肌动蛋白共沉淀实验；用于分析蛋白质与F-肌动蛋白的结合

摘要

蛋白质通过不同的肌动蛋白结合结构域与丝状肌动蛋白（F-actin）结合。在本视频中，我们演示了肌动蛋白共沉淀实验的操作流程，这是一种体外常规使用的分析方法，用于研究能够与F-actin结合的蛋白质或特定结构域。

摘要

细胞内的肌动蛋白细胞骨架是由肌动蛋白丝构成的网络结构，可介导细胞运动及各种细胞过程，并产生张力以维持细胞形态。尽管肌动蛋白细胞骨架具有一定的刚性，但它是一个不断发生动态重塑的可变结构。多种蛋白质能够与肌动蛋白细胞骨架结合。特异性蛋白质与F-肌动蛋白（F-actin）的结合常被用于支持细胞生物学观察结果，或进一步理解由肌动蛋白骨架重塑所引发的动态过程。肌动蛋白共沉降实验是一种体外常规用于分析特定蛋白质或蛋白质结构域与F-肌动蛋白结合能力的方法。该实验的基本原理包括：将目标蛋白质（全长或结构域）与F-肌动蛋白共同孵育，通过超速离心使F-肌动蛋白沉淀，随后分析与F-肌动蛋白共沉淀的蛋白质。根据实验设计，肌动蛋白共沉降实验可用于测定肌动蛋白结合亲和力，也可用于竞争性结合实验。

方案

1. 肌动蛋白的制备

本实验所用的肌动蛋白来源于Cytoskeleton公司提供的非肌肉来源的人血小板（β-肌动蛋白）。将肌动蛋白储存液分装后于-70ºC冰箱中保存，浓度为10 mg/ml。实验时，将肌动蛋白用含有5 mM Tris（pH 8）、0.2 mM CaCl₂、0.2 mM ATP和0.5 mM DTT的缓冲液稀释至0.4 mg/ml，并在4ºC条件下以20,000g离心10分钟。上清液即为单体肌动蛋白，可进一步用于聚合反应。通过加入50 mM KCl、1 mM ATP和2 mM MgCl₂诱导肌动蛋白聚合反应，在室温下反应1小时完成聚合。

2. 蛋白质的制备

在本实验中，我们使用的是纯化后的带有 GST 标签的踝蛋白 C 末端。用于实验的蛋白质在与 F-肌动蛋白孵育前，需经过高速离心以预先清除聚集体。
蛋白质在贝克曼超速离心机中于 22ºC 下以 100,000g 离心 20 分钟。

3. 肌动蛋白-蛋白质孵育

每次实验中肌动蛋白和蛋白的用量会有所不同。本示例中，我们使用过量的肌动蛋白。通常需要计算摩尔比，例如肌动蛋白与蛋白的摩尔比为4:1。

在以下实验中，最终反应体积为150 µl。蛋白与F-肌动蛋白孵育所用的缓冲液取决于待测蛋白及其所需的实验条件。本示例中，我们使用含有10 mM Tris（pH 7.0）、1 mM ATP、0.2 mM DTT、1 mM EGTA、0.1 mM CaCl₂ 和 2 mM MgCl₂ 的缓冲液。蛋白与F-肌动蛋白在室温下于缓冲液中孵育1小时。

4. F-肌动蛋白的沉降

孵育结束后，样品在22ºC下以100,000g离心。视频中使用的是Beckman超速离心机。小心取出转子，避免扰动沉淀。

5. 蛋白质与F-肌动蛋白共沉淀的分析

用移液器小心吸出上清液，转移至一个离心管中，并加入5倍体积的Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液。向残留的沉淀物中加入适量的1倍体积Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液，上下吹打混匀后，转移至新的离心管中。通过SDS-PAGE分离沉淀物和上清液中的蛋白质，并经考马斯亮蓝染色或蛋白质印迹法分析其相对蛋白含量。

为了确定蛋白质与肌动蛋白相互作用的特异性，可进行肌动蛋白浓度依赖性的共沉降实验。在此类实验中，将固定量的蛋白质与一系列递增浓度的肌动蛋白共同孵育，并按照上述方法进行分析。

讨论

肌动蛋白共沉淀是一种简单的体外实验方法，用于分析特定蛋白质与F-肌动蛋白的结合。在本视频中，我们演示了一个如何进行简单肌动蛋白共沉淀实验的示例。我们展示了F-肌动蛋白的制备方法、待测蛋白质的准备以及肌动蛋白共沉淀的操作步骤。在进行肌动蛋白共沉淀实验时，需考虑多个因素。例如，孵育所用缓冲液的组分可能因待测蛋白质的不同而有所变化，且pH值、温度和盐浓度可能会影响蛋白质与F-肌动蛋白的结合。我们在此展示的是与F-肌动蛋白的简单结合实验，但此类实验可进一步拓展，用于确定某种蛋白质或蛋白质结构域与F-肌动蛋白结合的特异性。