使用下一代测序检测非小细胞肺癌的靶向改变

摘要

该协议描述了一种自动化的、ISO15189认可的下一代测序工作流程，用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中的可靶向基因组改变。

摘要

非小细胞肺癌 （NSCLC） 靶向治疗的成功取决于对驱动因素改变的精确识别，包括突变、基因融合和扩增。下一代测序 （NGS） 已成为一种综合性分子诊断工具，能够检测已知和新型基因组畸变，为个性化 NSCLC 治疗提供关键支持。然而，NGS仍然是一种复杂且技术上具有挑战性的方法。尽管 NGS 被广泛采用，但它仍然面临一些挑战，包括技术复杂性和周转时间延长。在这里，介绍了在临床实验室中实施的ISO15189认证的NGS工作流程。标准化方案包括肿瘤细胞结构评估（≥20%）、从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取DNA（DNA输入≥50ng）、自动文库制备和生物信息学分析。通过在每个步骤中集成严格的质量控制 （QC） 措施，工作流程确保了高数据可靠性。此外，工作流程的关键创新是NGS文库构建的自动化。NGS文库构建的自动化系统包括末端修复、A尾、接头连接、杂交捕获和纯化，有效减少了人为错误，提高了实验重现性，减少了手动作时间，从而提高了效率。经验表明，严格的质量控制和自动化文库制备对于保持临床 NGS 检测的准确性和可扩展性至关重要。这种优化的方法不仅确保符合ISO15189标准，还支持非小细胞肺癌管理中对精准肿瘤学不断增长的需求。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的75%-85%，既是临床优先事项，也是^{治疗挑战1,2,3}。近年来，随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）等分子靶向药物的成功开发和临床应用，晚期NSCLC的治疗已进入个性化精准治疗时代^4,5,6。靶向治疗具有精确的疗效、高特异性和最小的副作用 ^7,8。这种治疗的转变同时增加了对分子诊断技术的需求。

目前，全面的肿瘤靶向检测已成为临床实践中不可或缺的组成部分，可以帮助阐明准确的基因突变谱，从而为后续的靶向用药、耐药监测和患者预后评估提供可靠的依据。特别是，基于NGS的多基因检测，利用高通量和高灵敏度的技术优势，已被推荐用于临床应用9,10,11,12。

与传统的分子诊断技术相比，NGS 显示出突破性的优势。NGS 的最大优势在于其高通量能力。它能够同时检测多个基因，包括已知和未知的遗传改变^13,14。同时，NGS实现了单次运行的全面检测，相对降低了成本、样品消耗和检测周转时间^15,16。鉴于这些优势，NGS在临床实践中的应用越来越多。然而，NGS的过程很复杂，包括肿瘤细胞结构评估、核酸提取、自动文库制备和生物信息学分析。初始样品处理的质量直接影响后续生物信息学分析的性能¹⁷。特别是，文库制备涉及一系列步骤，将原始核酸样本转化为与测序仪器兼容的标准化文库。文库制备包括片段化、末端修复、接头连接和PCR扩增¹⁸。这个复杂的过程通常会引入各种技术偏差：例如，碎片化可能导致异染色质区域的代表性不足;接头连接过程中连接酶的底物偏好会导致某些序列的丢失;PCR扩增往往会导致GC含量极高的区域覆盖不均匀¹⁹。这些系统性偏差不仅降低了测序数据的质量，还可能导致后续生物信息学分析中的错误结论。因此，建立严格的QC体系对于确保实验结果的可靠性和一致性至关重要。

为了应对这些长期存在的技术挑战，实验室采用了全自动 NGS 系统。该系统旨在减少手动处理时间并缩短整体周转时间。它采用可编程协议，确保作灵活性和处理精度，同时利用集成模块和单元有效减少每个步骤的潜在技术偏差。此外，这种自动化解决方案不仅提高了文库制备的重现性和通量，更重要的是，确保测序数据更准确地反映原始样品的分子组成。在这里，实验室希望通过使用基于 DNA 的 NGS 检测驾驶员改变来引入该系统。

