细胞因子处理的牙周膜干细胞中与牙周炎相关的候选生物标志物的生物信息学鉴定

摘要

本研究旨在通过生物信息学分析，探讨细胞因子处理的牙周膜干细胞中表达失调的基因。研究鉴定出上调的ERC2-IT1和下调的EPB41L4A-AS1为这些细胞中的关键分子，可能作为与牙周炎相关的候选生物标志物。

摘要

本研究的主要目的是探讨细胞因子诱导的牙周膜干细胞（PDLSCs）潜在的分子机制。从基因表达综合数据库（GEO）中获取了GSE260558数据集的微阵列数据。经过标准化处理后，鉴定出差异表达基因。随后，对差异表达的mRNA（DE-mRNA）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。接着，基于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络筛选出核心基因。最后，利用ENCORI网站构建包含核心基因的竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络。使用R语言中的limma软件包共鉴定出739个差异表达的长链非编码RNA（DE-lncRNA）和809个差异表达的mRNA（DE-mRNA）。GO和KEGG分析结果表明，这些DE-mRNA在经细胞因子处理的PDLSCs中与炎症反应及细胞外基质形成密切相关。针对DE-mRNA构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过评估节点度数筛选出核心基因。共筛选出12个上调的核心基因和12个下调的核心基因。随后分别利用这些上调和下调的核心基因构建ceRNA调控网络。在这些网络中，上调的ERC2-IT1和下调的EPB41L4A-AS1被认为是牙周炎中的关键lncRNA。综上所述，生物信息学分析揭示了多个参与细胞因子诱导PDLSCs进展的关键基因及ceRNA调控网络。尽管本研究鉴定出若干与牙周炎相关的候选生物标志物，但仍需在动物模型或临床样本中进一步开展实验验证。

引言

根据世界卫生组织的认定，牙周炎是人类中最常见的第六大普遍性、不可逆的慢性炎症性疾病^1,2。在当前时代，全球约有15%的人口受到该病影响^1,2,3。已有研究报道，牙周炎与多种因素密切相关，包括年龄、性别、口腔卫生习惯、吸烟状况、种族、较低的社会经济地位以及多种全身性疾病^2,3,4,5。牙周炎在老年人群中患病率显著较高，其病理起因是附着于牙齿表面的龈下微生物群发生生态失衡性改变^6,7。若不加以治疗，该疾病最终将导致骨组织破坏、牙齿移位，并造成牙齿的不幸丧失⁸。因此，迫切需要深入理解牙周炎的分子机制，并识别可用于疾病诊断的生物标志物。

牙周组织的结构与相互作用的复杂性被广泛认为是导致牙周再生过程中面临巨大困难的重要因素之一^9,10在用于牙周组织再生的多种间充质干细胞（MSCs）中，牙周膜干细胞（PDLSCs）已被充分证实是形成类牙骨质结构的可靠来源 体内 环境^11,12在最近开展的多项临床前研究中，基于PDLSCs的治疗在组织再生领域展现出极为可观的应用前景^13,14与患者牙龈组织相比，牙周膜干细胞的转录组学分析显示出更强的功能定向性和治疗转化潜力^13,14.

生物信息学技术和生物信息学分析方法使研究人员能够识别与蛋白质组学、基因组学和代谢组学数据相关的潜在生物学过程和关联^15,16。此外，生物信息学技术的高通量特性还使研究人员能够分析大规模的生物数据集，例如来自下一代测序和微阵列实验的数据^17,18。这一能力有助于识别可用于疾病诊断和预后的潜在生物标志物^19,20。例如，通过基于生物信息学技术的综合分析，已在牙周炎患者牙龈组织中鉴定出整联蛋白裂解酶样金属蛋白酶28（ADAM28）以及含血小板反应蛋白I型基序样结构域的整联蛋白样金属蛋白酶域蛋白3（ADAMTSL3）作为新的生物标志物²¹。此外，已有研究报道多个与铁死亡相关的基因，包括核受体共激活因子4 (NCOA4)、溶质载体转运蛋白1A5（SLC1A5）和热休克蛋白B1（HSPB1），在牙周炎中具有更好的诊断价值²²。然而，牙周炎的分子机制仍需进一步探索。在本研究中，研究人员致力于利用生物信息学技术探究细胞因子诱导的牙周膜干细胞（PDLSCs）中的核心基因，并识别与牙周炎相关的潜在生物学过程和通路。对经细胞因子处理的PDLSCs进行生物信息学分析，可捕捉与PDLSC功能障碍相关的炎症驱动转录程序，从而填补PDLSC功能障碍与牙周炎之间的研究空白。这些在细胞因子诱导的PDLSCs中发现的核心基因和通路，为理解牙周炎的统一发病机制提供了有价值的见解。

方案

1. 数据集

本分析使用了公开可用的数据，未涉及人类或动物受试者，符合机构和JoVE的伦理准则。有关所用平台的所有信息均列在材料表中。

1. 从 GSE260558 数据集（美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE260558）中选择共计 6 个样本（GSM8119437、GSM8119438、GSM8119439、GSM8119440、GSM8119441 和 GSM8119442）用于生物信息学分析。
2. 在这些样本中，将牙周膜干细胞（PDLSCs）在正常培养基或含炎症细胞因子的培养基中培养 7 天。
3. 提取 PDLSCs 的总 RNA 并进行高通量测序²³。生物信息学分析流程如图 1所示。

