基于lncRNA、miRNA和mRNA表达的脑中动脉闭塞大鼠竞争性内源RNA网络分析

摘要

本研究采用生物信息学分析和实验验证，系统研究了长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在缺血性脑卒中中的调控作用及其潜在机制。

摘要

本研究旨在探讨长链非编码RNA（lncRNA）作为竞争性内源RNA（ceRNA）在缺血性脑卒中中的调控作用及其潜在机制。根据ceRNA假说，lncRNA、miRNA和mRNA被识别为参与脑卒中过程的调控网络的组成部分。从构建的子网络中筛选出关键lncRNA进行深入分析。通过基因本体（Gene Ontology）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释，揭示了lncRNA相关ceRNA网络中的关键相互作用。进一步通过蛋白质印迹（Western blot）分析验证了钙信号通路、间隙连接信号通路以及神经活性配体-受体相互作用等关键通路。构建的ceRNA网络包含334个lncRNA、miRNA和mRNA，功能富集分析预测了它们的生物学功能。选取三个节点度中心性较高的lncRNA构建代表性ceRNA子网络。蛋白质印迹分析结果显示，与假手术组相比，模型组中关键蛋白CaMKII、钙调蛋白（calmodulin）、CX36、PKC、CX43、GRIA3、GABRA6和NPY1R的表达水平显著下调，而CaN的表达则显著上调（P < 0.05）。这些结果表明，lncRNA在脑卒中的发病机制中具有重要作用。综上所述，作为ceRNA发挥作用的lncRNA在缺血性脑卒中的发病过程中承担着关键的调控功能。

引言

缺血性脑卒中是一种常见的神经系统疾病，可导致永久性脑损伤、长期残疾或死亡^1,2,3,4。微小RNA（miRNA或miR）、长链非编码RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）共同构成RNA介导的调控网络^5,6,7,8。这些分子通过多种复杂机制调控细胞功能^9,10，其在缺血性脑卒中病理生理过程中的作用正日益受到关注。然而，尽管这些非编码RNA与该疾病的关系越来越密切，其确切作用仍不明确。进一步研究新的非编码RNA对于阐明缺血性脑卒中的分子机制至关重要。

长链非编码RNA（lncRNA）在多种病理过程的起始与进展中发挥关键的基因表达调控作用。作为竞争性内源RNA（ceRNA），lncRNA通过结合miRNA来发挥特定的调控功能

方案

动物实验经安徽中医药大学实验伦理委员会批准（许可证编号：AHUCM-rats-2024006），并依照机构指南及JoVE的动物使用标准进行。本研究使用了40只雄性SPF级SD大鼠（220 g ± 30 g）。所用试剂与设备列于材料表中。

1. 实验动物

1. 将动物饲养于动物实验中心的标准实验条件下，保持12小时光照/12小时黑暗循环，每日更换垫料，并提供自由摄食和饮水。
2. 实验结束时，通过腹腔注射150 mg/kg戊巴比妥钠处死动物 通过 腹腔注射以诱导深度麻醉状态（遵循机构批准的方案）。通过捏压足垫无反射性反应确认深度麻醉，并监测呼吸以确保生命体征完全消失，随后进行断头处死。

2. 大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立

1. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）诱导麻醉²⁰（遵循机构批准的方案）。通过夹捏脚趾和角膜反射评估麻醉深度。
   1. 在整个操作过程中持续监测呼吸频率和心率。麻醉诱导后立即涂抹无菌矿物油基眼膏以保护眼睛。²¹.
2. 完全麻醉后，沿颈部正中线做切....

结果

各组大鼠模型的成功率验证实验结果如图1所示。建模后对大鼠进行神经功能评分（图1A）。模型组表现出严重的神经功能缺损，评分在1至3分之间的个体被纳入后续实验。 图1B 和 C 显示了TTC染色结果，其中红色代表正常脑组织，白色区域表示梗死部位。模型组出现严重的脑梗死。上述结果证实了缺血模型的成功建立，并验证了其在后续实验中的适用性。利用edgeR进行差异表达分析，在MCAO组中鉴定出920个差异表达mRNA（DEMs）和710个差异表达lncRNA（DELs）。此外，有16个miRNA表现出异常的表达模式。

长链非编码RNA（lncRNA）可通过竞争性结合miRNA发挥竞争性内源RNA（ceRNA）的作用。总体而言，共鉴定出717对lncRNA-miR相互作用关系，涉及16个miRNA和121个lncRNA（图2）。利用miRWalk（http:/.......

