
3. 麻醉后，将异氟烷浓度降至2%，并将小鼠俯卧位放置于激光平台上，通过鼻罩维持麻醉。在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥并尽量减少潜在的激光损伤。
4. 如有必要，剃除肿瘤周围的多余毛发，以确保皮肤表面暴露于激光。使用乙醇对肿瘤表面进行消毒，并擦去任何毛发或碎屑。
   注意：本研究中使用的金纳米棒（GNRs）在860 nm处具有优化的吸收峰。若使用与本文推荐不同的GNRs产品，需根据该GNRs的吸收光谱优化近红外激光波长的输出。
5. 激光照射前，以每立方毫米肿瘤组织1 µg的浓度将金纳米棒（GNRs）瘤内注射³ 肿瘤体积。如有必要，可将注射液分至两个瘤内位点注射，以确保金纳米棒（GNRs）在肿瘤内部的有效分布。
   注意：在本方案视频中，使用的金纳米棒（GNRs）浓度为 2 µg/µL；因此，对于 50 mm³ 肿瘤内注射25 µL的GNRs。每次注射后，务必擦去皮肤表面多余的GNRs。
6. 对于对照组小鼠，注射与GNR注射组等体积的无菌PBS进行瘤内注射（例如，若GNR组注射体积为50 mm时，则注射25 µL PBS）³ 肿瘤
7. 用乙醇对瘤内温度探针进行消毒，并轻轻将其插入肿瘤组织的中心。
8. 在肿瘤表面均匀涂抹约5 mm厚的芦荟凝胶，以防止皮肤溃疡，并在治疗期间最大限度降低热损伤风险。
9. 确保激光调整至正对肿瘤中心的上方位置。使用辐照度查找表（表1根据所需的激光束直径以覆盖肿瘤表面积来确定合适的激光高度。根据肿瘤直径优化激光高度，以确保能量输送的一致性。
   注意：在我们的实验中，直径为1.3 cm的肿瘤需要设置激光高度为1.5 cm。
10. 打开激光器和热电冷却（TEC）电源，然后将激光系统接入电源（根据制造商协议进行调整）。开启热电冷却电源；等待蓝色LED灯亮起，且激光器TEC源的温度在30秒后稳定在25 °C。
11. 使用辐照度查找表（表1) 以达到 1 W/cm 的目标辐照度² ± 0.2 W/cm² 通过调节激光器电流输出（旋转激光源旋钮至所需的电流设定值）。
    注意：在本实验中，激光高度为1.5 cm，光束直径为1.3 cm，激光电流为1,800 mA，所得辐照度为0.82 W/cm²²，该条件针对此肿瘤模型进行了优化。
    ​从此时起，确保激光操作室内所有人员佩戴经认证的、适用于所用光波长的激光防护眼镜。
12. 在激光操作平台旁设置热成像相机，对准小鼠，以监测激光处理过程中皮肤表面温度。
13. 在热电偶记录软件中，新建一个文件并点击 记录 按钮。确保实时显示肿瘤内部温度随时间变化的曲线图。
14. 转动安全钥匙以启用激光源输出。踩下脚踏板开始激光照射。
    注意：在本方案中，树莓派控制器作为脚踏板与激光源之间的内部接口。
15. 检查并确保计算机软件在激光束照射注射了金纳米棒的肿瘤后，能够检测到肿瘤温度的升高。
    注意：激光启动后，肿瘤内部温度将开始上升，进入目标热疗范围（42 °C）所需时间约为15秒至2分钟，具体时长取决于肿瘤模型的大小和类型。
16. 将肿瘤内部温度维持在热疗范围（42 °C 至 48 °C）持续完整的 5 分钟。持续监测肿瘤内部温度，若接近 48 °C，松开脚踏板，使温度回落。在温度-时间显示图上实时观察温度下降情况。当肿瘤内部温度降至约 43 °C 时，再次踩下脚踏板，重新启动激光照射。通过反复踩下与松开脚踏板的循环操作，使肿瘤内部温度在适宜的热疗范围内维持完整的 5 分钟，并持续监测温度-时间显示图。
    1. 在5分钟的热疗期间，若肿瘤温度在任何时刻降至42 °C以下，应延长热疗时间以补偿温度不足的时间。例如，若温度低于42 °C持续20秒，则在初始5分钟的基础上增加20秒热疗时间。部分注射了金纳米棒（GNRs）的肿瘤可能无法达到48 °C，此时无需进行激光的开关循环。
       注意：在瘤内注射PBS的对照小鼠中，肿瘤温度不会达到高温范围。如有需要，尽管预期这些小鼠不会产生高温反应，其激光的开启/关闭循环模式应与GNR处理组保持一致。
17. 在整个肿瘤热疗过程中，持续监测皮肤表面温度，确保其低于50 °C。无论肿瘤内部温度如何，一旦皮肤表面温度达到50 °C，应立即关闭激光以进行冷却。若在不使皮肤温度超过50 °C的前提下无法使肿瘤内部温度达到目标热疗范围，可降低激光功率和/或在肿瘤部位额外涂抹芦荟凝胶以帮助散热。当肿瘤内部温度维持在热疗范围5分钟后，松开脚踏开关以停止激光照射，使肿瘤内部温度降至约37 °C，并关闭激光安全钥匙。
    注意：为尽量减少可能导致肿瘤溃疡的皮肤损伤，应将皮肤温度控制在50 °C以下。¹⁹.
18. 监测肿瘤内部温度探针，使肿瘤温度降至约 37 °C。轻柔地将温度探针从肿瘤中取出，并擦去肿瘤表面残留的芦荟凝胶。
19. 将小鼠从鼻式麻醉装置中取出，在放回笼具前观察其苏醒情况。术后恢复期间，将笼具部分置于37 °C加热垫上，使小鼠可根据需要在较暖和较凉区域之间移动，以调节体温。密切观察每只小鼠，确保其恢复至正常行为后，再将其送回饲养设施。

