基于lncRNA、miRNA和mRNA表达的脑中动脉闭塞大鼠竞争性内源RNA网络分析

摘要

本研究采用生物信息学分析和实验验证，系统研究了长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在缺血性脑卒中中的调控作用及其潜在机制。

摘要

本研究旨在探讨长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在缺血性脑卒中中的调控作用及其潜在机制。根据ceRNA假说，lncRNA、miRNA和mRNA被识别为参与脑卒中过程的调控网络的组成部分。从构建的子网络中筛选出关键lncRNA进行深入分析。通过基因本体（Gene Ontology）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释，揭示了lncRNA相关ceRNA网络中的关键相互作用。进一步通过蛋白质印迹（Western blot）分析验证了钙信号通路、间隙连接信号通路以及神经活性配体-受体相互作用等关键通路。构建的ceRNA网络包含334个lncRNA、miRNA和mRNA，功能富集分析预测了它们的生物学功能。选取三个节点度中心性较高的lncRNA构建代表性ceRNA子网络。蛋白质印迹分析结果显示，与假手术组相比，模型组中关键蛋白CaMKII、钙调蛋白（calmodulin）、CX36、PKC、CX43、GRIA3、GABRA6和NPY1R的表达水平显著下调，而CaN的表达则显著上调（P < 0.05）。这些结果表明，lncRNA在脑卒中的发病机制中具有重要作用。综上所述，作为ceRNA发挥作用的lncRNA在缺血性脑卒中的发病过程中承担着关键的调控功能。

引言

缺血性脑卒中是一种常见的神经系统疾病，可导致永久性脑损伤、长期残疾或死亡^1,2,3,4。微小RNA（miRNA或miR）、长链非编码RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）共同构成RNA介导的调控网络^5,6,7,8。这些分子通过多种复杂机制调控细胞功能^9,10，其在缺血性脑卒中病理生理过程中的作用正日益受到关注。然而，尽管这些非编码RNA与该疾病的关系越来越密切，其确切作用仍不明确。进一步研究新的非编码RNA对于阐明缺血性脑卒中的分子机制至关重要。

长链非编码RNA（lncRNA）在多种病理过程的起始与进展中发挥关键的基因表达调控作用。作为竞争性内源RNA（ceRNA），lncRNA通过结合miRNA来发挥特定的调控功能¹¹。Wei等报道，lncRNA AK038897通过靶向miR-26a-5p发挥ceRNA作用，进而调控死亡相关蛋白激酶1（DAPK1），加重脑缺血-再灌注损伤¹²。研究表明，长链非编码RNA SNHG1（lncRNA SNHG1）通过与miR-18a相互作用，作为ceRNA调控HIF-1α/VEGF信号通路，从而影响脑血管疾病¹³。另有研究显示，长链非编码RNA母源表达基因3（lncRNA MEG3）通过miR-21/PDCD4信号级联反应调控神经元凋亡¹⁴。尽管通过高通量测序或微阵列分析已鉴定出大量lncRNA、miRNA和mRNA，但这些分子在脑卒中中的功能仍不明确，亟需系统构建RNA介导的调控网络。

因此，本研究旨在利用先前收集的数据，基于竞争性内源RNA（ceRNA）假说构建全面的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，并通过基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，对筛选出的ceRNA子网络进行解析，以更深入地理解lncRNA的功能。研究结果可能表明，多个lncRNA可作为ceRNA发挥作用，潜在调控特定miRNA及其靶向mRNA。GO富集分析可能揭示关键的生物学过程，如细胞发育、信号转导和细胞周期调控；通路富集分析则可能揭示这些分子参与脑卒中相关通路、免疫应答及代谢过程。这些发现有望阐明lncRNA在多种细胞过程及疾病机制中的潜在作用。