方案

该协议获得了匿名档案样本的 IRB 豁免。

1. 预测试步骤和质量控制

1. 在实验室信息管理系统中登记样品信息（表1）。填写基因突变检测知情同意书。
2. 接收 NSCLC FFPE 样本。确保用于测试的样品是储存时间不超过 2 年的石蜡组织样品。确保按照标准病理方法处理和储存样本。
   注意：本研究主要关注方法学工作流程，而不是进行大规模的临床分析。因此，这一阶段的研究没有设定具体的样本数量要求。
3. 使用一次性切片机刀片切割切片。在样品之间更换刀片、镊子和 1.5 ml 微管，以防止交叉污染并避免引入操作员来源的污染物（例如头发、皮肤细胞、唾液）。
   注意：大样品量（≥ 0.5 cm x 0.5 cm）6-10 μL，五张;小样品量（< 0.5 cm x 0.5 cm）和穿刺样品，6-10 μL，10 张。
4. 进行常规苏木精-伊红（HE）染色以评估肿瘤细胞含量。
5. 选择含有 ≥20% 恶性肿瘤细胞的样品进行下游分析。病理学家在HE彩色玻璃载玻片²⁰上评估肿瘤内容。
   注意：如果肿瘤含量小于20%，则在HE载玻片上标记的肿瘤区域的引导下，刮掉相应的肿瘤组织区域。该过程通过有效去除周围的非肿瘤成分来实现肿瘤组织的富集，从而显着增加收集材料中肿瘤细胞的百分比。
6. 如下所述，使用自动纯化系统进行核酸提取。
   1. 使用切片机切片 FFPE 块以获得带状。将色带放入 1.5 ml 微量离心管中。将色带转移到自动提取仪器上的指定样品输入位置。
   2. 使用带有自动提取套件的自动提取仪器，并用自动磁珠核酸提取系统代替手动移液。
      注意：自动化此步骤有助于确保自动提取，以确保下游 NGS 应用的高精度和可重复的 DNA 生产。
   3. 参考全自动核酸净化器和核酸提取试剂的说明书提取核酸。
   4. 然后，选择 C1102 程序，选择样品脱蜡孵育时间为 16 小时，洗脱体积为 100 μL。
      注意：如果不立即测试提取的DNA溶液，则必须在-20°C下储存不超过6个月。
7. 如下所述评估核酸质量（表 2）。
   1. 使用琼脂糖凝胶电泳测定 DNA 片段大小。将 Agilent2100 和其他微流控毛细管电泳分析系统用于低输入样品。
   2. 将 1 g 琼脂糖溶解在 100 mL TAE 溶液中。在水浴中加热混合物直至透明。将溶液冷却至60°C左右。
   3. 连接到电泳仪器上的正极（红色）。执行负极（黑色）至电压 180 V，运行 15 分钟^21,22。
   4. 根据琼脂糖凝胶电泳的结果，将片段大小分为四个级别（A-D; 表3），并选择A-C水平的核酸进行后续作。
   5. 使用分光光度法验证纯度。确保OD260/OD280>1.8;OD260/OD230 > 2.0 表示可接受的污染物水平^23,24。
   6. 使用基于序列特异性荧光染料的检测试剂盒（材料表）进行荧光测定，以精确测量DNA浓度。
   7. 将 1 μL 待测 DNA 加入 199 μL 工作溶液中，然后混合，短暂离心，并使用荧光计测量其浓度（ 材料表）。