结果

本金纳米棒（GNR）介导的肿瘤热疗（THT）方案旨在将实体瘤持续且可靠地加热至理想的轻度高热范围（42–48 °C）。该实验流程的主要步骤如图1所示。本方案成功的关键在于在特定的实体瘤模型中建立并维持可控且可重复的轻度高热状态。所使用的金纳米棒采用一种专利的无十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）方法合成，该方法通过在专有表面活性剂溶液中还原金盐，促进棒状晶体的生长。合成后，大部分原始表面活性剂被低分子量聚乙二醇（PEG）取代，以提高生物相容性。所得金纳米棒尺寸均一（51.1 ± 10.8 nm × 12.2 ± 1.9 nm），最佳激发波长为860 ± 10 nm，且未检测到内毒素。

为确保肿瘤得到适当的加热并准确追踪温度，必须将瘤内温度探针插入肿瘤中心。此外，在整个过程中使用热成像仪监测皮肤表面温度至关重要。对于体积较小的肿瘤，瘤内注射的金纳米棒（GNRs）可能会扩散至肿瘤周围和/或皮下区域。当暴露于近红外光时，这可能导致皮肤温度升高至基础生理水平以上；若皮肤温度超过轻度热疗范围（高于50 °C），则可能引起皮肤损伤，如结痂和/或溃疡¹⁹。在肿瘤表面涂抹一层芦荟凝胶是一项重要的预防措施，有助于调节皮肤表面温度，防止近红外激光照射期间发生热损伤。无论何种情况，均建议在热疗（THT）后的48小时内密切观察治疗区域是否出现溃疡迹象。图2展示了优化肿瘤温度管理的建议装置示意图，显示了内部肿瘤温度探针与芦荟凝胶层相对于近红外激光探针的位置关系。