与现有缺血性脑卒中研究中的ceRNA网络分析方法相比，本研究在多个关键方面进行了改进，相关改进得到了与已有研究对比的支持：首先，通过将网络构建与功能通路验证相结合，实现了多层次的验证；不同于Li等¹⁵主要依赖公共转录组数据对免疫相关ceRNA网络进行生物信息学分析的方法，本研究构建了一个包含334个lncRNA、miRNA和mRNA的ceRNA网络，并通过Western blot分析验证了关键信号通路（钙信号通路、缝隙连接信号通路以及神经活性配体-受体相互作用），从而弥补了Fan等¹⁶仅构建环状RNA相关ceRNA网络但缺乏下游通路实验验证的不足，后者过度依赖于计算机预测；同时，通过在模型组和假手术组中定量检测关键蛋白表达（如CaMKII、CX36、GRIA3），证实了预测网络的功能相关性；聚焦于具有高度拓扑重要性的核心lncRNA，提高了研究结果的特异性；不同于Cheng等¹⁷构建了一个包含3个lncRNA、2个miRNA和24个mRNA的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络但未优先筛选关键调控因子的做法，本研究识别出3个具有高度中心性的lncRNA，构建代表性子网络，确保机制性发现锚定于最具影响力的节点，相较于Li等¹⁸所报道的包含62个lncRNA但缺乏靶向子网络分析的更广泛而分散的网络，本方法显著提升了结果的可解释性；提供详细的实验参数以增强可重复性：每组使用6只大鼠（共20只MCAO模型和20只假手术对照），从脑组织中提取500 ng至1 µg总RNA用于文库构建，并要求RNA完整性数值（RIN）> 8.0以保证质量，而Wang等¹⁹虽验证了circRNA生物标志物，却未说明RNA输入量的具体参数；采用雄性SPF级SD大鼠（220 ± 30 g）建立MCAO模型，该模型被广泛使用，但本研究明确指出其局限性——无法完全模拟人类缺血性脑卒中复杂的血管结构和免疫反应（如Li等所述），并通过按神经功能评分（1–3分）对大鼠进行分层，以标准化梗死严重程度，从而部分缓解该局限；同时承认本研究存在的不足：ceRNA网络可能未能涵盖翻译后修饰，且Western blot验证的样本量（每组n = 6）尚可进一步扩大，未来工作将纳入更大队列及蛋白质组学分析，以弥补上述空白。

方案

动物实验经安徽中医药大学实验伦理委员会批准（许可证编号：AHUCM-rats-2024006），并依照机构指南及JoVE的动物使用标准进行。本研究使用了40只雄性SPF级SD大鼠（220 g ± 30 g）。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 实验动物

1. 将动物饲养于动物实验中心的标准实验条件下，保持12小时光照/12小时黑暗循环，每日更换垫料，并提供自由摄食和饮水。
2. 实验结束时，通过腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠处死动物 通过 腹腔注射以诱导深度麻醉状态（遵循机构批准的方案）。通过捏压足垫无反射性反应确认深度麻醉，并监测呼吸以确保生命体征完全消失，随后进行断头处死。