2. 文库制备和QC（图1）

1. 如下所述，使用超声处理（材料表）制备片段基因组DNA。
   1. 将 200 ng 基因组 DNA 混合在 50 μL 低 Tris-EDTA （TE） 缓冲液中。然后，将样品管保存在预冷（8°C）样品架中。
   2. 根据 表4设置仪器参数。然后启动碎片化。
   3. 使用琼脂糖凝胶电泳验证碎裂效果。此步骤生成末端受损的 DNA 片段，需要末端修复以将它们转化为钝末端以供后续步骤使用。
2. 如下所述，在 3' 处进行端部修复和添加 A。
   1. 用酶修复FFPE DNA的受损末端，形成平坦的末端，确保3'-OH和5'-P。将 A 添加到扁平的双股 3' 端。
   2. 通过加入 7 μL 末端修复缓冲液和 3 μL 末端修复酶制备 ERA 混合物，轻轻手动轻弹 3x-5x，然后离心 1-3 秒。
   3. 将 ERA 混合物加入 50 μL 破碎的 DNA 样品中，轻轻混合，然后离心 1-3 秒。
   4. 将其放入PCR仪器中并选择ERA程序（20°C30分钟;65°C30分钟;4°C保持;盖子 85 °C）。在 2 小时内执行下一个作。
3. 如下所述进行接头结扎。
   1. 通过加入 30 μL 连接缓冲液、10 μL DNA 连接酶和 10 μL DNA 接头来制备反应系统 LIG 混合物。然后，轻轻手动轻弹 3x-5x 并离心 1-3 秒。
   2. 将 50 μL LIG 混合物添加到上一步的 60 μL 产物中，轻轻混合，然后离心 1-3 秒。
   3. 将混合物放入PCR仪器中，然后选择LIG程序（20°C15分钟，不加热盖子;70°C10分钟（加热盖）;4°C保持;盖子 85 °C）。
4. 进行磁珠纯化。
   1. 取 1.5 mL 低吸附离心管，加入 88 μL 均质磁珠和 110 μL 接头连接产物。涡旋并充分混合，并在室温下孵育5分钟。
   2. 立即将孵育的样品离心1-3秒，并将离心管放在磁架上。等待溶液清除（约 3-5 分钟）。
   3. 将管子固定在磁铁上后，打开盖子并使用移液器小心地吸出清除的上清液，不要干扰珠子颗粒。
   4. 将试管放在磁铁上，并在每个试管中加入 300 μL 新鲜制备的 75% 乙醇。
   5. 等待 1 分钟，让磁珠完全沉淀。缓慢水平旋转离心管一次以吸收乙醇。
   6. 重复步骤 2.4.4 和 2.4.5 一次，总共 2 次。
   7. 瞬时离心1-3秒，将试管放回磁架上等待30秒。使用移液器去除任何残留的乙醇并保持管盖打开。
   8. 将磁珠在室温下干燥 2 分钟，直到磁珠表面呈哑光且无裂纹。
   9. 用 28 μL 洗脱缓冲液 （EB） 洗脱连接产物。
      注意：磁珠在使用前需要在室温下平衡至少 30 分钟。
5. 如下所述扩增和纯化预文库。
   1. 通过加入 10 μL PCR 缓冲液、10 μL PCR 引物、1.5 μL dNTP 混合物、1 μL PCR 酶来制备反应系统预混液。轻轻手动敲击 3x-5x 并离心 1-3 秒。
   2. 将 22.5 μL 预混液加入上一步的 27.5 μL 纯化产物中，轻轻混合，然后离心 1-3 秒。
   3. 选择程序 PRE：98 °C 45 秒;（98°C 15 s、60 °C 30 s、72 °C 30 s）12 个循环;72°C 2分钟;4°C保持;盖子 105 °C。
   4. PCR程序完成后，使用新鲜制备的75%乙醇进行磁珠纯化。用 18 μL EB 洗脱产物。
6. 捕获混合体，如下所述。
   1. 通过加入 15 μL 预文库和 4 μL 阻断剂混合物来制备反应系统 A。
   2. 置于 PCR 上并运行 PCR 程序 HYB（95 °C 5 分钟;65 °C 保持;盖子 105 °C）。
   3. 通过加入 10 μL 杂交缓冲液、0.5 μL RNase 抑制剂阻滞剂和 1 μL 探针制备反应系统 B HYB 混合物。轻弹 3x-5x 并离心 1-3 秒。
      注意：探针名称为LCOO1，探针基因包括 EGFR、KRAS、BRAF、ALK等。
   4. 当PCR仪器温度降至65°C时，向反应系统A中加入11.5μLHYB混合物，轻轻混合，然后盖上PCR仪器盖，继续孵育16-24小时。
   5. 将洗涤缓冲液 2 放入 15 mL 锥形管中，用金属加热器在 65 °C 下孵育，每个样品的剂量为 600 μL。
   6. 取SCB磁珠，反转混合5次，涡旋10秒，室温平衡30分钟。涡旋 10 秒，将 25 μL 转移到 1.5 mL 低吸附离心管中，放在磁架上 3 分钟，然后丢弃上清液。
   7. 将 200 μL 珠子洗涤缓冲液加入 25 μL SCB 磁珠中，涡旋并混合 3 秒，暂时离心 1-3 秒，在磁架上静置 3 分钟，然后弃去上清液。
   8. 重复步骤 2.6.7 2x，总共 3 次。
   9. 将 200 μL 磁珠洗涤缓冲液加入磁珠中，涡旋并混合 3 秒，重悬备用。
   10. 将约 30 μL 杂交样品转移到重悬的 SCB 磁珠中，涡旋并混合，放在旋转混合器上，在室温下孵育 30 分钟，然后离心 1-3 秒。
   11. 将混合物管放在磁架上 3 分钟，然后吸出约 230 μL 上清液。加入 500 μL 洗涤缓冲液 1，涡旋 5 秒，置于旋转混合器上，然后在室温下孵育 15 分钟。瞬时离心机 1-3 秒。
   12. 将磁珠样品混合物管放在磁架上，静置 3 分钟。然后，吸出约 500 μL 上清液和残余液体。
   13. 将 150 μL 洗涤缓冲液预热至 2 至 65 °C，涡旋 10 秒，置于恒温混合器上，摇匀，并在 65 °C 下以 600 rpm 的速度孵育 10 分钟。进行瞬时离心1-3秒，放在磁架上3分钟，吸出约150μL上清液和残液。
   14. 重复步骤 2.6.13 3 次，总共四次。
   15. 瞬时离心 1-3 秒，以去除样品管中的任何残留液体。加入 20 μL EB，上下混合 8x-10x，充分混合，然后放在冰上备用。
7. 最终文库的制备和纯化。
   1. 通过加入 25 μL 扩增混合物、5 μL 索引和 20 μL 磁珠文库来制备反应系统 POST 混合物。轻轻敲击 3x-5x 并离心 1-3 秒。轻轻混合，离心1-3秒。
   2. 选择程序 POST：98 °C 45 秒;（98°C 15 s、60 °C 30 s、72 °C 30 s）12 个循环;72°C 10分钟;4°C保持;盖子 105 °C。
   3. PCR程序完成后，使用新鲜制备的75%乙醇进行磁珠纯化。用 20 μL EB 洗脱最终文库。