通过观察激光操作过程中肿瘤内部温度随时间变化的曲线，可以判断本实验方案的相对成功率。对于瘤内注射了金纳米棒（GNRs）的小鼠，肿瘤预计在15秒至2分钟内升温至轻度高热范围（42–48 °C）。一旦肿瘤内部温度进入轻度高热范围，温度应在此范围内趋于平稳，或需采用激光间歇照射的方式，以确保肿瘤内部温度不超过48 °C（如图3A所示）。成功将轻度高热状态维持5分钟被视为阳性结果。对于瘤内注射磷酸盐缓冲液（PBS）的小鼠，肿瘤不应升温至高热范围。单独暴露于波长为860 nm的近红外光不足以使组织升温至轻度高热范围，对照组肿瘤的温度预计在39–40 °C左右达到平台期。图3B展示了在5分钟实验过程中，注射GNRs的小鼠与对照组（注射PBS）小鼠的肿瘤内部温度随时间变化的曲线图。若注射GNRs的肿瘤在近红外光照射下未能达到高热范围，或无法在整个5分钟内维持在适当的高热范围内，则被视为阴性结果。

为评估金纳米棒介导的热消融治疗（GNR-mediated THT）方案的成功程度，需进行额外的下游分析，包括检测治疗后肿瘤体积的变化。成功实施的GNR介导THT可导致靶向性肿瘤细胞死亡并激活抗肿瘤免疫反应，从而引起肿瘤退缩及肿瘤体积减小¹³。图4展示了在两种皮下 flank 小鼠癌症模型（B16-黑色素瘤和CT26-异位结直肠癌模型）以及一种乳腺脂肪垫小鼠癌症模型（4T1-乳腺癌）中，GNR介导THT治疗后肿瘤体积的变化情况。在每种模型中，与对照组相比，GNR介导THT术后48–72小时即可观察到肿瘤体积显著减小。术后肿瘤体积减小的时间进程和程度预期会因小鼠品系和癌症模型的不同而有所差异。除了肿瘤缩小外，我们在B16F10和4T1模型中均观察到GNR介导THT后48小时内即出现强烈的先天免疫反应，表现为STING-cGAS通路相关基因表达上调，以及树突状细胞、巨噬细胞和NK细胞的上调与活化¹³。值得注意的是，在双侧4T1肿瘤模型中，GNR介导的THT诱导了系统性免疫反应，表现为未治疗对侧肿瘤中CD8⁺ T细胞浸润增加¹³。这些发现进一步支持该策略在诱导直接细胞毒性和更广泛的免疫调节抗肿瘤效应方面的潜力。

表1：辐照度查找表。 本表提供了不同激光器电流输出设置（mA）和工作距离（cm）下的辐照度值（W/cm²）。该表用于根据覆盖肿瘤表面所需的光束直径，确定合适的激光器高度，以达到目标辐照度1 W/cm² ± 0.2 W/cm²。以绿色高亮的数值表示接近1 W/cm² 的最佳辐照度水平。此辐照度表专用于LDX激光器，由制造商提供。请点击此处下载该表格。

图1：金纳米棒介导的靶向热疗（THT）操作示意图。在小鼠模型中对皮下侧腹部肿瘤实施金纳米棒介导的靶向热疗的方法流程。在形成可触及的肿瘤（约 50 mm³）并完成小鼠麻醉后，（1）以 1 µg/mm³ 的浓度将金纳米棒（GNR）瘤内注射；（2）将温度探针插入肿瘤组织中心；（3）在肿瘤表面覆盖约 5 mm 厚的芦荟凝胶层；（4）开始近红外（NIR）激光照射；（5）将肿瘤内部温度维持在轻度高热范围（42 °C–48 °C）持续 5 分钟。缩写：GNR = 金纳米棒；THT = 靶向热疗；NIR = 近红外。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：实验装置的可视化示意图。 一只携带异位结肠直肠肿瘤的BALB/c小鼠，肿瘤内中央位置插入了瘤内温度探头，并在肿瘤表面局部涂抹芦荟凝胶层，随后接受近红外激光束照射。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：实时肿瘤内部温度图。 在近红外激光照射肿瘤期间，由内部温度探针记录的代表性肿瘤内部温度随时间（单位为毫秒）变化曲线。( A ) 在注射了金纳米棒（GNR）的小鼠中，为维持肿瘤内部温度在轻度高热范围（42 °C–48 °C）持续5分钟所需的近红外（NIR）激光开关循环模式。这突显了在整个实验过程中密切监测肿瘤内部温度并循环开启/关闭激光以维持目标高热温度范围的重要性。( B ) 在持续5分钟的近红外激光照射期间，注射GNR的小鼠（n = 15）与对照组（注射PBS）小鼠（n = 8）之间肿瘤内部温度的平均差异。尽管接受相同时长的近红外激光照射，注射PBS的小鼠肿瘤温度并未升高至轻度高热范围，温度趋于平稳，约为39–40 °C，而注射GNR的小鼠肿瘤温度则达到42–48 °C的高热水平。缩写：GNR = gold nanorod；NIR = near-infrared。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：GNR介导的THT治疗后的肿瘤体积变化图。 GNR介导的THT在治疗后48–72小时内可诱导多种小鼠癌症模型的肿瘤体积缩小。（A）4T1（乳腺癌）模型在GNR介导的THT治疗后的肿瘤体积测量结果（n = 24 PBS，n = 28 THT）。（B）B16-F10（黑色素瘤）模型在GNR介导的THT治疗后的肿瘤体积测量结果（n = 19 PBS，n = 23 THT）。（C）CT26（结直肠癌）模型在GNR介导的THT治疗后的肿瘤体积测量结果（n = 9 PBS，n = 9 THT）。治疗后48–72小时内肿瘤体积增长减缓或缩小，提示治疗呈阳性结果。CT26模型在“治疗前24小时”时间点的肿瘤体积数据未合并显示——因数值相近且存在重叠。误差线表示标准误（SEM）。* p < 0.05。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