2. 大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立

1. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）诱导麻醉²⁰（遵循机构批准的方案）。通过夹捏脚趾和角膜反射评估麻醉深度。
   1. 在整个操作过程中持续监测呼吸频率和心率。麻醉诱导后立即涂抹无菌矿物油基眼膏以保护眼睛。²¹.
2. 完全麻醉后，沿颈部正中线做切口，仔细暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。在直视下，使用适当的显微外科器械（如镊子和剪刀）轻柔分离周围结缔组织，充分暴露各动脉。
   1. 暴露动脉后，使用手术缝线结扎ECA和CCA。打结时应确保结扎牢固，以阻断血流并减少后续操作中的出血。结扎时保持适当张力，为缝线植入提供稳定的手术视野。
   2. 在眼动脉剪刀下于颈外动脉（ECA）与颈内动脉（ICA）分叉处做一小切口，以备插入缝线。选择直径为0.25 mm、从圆头（球形）末端起长度为18 mm的尼龙缝线。将缝线经ECA-ICA交界处的切口插入，并沿ICA轻柔推进至约18.5 mm ± 0.5 mm深度，以阻塞大脑中动脉，诱导局灶性脑缺血。
   3. 用手术缝线将插入的尼龙缝合线固定于周围组织或血管，以防止移位。维持大脑中动脉阻塞（MCAO）2小时后，诱导缺血/再灌注损伤。使用精细外科镊子轻轻夹住尼龙缝合线，缓慢回撤约5 mm，以部分恢复脑血流并诱导再灌注损伤。假手术组仅结扎颈动脉，不插入线栓。²².
3. 成功建立MCAO模型一周后，对大鼠进行深度麻醉。待其对足底夹捏无反应后，迅速断头取脑。用生理盐水冲洗脑组织，随后置于−80 °C冰箱中冷冻保存。²³.
4. 神经功能评分
   1. 采用Longa评分法评估神经功能，以确定MCAO模型是否成功²⁴在再灌注后24小时，评估每只大鼠的神经功能，并根据以下标准进行评分：评分0分：无可见神经功能缺损；1分：在尾部悬吊时左前肢屈曲，前肢不能完全伸展；2分：在尾部悬吊时左前肢屈曲，且置于平坦表面时患侧（左侧）抵抗明显减弱；3分：符合2分标准，并伴有爬行时环形运动或不自主转向动作；4分：24小时内昏迷或死亡。
      注意：得分越高，表明行为障碍越严重，神经功能缺损程度越大。
5. 使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法计算脑梗死体积
   1. 分段 离体 沿冠状面将大鼠脑组织切成五片等厚切片，确保每片厚度精确为2.0 mm ± 0.1 mm。将切片完全浸入新配制的2%（w/v）TTC染色液中。
      1. 用铝箔包裹染色容器以避光，并将样本置于37 °C ± 0.5 °C的恒温培养箱中孵育30分钟。染色后，正常脑组织呈现玫瑰红色染色，而缺血性梗死区域由于脱氢酶活性丧失，不被染色（呈白色）。
   2. 将经TTC染色的脑切片转移至4% (w/v) 多聚甲醛溶液中，于4 °C固定24 h，以保存组织形态。固定后，使用高分辨率成像系统采集切片的数字图像。在固定后24 h记录并存档数据。
   3. 使用 ImageJ 软件定量各组大鼠经 TTC 染色后的梗死体积和全脑组织体积。采用以下公式计算校正后的梗死体积百分比。²⁵:
      ​校正后的梗死体积（%）= {[总病灶体积 − (左侧半球体积 − 右侧半球体积)] / 右侧半球体积} × 100%
   4. 使用 GraphPad Prism 软件对校正后的梗死体积进行可视化处理和统计学分析 通过 不成对的 t检验将统计学显著性定义为 P < 0.05.

3. RNA 高通量测序

1. 从每组三只大鼠中选取脑组织。根据制造商说明书，使用 Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒从总 RNA 样本中去除核糖体 RNA（rRNA）。
   1. 使用 TruSeq RNA 文库构建试剂盒，按照标准方案构建互补 DNA（cDNA）文库。将纯化的 cDNA 文库用于簇生成和测序。
2. 使用先前研究生成的核心数据²⁶，该数据已提供本研究所需的全部测序文库和数据集，无需依赖新构建的文库。当前工作重点是对这些现有数据集进行整合融合分析，不再生成新的 RNA-seq 文库或测序数据。
   1. 确认先前研究已获得相关机构伦理委员会的批准。按照此前描述的标准化方案²⁷，开展高通量测序，系统评估 MCAO 大鼠中 miRNA 的表达谱。
      注：RNA 测序文库的质量控制数据见补充文件 1。