3. 全自动文库制备（表 5）

1. 按电源按钮激活系统并等待初始化。导航到程序设置并选择运行协议，然后选择协议：燃烧的岩石 HS。
2. 将等分试样QC参数设置为样品类型：高质量DNA;输入量（ng）：50;PCR 前循环：12;PCR 后循环：12。单击运行。
3. 将预包装的试剂盒插入指定插槽（自动验证试剂放置和状态）。
4. 加载样品后，按 “开始” ，使系统自主运行。观察 LED 指示灯以监控进度。
5. 程序结束后，单击 “确定 ”，程序会自动将最终文库转移到文库管中，完成文库制备。

4. 测序和质量控制

1. 如下所述进行文库定量和QC。
   1. 使用荧光法测量前文库和总文库浓度。
   2. 检测文库的片段大小。使用试剂盒评估文库的片段大小和接头的存在（材料表）。
      注意：如果最终文库包含引物二聚体，则在机器上混合样品之前必须添加额外的纯化步骤。插入片段的合格标准≥150 bp，预期捕获效率≥40%。
   3. 将测序文库稀释至 1.6 pM 和 1300 μL 以进行测序作。
2. 如下所述进行测序环境监测。
   1. 控制测序环境，包括室内温度（19-25°C）、室内湿度（20%-80%）。
   2. 完整的仪器输出数据质量控制，包括Q30以上的碱基和簇密度通过滤波器（PF）。