方案中的关键步骤
该金纳米棒介导的热疗技术的设计与实施，能够实现对实体瘤进行靶向性、精确、低资源消耗且可重复的加热。 体内该系统的一个关键优势在于其空间精确性和热控制能力，可实现局部治疗，同时不损伤周围组织。光热转换成功的关键步骤之一是确保所用金纳米棒（GNRs）与近红外（NIR）光源之间的匹配性。在本研究中，我们采用的GNRs在860 nm波长处具有优化的吸收性能。在该波长下，光可有效穿透组织，并在含GNRs的肿瘤中选择性产生热量，而周围健康组织则保持接近生理温度。²⁰此外，在执行本方案时，准确实时监测肿瘤内部温度对于确认达到轻度高温范围并确保治疗持续稳定进行至关重要。瘤内温度探针的放置位置如图所示 图2，可实现对肿瘤热剂量的实时监测，如图所示 图3B.

技术故障排除
根据不同的 体内 模型和肿瘤类型，可能需要对实验方案进行轻微调整以优化结果。例如，在图4所引用的小鼠黑色素瘤、结直肠癌和乳腺癌模型中，我们已将金纳米棒（GNR）与肿瘤体积的浓度比优化为 1 µg/mm³。 我们还通过在注射金纳米棒后立即进行近红外（NIR）激光照射来优化该方案的效率，因为在比较该注射与治疗时间点与较长间隔（0.5、1、4、18 或 24 小时）时，并未观察到治疗效果的差异。对于在肿瘤病理生理学或体内定位方面与我们模型不同的肿瘤模型，可能需要采用不同的金纳米棒浓度，并在不同时间点注射，以达到并/或维持在热疗温度范围内。完成此操作后，应每日测量肿瘤体积，以记录肿瘤体积的变化。治疗后 2–3 天内出现肿瘤消退是治疗成功的积极指标。

由于激光操作方案的特性，表皮灼伤和溃疡是潜在的风险因素，尤其是在色素沉着或敏感皮肤上。根据所使用的体内模型，可能需要调整激光电流输出，以维持皮肤表面与内部肿瘤温度之间的适当平衡。例如，我们发现，由于皮肤中水分含量和黑色素的差异²¹，与BALB/c小鼠相比，C57Bl/6小鼠需要以较低的电流进行近红外（NIR）激光照射，以使皮肤温度保持在50°C以下。在调整激光电流输出时，应相应调节激光高度，确保目标辐照度维持在1 W/cm² ± 0.2 W/cm² ，同时仍使激光光束直径覆盖大部分肿瘤表面。或者，在操作过程中额外涂抹芦荟凝胶有助于降低皮肤温度，而不会显著影响肿瘤内部温度。通过必要的调整维持适当的皮肤表面温度，对于最小化溃疡风险至关重要，而溃疡已被观察到是该治疗的潜在副作用。在调整芦荟凝胶层时，应暂时停止近红外激光束的照射。在激光操作方案实施后的数天内，应密切监测小鼠是否出现潜在的灼伤和/或溃疡。