4. 长链非编码RNA、微小RNA和信使RNA的差异表达分析

1. 从 Ensembl 获取蛋白质编码基因、miRNA 和 lncRNA 的注释信息 （https://www.ensembl.org/index.html）、miRBase（https://www.mirbase.org/）和 NONCODE（http://www.noncode.org/），视情况而定^28,29,30使用 StringTie 定量基因表达³¹ (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/) 
   1. 使用 StringTie 软件对每个样本的比对读段进行转录本组装。利用 StringTie 的合并模块整合所有样本的转录本组装结果，生成在整组样本中一致的统一转录本集合。基于该合并后的转录本集合，估计转录本的表达丰度³².
   2. 通过应用修剪平均M值（TMM）标准化方法，并计算每条转录本每百万比对读段中每千碱基片段数（FPKM），对蛋白编码基因和长链非编码RNA（lncRNA）进行定量分析^33,34.
2. 使用 edgeR 软件包（https://bioconductor.org/）进行差异表达分析，以鉴定 MCAO 组与对照组之间差异表达的长链非编码 RNA（DELs）、miRNA（DEMis）和 mRNA（DEMs）。将过滤后的原始计数矩阵转换为 edgeR 的 DGEList 对象。估计整体离散值，并为每个基因或 miRNA 分配相同的离散值。 
   1. 对组间基因表达进行精确检验。获取log2倍数变化（log2FC）、每百万计数的对数值（logCPM）， P-值，以及每个差异表达基因经错误发现率（FDR）校正后的 P-值³⁵. 将统计学显著性定义为 P < 0.05，倍数变化阈值为 |log2(FC)| > 1.

5. 差异表达的微小RNA的长链非编码RNA和信使RNA靶标预测

1. 从适当的数据库中获取差异表达的miRNA（DEMis）和差异表达的lncRNA（DELs）序列。利用miRNA-lncRNA相互作用预测工具miRanda³⁶和RNAhybrid³⁷，鉴定DEMis与DELs之间的潜在相互作用。从miRWalk 3.0数据库（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）³⁸获取miRNA-mRNA相互作用配对信息

6. 长链非编码RNA-微小RNA-信使RNA调控网络的构建

1. 基于ceRNA假说构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络^39,40。
   1. 计算差异表达lncRNA（DELs）与差异表达mRNA（DEMs）之间的皮尔逊相关系数（PCC）。若PCC > 0.99 且 P < 0.01，则选择相应的lncRNA-mRNA配对进行后续分析。
   2. 针对每一对共表达的lncRNA-mRNA，鉴定同时靶向这两个转录本的共有miRNA。利用这些共有miRNA构建miRNA-mRNA-lncRNA共表达网络。
   3. 使用Cytoscape（https://cytoscape.org/）构建并可视化lncRNA-miRNA-mRNA相互作用网络^41,42。操作步骤如下：
      1. 使用CytoNCA插件计算每个节点的介数中心性（BC）、接近中心性（CC）和度中心性（DC）。
      2. 选择在上述三项指标中中心性得分均超过各自中位数的基因，构建最终的关键子网络。
      3. 使用CytoHubba插件识别蛋白质-蛋白质相互作用网络中排名前10的枢纽基因，并提取步骤2中鉴定出的关键节点。
      4. 计算ceRNA网络中每个组分的节点度。

7. 功能富集分析

1. 进行 GO 和 KEGG 通路富集分析，以进一步研究 RNA 功能⁴³。使用 clusterProfiler 软件包（https://bioconductor.org/）可视化富集结果⁴⁴。