5. 测序数据分析和质量控制

1. 如下所述执行原始数据处理和分子分析。
   1. 使用 Burrows-Wheeler Aligner（版本 0.7.10）将测序数据与 hg19 对齐。
   2. 使用基因组分析工具包（3.2 版）和 Vardict（1.5.1 版）执行局部比对、优化、重复标记和变异检出。
   3. 使用 VarScan（版本 2.4.3）fpfilter 管道过滤变体，并删除深度小于 50 的基因座。将 ExAC、1000 基因组、dbSNP 或 ESP6500SI-V2 数据库中群体频率超过 0.1% 的变异分类和排除为单核苷酸多态性 （SNP）。
   4. 使用 SnpEff（版本 3.6）注释其余变体。
   5. 使用 MarkSV（Burning Rock 算法工具）分析结构变异 （SV），包括大型基因组重排 （LGR）。根据捕获间隔的覆盖深度数据分析拷贝数变异 （CNV）。
   6. 更正鸟嘌呤-胞嘧啶含量和探针设计导致的测序偏差的覆盖率数据。
2. 评估样品质量，包括平均深度、中位深度、唯一深度、插入片段大小、库复杂度、覆盖率、Q30 比率和配对样品相关比，如²⁵ 中所述。
3. 对于报告生成，验证管道版本和参数以完成生物信息学审查。使用相关指南评估突变的致病性^26,27。发布最终报告。

结果

该实验室利用具有严格质量控制的自动化 NGS 分析工作流程，对 NSCLC 标本进行了全面的基因组分析。优化的检测工作流程（图 2）可靠地识别了代表性肿瘤样本中的几个临床上可作的基因组改变（图 3）。

测序结果显示， EGFR p.L858R错义突变（AF=89.25%）伴有 EGFR 基因拷贝数显著扩增（CN=14.7）。此外，观察到 MET 基因的中度扩增（CN=5.0）和 BRAF 基因的低水平扩增（CN=3.8）。在分析的面板中未检测到其他致病基因改变。关于免疫治疗相关的生物标志物，结果显示肿瘤突变负荷（TMB=9.0突变/Mb）和微卫星稳定状态（MSS; 表6）。

通过使用标准MPC01进行四次独立的重复实验来评估工作流程的可重...

讨论

每一份合格的 NGS 报告都隐藏在一个严格的流程背后，该流程仍然复杂且耗时²⁸.为了解决这些问题，实验室开发了一种全自动 NGS 系统。这种作显着减少了人工干预，最大限度地减少了实验错误，并大大缩短了周转时间。因此，该系统为NGS提供了更可靠、更高效的策略，为基因组研究的数据质量树立了新的思路。

该集成系统在整个工作流程中具有全面的自动化功能，可提高处理效率和结果可靠性。首先，对于核酸提取，实验室使用基于磁珠的自动化核酸提取系统对FFPE样本进行处理。FFPE样本作为医院病理实验室常见的存档标本，具有重要的回顾性研究价值，但其核酸易受损，传统提取工艺繁琐²⁹。自动化系统精确控制裂解、结合、洗涤和洗脱等步骤，不仅减少了手动作错误，还实现了高通量处理，显着提高了DNA/RNA的纯度和产量。

此外，超声处理用于实验室中的 DNA 片段化。与酶法相比，超声可以直接产生适合...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安捷伦 高灵敏度DNA套件	安捷伦	5067-4626	用于与 the  一起使用;安捷伦2100生物分析仪系统
安捷伦 DNA 1000 试剂套装	安捷伦	5067-1504	用于与 the  一起使用;安捷伦2100生物分析仪系统
安捷伦2100生物分析仪	安捷伦	G2939A	评估库的片段大小及适配器的存在情况。
全自动核酸纯化仪器	音乐会	MC1002	用于DNA提取
等量1×dsDNA HS 检测套件	瓦兹姆	EQ121-02-AA	用于与 the  一起使用;量子比特3.0荧光仪
人类EGRR/KRAS/BRAF/ALK基因联合检测套件	燃烧的岩石	BR-LC00102	图书馆建设
马格尼斯英国铁路	安捷伦科技	G7595AA	自动化NGS库制备
ME220聚焦超声波仪	科瓦里斯	500396	超声波
纳米滴一/OneC	赛莫飞舍尔	ND-ONE-W	全波长紫外可见光光度检测
NextSeq 550Dx	光辉	20005715	序列
NSQ 500/550 高输出 KT v2.5（300CYS）	光辉	20024908	用于NextSeq 550Dx
核酸提取试剂	音乐会	RC1102	用于DNA提取
量子比特3.0荧光仪	生命	Q33216	用于核酸或文库浓度检测
Qubit dsDNA HS 检测套件	生命	Q32851	用于与 the  一起使用;量子比特3.0荧光仪