金纳米棒介导的热疗的局限性
进行该操作时必须解决的一个主要安全问题是，在使用激光过程中需佩戴针对所用光波长认证的激光防护眼镜。激光系统应具备内置安全功能，例如钥匙互锁装置，以防止意外启动。然而，仍需额外的个人防护装备——特别是合适的激光安全护目镜——以防止受到反射或散射光束的潜在暴露。眼睛是对激光束损伤最敏感的器官，其中近红外激光尤其可能导致视网膜灼伤²²。最后，所有操作激光的人员必须接受适当的培训。

本方案选择瘤内注射金纳米棒（GNR）而非全身性注射，以最大限度地降低系统性毒性，限制纳米颗粒在肝脏、脾脏和肾脏等非靶向器官中的分布，并提高热疗的准确性、疗效和安全性。然而，由于本方案需要进行瘤内注射GNR，其在某些肿瘤模型中诱导热疗的能力可能受到限制。迄今为止，我们已在皮下肿瘤和乳腺脂肪垫肿瘤中验证了该方法的有效性，这两类肿瘤均靠近皮肤表面，便于GNR注射和近红外光（NIR）照射。对于位于体腔内部（如腹膜）的肿瘤，或试图靶向原发肿瘤的转移灶时，可能面临操作上的困难。对该方案的一种潜在改进方式是采用全身性GNR注射，前提是纳米颗粒经过工程化设计或修饰，以确保在NIR照射前能有效富集于肿瘤部位²³。此外，瘤内注射GNR可能导致纳米颗粒在肿瘤内分布不均，从而影响加热的均匀性。然而，考虑到本GNR介导的热疗（THT）方案的主要目标是诱导免疫原性细胞死亡（ICD）以激活抗肿瘤免疫反应，肿瘤加热的非均匀性预计不会对治疗效果的程度产生显著影响。最后，瘤内温度读数依赖于温度探针在肿瘤内的位置。肿瘤中心是最理想的探针放置位置，能够最准确地反映肿瘤整体的平均温度。然而，若因肿瘤大小和/或形状导致难以确保或确认探针位于中心位置，则可能需要在不同位置使用两个或更多温度探针进行记录。

相对于现有方法的意义
本论文提供了一种全面、优化且可重复的金纳米棒（GNR）介导的实体瘤及浅表可及肿瘤热疗（THT）实验方案。与其他诱导热疗的方法相比，该技术具有显著优势，即资源需求低、空间定位精确，并且系统性毒性极小。尽管金纳米棒在光热治疗中的应用已有大量文献报道，但不同研究在实验方案的具体实施上仍存在较大差异。关键实验步骤，如近红外（NIR）照射时间、温度监测工具的选择（热电偶探针或红外热成像仪）、金纳米棒溶液的制备以及金纳米棒的注射方法，常因研究而异。

例如，其他方法需要更长的（20 分钟）²⁴ 或多次（4 次 × 15 分钟）²⁵ 近红外照射才能达到与我们相当的效果。此外，大多数实验方案仅使用热电偶探针或热成像相机中的一种，很少同时结合这两种工具^26,27。另外，金纳米棒（GNR）溶液通常使用 CTAB 制备^28,29,30，其递送方式在全身注射^24,30 和瘤内注射³¹之间有所不同，这可能影响其在肿瘤微环境（TME）中的分布和定位。因此，目前尚未建立一种全面且可调节的、能够优化并改进现有方案的金纳米棒介导的热疗方法。