8. Western印迹分析检测lncRNA-ceRNA相关通路中关键蛋白的表达水平

1. 在深度麻醉下，迅速取出整个脑组织。仔细剥离脑膜和血管后，分离大鼠梗死区域的皮质组织⁴⁵。使用精细剪刀将组织剪成小块，确保每块重量在50 mg至100 mg之间。将称重后的组织样本转移至预冷的匀浆管中。
   1. 按PMSF与RIPA裂解缓冲液体积比1:100（终浓度为1 mM PMSF）配制蛋白裂解缓冲液。按每20 mg组织加入200 µL裂解缓冲液的比例添加。使用经热灭菌的玻璃匀浆器充分匀浆，直至组织完全破碎。
   2. 将匀浆液置于冰上孵育30分钟，每隔10分钟轻轻振荡一次，以促进完全裂解。在4 °C条件下以28,656.6 × g离心15分钟。小心吸取含有总蛋白的上清液，避免扰动沉淀。
2. 按1:4的比例（1份5× SDS-PAGE上样缓冲液与4份蛋白样品）向蛋白样品中加入5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液。稀释后，SDS-PAGE上样缓冲液的终工作浓度为1×。
   1. 充分混匀后，在沸水浴中加热10分钟以完全变性蛋白。待样品冷却至室温后，每孔上样30 µg蛋白样品。
   2. 分两个阶段进行电泳：首先施加80 V电压30分钟，使蛋白通过浓缩胶；然后提高至120 V电压运行1小时，以在分离胶中实现蛋白分离。
3. 准备预先裁剪好的滤纸和聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，使其尺寸与凝胶匹配。将PVDF膜浸入甲醇中3分钟以活化。随后将PVDF膜和滤纸一同浸入转膜缓冲液中5分钟。
   1. 按以下顺序组装转膜“三明治”结构（从上到下）：阳极板、三层滤纸、PVDF膜、凝胶、三层滤纸、阴极板。确保凝胶、膜和滤纸各层对齐。每一步均需排除所有气泡，以保证转膜均匀。
4. 蛋白转膜完成后，立即用Western洗涤缓冲液冲洗PVDF膜5分钟，以去除残留的转膜缓冲液。随后在室温下用含5%脱脂奶粉的Western封闭缓冲液轻摇封闭2小时；若检测磷酸化蛋白，则可使用5% BSA进行封闭。
5. 封闭结束后，在4 °C条件下以1:1000稀释的一抗溶液中轻摇孵育过夜。次日，在室温下用1:10,000稀释的二抗溶液孵育2小时。
6. 在暗室中进行化学发光检测，避免光线干扰。将PVDF膜的蛋白面朝上，平整置于自动成像系统曝光板中央。
   1. 使用前立即在洁净离心管中等体积混合ECL试剂A和ECL试剂B。将混合后的ECL溶液均匀覆盖于膜表面，以启动发光反应。
   2. 室温孵育1–2分钟后，轻轻去除多余液体，避免扰动膜表面。根据发光强度调整成像系统的曝光参数，以优化信号采集效果。

9. 统计分析

1. 使用 ImageJ 软件分析 Western 印迹结果，以量化条带灰度值。采用 GraphPad Prism 对实验数据进行统计分析。所有数据均以均值 ± 标准差（x ± SD）表示。使用非配对 t 检验评估组间统计学差异。 t检验.
   1. 将两个独立样本组的数据输入软件的数据表中，每组对应单独的一列，且各样本间相互独立。通过选择以下选项验证正态性 "正态性与对称性检验" 在……之下 "分析" 功能，并对两组数据应用Shapiro-Wilk检验。
   2. 如果 P > 0.05，则认为两组数据呈正态分布。据此，选择 未配对 t检验 在……下方 t检验 在 分析 用于执行分析的功能。将统计学显著性定义为 P < 0.05.

结果

各组大鼠模型的成功率验证实验结果如图1所示。建模后对大鼠进行神经功能评分（图1A）。模型组表现出严重的神经功能缺损，评分在1至3分之间的个体被纳入后续实验。 图1B 和 C 显示了TTC染色结果，其中红色代表正常脑组织，白色区域表示梗死部位。模型组出现严重的脑梗死。上述结果证实了缺血模型的成功建立，并验证了其在后续实验中的适用性。利用edgeR进行差异表达分析，在MCAO组中鉴定出920个差异表达mRNA（DEMs）和710个差异表达lncRNA（DELs）。此外，有16个miRNA表现出异常的表达模式。

长链非编码RNA（lncRNA）可通过竞争性结合miRNA发挥竞争性内源RNA（ceRNA）的作用。总体而言，共鉴定出717对lncRNA-miR相互作用关系，涉及16个miRNA和121个lncRNA（图2）。利用miRWalk（http:/...