2. 差异表达基因的鉴定

1. 使用limma软件（版本：3.46.0）分析lncRNA和mRNA的表达谱，方法如前所述²⁴。
2. 在细胞因子组与正常组之间进行成对比较。
3. 采用错误发现率（FDR）校正方法，以标准阈值< 0.05筛选显著差异表达的基因。使用校正后的p值（FDR）控制统计学显著结果中假阳性结果的比例。
4. 以校正P值阈值< 0.05和倍数变化阈值> 1筛选显著失调的lncRNA或mRNA。
5. 使用R软件（版本4.0.4）生成火山图（ggplot2：版本3.4.1）展示差异基因表达结果。
6. 将前10个显著失调的lncRNA和mRNA列于表格中。

3. 功能富集分析

1. 利用 DAVID 在线数据库（功能注释、可视化与集成发现数据库，https://david.ncifcrf.gov/）对差异表达 mRNA（DE-mRNA）进行 GO 富集分析。
   1. 将差异表达基因提交至该网站，并选择基因本体（GO）术语，包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC），以进行 GO 分析。
   2. 将差异表达基因提交至 Cytoscape（版本：3.8.2）插件 ClueGO [16]+ 及 Cluepedia 应用程序。
   3. 采用 Benjamini-Hochberg 方法对多重比较进行校正，并将显著性阈值设定为校正后 P 值 < 0.05。
   4. 从 Cytoscape 下载分析结果。根据 P 值按降序排列富集结果，并列出每个类别中排名前 5 的富集项。
2. 京都基因与基因组百科全书（KEGG）是理解生物系统高级功能及其影响的重要数据库资源（http://www.genome.jp/kegg/）。
   1. 在网站上选择 KEGG-PATHWAY，以类似方法进行 KEGG 分析。
   2. 将显著性阈值设定为校正后 P 值 < 0.05，并展示本研究中排名前 10 的富集通路。按照已发表的研究方法进行这些富集分析 ^25,26。

4. 蛋白质-蛋白质相互作用网络

1. 使用相互作用基因检索搜索工具（STRING，版本12.0）预测并构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
2. 将318个上调的mRNA或465个下调的mRNA提交至STRING网站，以构建PPI网络。
3. 从PPI网络中导出相互作用数据，并将数据提交至Cytoscape软件。
4. 隐藏PPI网络中的单个节点。下载本研究中呈现的PPI网络。
5. 使用Cytoscape插件CentiScaPe应用程序计算网络的拓扑特性，包括度分布。
6. 通过累加每个基因相邻基因的数量，量化各基因的局部拓扑结构，并统计给定节点的相互作用数量。
7. 根据基因在PPI网络中的连接度，将所有基因按降序排列。
8. 从该排序列表中选取前12个上调基因和前12个下调基因作为枢纽基因（hub genes）。

5. miRNA-mRNA 调控网络

注：使用 ENCORI 数据库（版本 12.0，https://rnasysu.com/encori/）预测 microRNA（miRNA）与差异表达长链非编码 RNA（DE-lncRNA）或枢纽基因之间的调控关联。

1. 将上调的枢纽基因或下调的枢纽基因提交至ENCORI，并在PITA、RNA22、miRmap、miRanda、PicTar和TargetScan共六种程序中设置截断标准≥5，用于ENCORI中的预测分析。
2. 下载预测得到的miRNA，并将其提交至ENCORI以获取潜在的lncRNA。
3. 下载预测得到的lncRNA，并鉴定步骤5.2与图2之间重叠的lncRNA。
4. 将枢纽基因、第5.1节获得的miRNA以及步骤5.3获得的lncRNA提交至Cytoscape软件（版本3.4.0），构建ceRNA调控网络。

结果

差异表达基因的鉴定
采用 limma R 软件分析 lncRNA 和 mRNA 的差异表达谱。两组之间的差异通过非配对 t 检验确定。如火山图（图2）所示，共鉴定出 739 个差异表达的 lncRNA（DE-lncRNA，p 值<0.05，|log2FC|>1）。其中，在细胞因子组与正常组相比，有 340 个上调的 lncRNA 和 399 个下调的 lncRNA。此外，共鉴定出 809 个差异表达的 mRNA（DE-mRNA，p 值<0.05，|log2FC|>1）。在这些 DE-mRNA 中，细胞因子组相较于正常组有 334 个上调 mRNA 和 475 个下调 mRNA（图3A–B）。此外，前 10 个上调的 lncRNA 分别为 MIR3142HG、AC096773.1、AC011511.5、AL844908.1、ENST00000464835、AC079298.1、ENST0...

讨论

牙周膜干细胞（PDLSCs）被认为是抑制牙周炎进展期和恢复期牙周组织损伤的关键细胞^32,33。大量证据已明确表明，在炎症条件下培养可能显著加速PDLSCs的衰老过程^34,35。然而值得注意的是，炎症诱导的细胞衰老现象及其对细胞功能障碍的贡献仍需进一步深入研究和探索^{11,12,13,14,15,16,17,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
R	R 统计计算基金会	4.0.4	用于统计计算的核心开源环境，作为后续所有分析的基础，通常与 RStudio 配合使用。
Limma	Bioconductor 社区（主要开发：Walter & Eliza Hall 研究所）	3.46.0	用于微阵列和 RNA-seq 差异表达分析的专用软件包。
Cytoscape	Cytoscape 联盟	3.8.2	用于网络可视化的开源平台，需单独安装，可通过应用商店支持 ClueGO 和 cytoHubba 等插件。
STRING	欧洲分子生物学实验室	12	全球最大的已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据库，可通过网页或 Cytoscape 插件访问，并提供置信度评分。
ENCORI	中山大学	3	专注于 ceRNA 网络（miRNA-mRNA-lncRNA）的公共数据库。