本方案通过整合文献中最具效果且可重复性高的各项技术，形成一种统一且标准化的方法，从而弥补了上述不足。具体而言，我们采用双重温度监测（热电偶与热成像仪）以确保热剂量的精确性和安全性；通过瘤内注射不含CTAB的金纳米棒（GNRs），以最大化其在肿瘤部位的富集并降低毒性；同时引入芦荟凝胶以防止表皮皮肤灼伤。此外，本方案所用的金纳米棒在860 nm近红外光下具有高效的光热转换性能，可在数秒内迅速达到轻度热疗所需温度。一旦达到该温度范围，即可在5分钟治疗周期内稳定维持，我们已确定该时长足以诱导免疫原性细胞死亡并激活免疫反应。860 nm近红外光波长本身在组织穿透深度与安全性之间也达到了理想平衡，进一步拓宽了该疗法的治疗窗口。

总之，我们的实验方案为现有的金纳米棒介导的热疗方法提供了一种整合的、经过验证且具有生物学有效性的替代方案，并通过提供一种完全详细且可调整的方法，填补了该领域的关键空白，适用于临床前癌症研究和联合治疗的开发。

该技术的未来应用
最后，尽管本方案可轻松地与多种癌症治疗方法联合使用，但由于THT本身具有激活抗肿瘤免疫反应的能力，因此特别适用于增强免疫治疗的效果。通过诱导免疫原性细胞死亡、促进肿瘤特异性抗原的释放，并在治疗后48小时内增加募集到肿瘤微环境（TME）的天然免疫细胞数量，GNR介导的THT有助于使免疫学上“冷”的肿瘤重新“敏感化”，从而被免疫系统识别并攻击¹³。因此，该技术可用于提高免疫疗法对原本可能已产生耐药性的癌症的治疗效果，为克服癌症治疗障碍和疾病进展提供了一种潜在策略¹³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶	赛默飞世尔科技	25200-056
10 mL 移液管	Fisher Scientific	7200574
15 mL Falcon管	康宁	352095
1 mL 注射器	BD 生物科学	3331431
28 号针头	BD 生物科学	1298811
4T1 乳腺癌细胞系	美国典型培养物保藏中心	CRL-2539
5 mL 移液管	Fisher Scientific	7200573
50 mL Falcon管	Fisher Scientific	14-432-22
70% 乙醇	商业酒精	36195
芦荟凝胶	Life品牌	57800985495
B16-F10 黑色素瘤细胞系	美国典型培养物保藏中心	CRL-6475
BioRender	BioRender	N/A
生物安全柜	Nuaire	N/A
4类激光安全护目镜	laservision	F22.P5P18.5000	我们使用了带有 P5P18 滤光片的 P22 支架
一氧化碳2 培养箱（37 °C，5% CO2)	Nuaire	N/A
Corning 1-200 µL 通用适配架装移液器 提示	康宁	4865
康宁带滤芯吸头 提示，30 µL	Fisher Scientific	07-200-265
CT26 小鼠结直肠细胞系	美国典型培养物保藏中心	CRL-2638
DPBS	赛默飞世尔科技	10010-049
Eppendorf管	赛默飞世尔科技	3451
雌性BALB/c小鼠	查尔斯河实验室（加拿大蒙特利尔）	028
雌性 C57Bl/6	Charles River Laboratories（加拿大蒙特利尔）	027
胎牛血清	赛默飞世尔科技公司英维特罗根	12483020
GNR	Sona Nanotech Inc	N/A
肿瘤内温度探针	OMEGA	HYP1-30-1/2-T-G-60-SMP-M	热电偶探头型号 HYP-1
IsoTip 1000 µL 通用滤芯吸头 提示	康宁	4809
LDX 激光器（型号：LDX-3520-860-HHLFC）	Minnetronix	N/A	激光电流设定点最大值为 4600 mA
Optixcare 眼部润滑膏	Aventix	N/A
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140148
Prism 10.6.0	Graphpad	N/A
RPMI 1640 培养基	赛默飞世尔科技	11875119
TC-08热电偶数据记录仪软件	Pico Technology	PicoLog V5.25.3
热成像仪	HIKmicro	EA-1086922
组织培养皿 100 × 20 mm	Fisher Scientific	877222
0.4% 台盼蓝溶液	赛默飞世尔科技	15250061
肿瘤测量卡尺	吉尔斯科学株式会社 三丰株式会社	500-321