讨论

为了研究脑卒中发病机制的分子基础并鉴定潜在的诊断和治疗靶点，对大脑中动脉闭塞（MCAO）后大鼠脑组织进行了RNA-Seq和小RNA-Seq（sRNA-Seq）分析。本研究主要旨在探讨涉及长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）的复杂调控网络。通过对MCAO诱导的大鼠脑组织RNA-Seq和sRNA-Seq数据集进行综合分析，阐明了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。构建了广泛的网络相互作用，以展示lncRNA、miRNA和mRNA之间的调控关系，从而加深对RNA介导的脑卒中发病机制的理解。ceRNA网络分析揭示了344个与以下生物学过程相关的蛋白编码基因："白细胞-细胞黏附"、"整合素介导的细胞黏附调控"、"胶原纤维组织"、"整合素介导的细胞黏附"、"缺血性脑卒中后钙依赖性信号转导的正向调控"、"异嗜性细胞间黏附"以及"单核细胞趋化"。与我们的研究结果一致，多个蛋白编码基因——包括基质金属蛋白酶9（MMP9）^46,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% (w/v) TTC 染色液	北京康乐克隆生物技术有限公司	20230805	TTC 染色
4% (w/v) 多聚甲醛溶液	Beyotime	P0099	固定脑组织
40只雄性SPF级SD大鼠	杭州资源实验动物 breeding Co., Ltd	SCXK [浙] 2024-0004	实验动物
5% 脱脂奶粉	科学 Phygene	PH1519	WB
琼脂糖凝胶电泳系统	北京六一生物科技有限公司	DYCP-44P	WB
自动曝光仪	上海佩清科技有限公司	JS-M6P	WB
自动曝光计	上海佩卿科技有限公司	JS-M6P	WB
自动制冰机	常熟市雪科电器有限公司	IMS-20	WB
钙调蛋白	亲和力	49B2443	WB
CaMKII	亲和力	14G0796	WB
离心机	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	LX 300	WB
clusterProfiler 包	Bioconductor	clusterProfiler_4.17	富集分析
CX36	ZENBIO	N24AP24	WB
CX43	ZENBIO	M08NO01	WB
ECL 超敏化学发光试剂盒	biosharp	BL520B	WB
电热恒温鼓风干燥箱	上海三发科学仪器有限公司	DHG-9070	WB
电泳装置	上海天能科技有限公司（Tanon）	EPS300	WB
电泳装置	上海天能科学 &科技有限公司	EPS300	WB
电泳槽	上海天能科学 &科技有限公司	VE-180	WB
GABRA6	亲和力	46V5371	WB
山羊抗小鼠 IgG	Zs-BIO	142637	WB
山羊抗兔IgG	Zs-BIO	139931	WB
GRIA3	亲和力	0C33051	WB
高速冷冻离心机	安徽嘉文仪器设备有限公司	JW-3021HR	WB
HiSeq 2500 系统	Illumina	/	RNA高通量测序
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	ImageJ 1.54k	TTC 染色
磁力加热搅拌器	常州城市与仪器厂	JJ-79-1	WB
微量移液器	德国 Eppendorf	/	WB
常温微量离心机	中国台湾启利仪器制造有限公司 LX300	LX300	WB
NPY1R	亲和力	2D38248	WB
移液器	Eppendorf	0.5-10 μl	WB
PKC	亲和力	17E3745	WB
预染蛋白质标记物	biosharp	BL712C	WB
PVDF膜	Millipore	IPVH00010	WB
Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒	Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥	/	RNA提取
RIPA 裂解液	Biosharp	BL504A	WB
戊巴比妥钠	北京智远科技有限公司	MERCK	麻醉剂
转印膜仪	上海天能科学 &科技有限公司	VE-186	WB
跨膜装置	上海天能科技有限公司（Tanon）	VE-186	WB
β-肌动蛋白	Zs-BIO	19AW0505	WB