讨论

为了研究脑卒中发病机制的分子基础并鉴定潜在的诊断和治疗靶点，对大脑中动脉闭塞（MCAO）后大鼠脑组织进行了RNA-Seq和小RNA-Seq（sRNA-Seq）分析。本研究主要旨在探讨涉及长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）和信使RNA（mRNA）的复杂调控网络。通过对MCAO诱导的大鼠脑组织RNA-Seq和sRNA-Seq数据集进行综合分析，阐明了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。构建了广泛的网络相互作用，以展示lncRNA、miRNA和mRNA之间的调控关系，从而加深对RNA介导的脑卒中发病机制的理解。ceRNA网络分析揭示了344个与以下生物学过程相关的蛋白编码基因："白细胞-细胞黏附"、"整合素介导的细胞黏附调控"、"胶原纤维组织"、"整合素介导的细胞黏附"、"缺血性脑卒中后钙依赖性信号转导的正向调控"、"异嗜性细胞间黏附"以及"单核细胞趋化"。与我们的研究结果一致，多个蛋白编码基因——包括基质金属蛋白酶9（MMP9）^46,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% (w/v) TTC 染色液	北京康乐克隆生物技术有限公司	20230805	TTC 染色
4% (w/v) 多聚甲醛溶液	Beyotime	P0099	固定脑组织
40只雄性SPF级SD大鼠	杭州资源实验动物 breeding Co., Ltd	SCXK [浙] 2024-0004	实验动物
5% 脱脂奶粉	科学 Phygene	PH1519	WB
琼脂糖凝胶电泳系统	北京六一生物科技有限公司	DYCP-44P	WB
自动曝光仪	上海佩清科技有限公司	JS-M6P	WB
自动曝光计	上海佩卿科技有限公司	JS-M6P	WB
自动制冰机	常熟市雪科电器有限公司	IMS-20	WB
钙调蛋白	亲和力	49B2443	WB
CaMKII	亲和力	14G0796	WB
离心机	海门麒麟贝尔仪器制造有限公司	LX 300	WB
clusterProfiler 包	Bioconductor	clusterProfiler_4.17	富集分析
CX36	ZENBIO	N24AP24	WB
CX43	ZENBIO	M08NO01	WB
ECL 超敏化学发光试剂盒	biosharp	BL520B	WB
电热恒温鼓风干燥箱	上海三发科学仪器有限公司	DHG-9070	WB
电泳装置	上海天能科技有限公司（Tanon）	EPS300	WB
电泳装置	上海天能科学 &科技有限公司	EPS300	WB
电泳槽	上海天能科学 &科技有限公司	VE-180	WB
GABRA6	亲和力	46V5371	WB
山羊抗小鼠 IgG	Zs-BIO	142637	WB
山羊抗兔IgG	Zs-BIO	139931	WB
GRIA3	亲和力	0C33051	WB
高速冷冻离心机	安徽嘉文仪器设备有限公司	JW-3021HR	WB
HiSeq 2500 系统	Illumina	/	RNA高通量测序
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	ImageJ 1.54k	TTC 染色
磁力加热搅拌器	常州城市与仪器厂	JJ-79-1	WB
微量移液器	德国 Eppendorf	/	WB
常温微量离心机	中国台湾启利仪器制造有限公司 LX300	LX300	WB
NPY1R	亲和力	2D38248	WB
移液器	Eppendorf	0.5-10 μl	WB
PKC	亲和力	17E3745	WB
预染蛋白质标记物	biosharp	BL712C	WB
PVDF膜	Millipore	IPVH00010	WB
Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒	Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥	/	RNA提取
RIPA 裂解液	Biosharp	BL504A	WB
戊巴比妥钠	北京智远科技有限公司	MERCK	麻醉剂
转印膜仪	上海天能科学 &科技有限公司	VE-186	WB
跨膜装置	上海天能科技有限公司（Tanon）	VE-186	WB
β-肌动蛋白	Zs-BIO	19AW0505	WB