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方法文章

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

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DOI：

10.3791/69091

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2025年10月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的成功依赖于对驱动基因变异的精确诊断，包括突变、基因融合和扩增。下一代测序（NGS）作为一种全面的分子诊断工具，能够检测已知和 novel 的基因组异常，为NSCLC个体化治疗提供关键支持。然而，NGS仍是一种技术复杂且操作难度较高的方法。尽管该技术已广泛应用，但仍面临技术复杂性和检测周期较长等挑战。本文介绍了在临床实验室中实施的通过ISO15189认证的NGS检测流程。该标准化流程包括肿瘤细胞含量评估（≥20%）、从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取DNA（DNA输入量≥50 ng）、自动化文库构建以及生物信息学分析。通过在每个步骤中整合严格的质控（QC）措施，该流程确保了数据的高度可靠性。此外，该流程的关键创新在于NGS文库构建的自动化。NGS文库自动化系统涵盖末端修复、A尾添加、接头连接、杂交捕获及纯化等步骤，有效减少了人为误差，提高了实验的可重复性，缩短了操作时间，从而提升了整体效率。综上经验表明，严格的质控和自动化文库制备对于保障临床NGS检测的准确性与可扩展性至关重要。这一优化方案不仅确保了符合ISO15189标准，也满足了NSCLC管理中精准肿瘤学日益增长的需求。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的75%–85%，既是临床重点，也是治疗上的挑战1,2,3。近年来，随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）等分子靶向药物的成功研发和临床应用，晚期非小细胞肺癌的治疗已进入个体化精准治疗时代4,5,6。靶向治疗具有疗效精准、特异性强和副作用小的优点7,8。这种治疗模式的转变同时提高了对分子诊断技术的需求。

目前，全面的肿瘤靶向检测已成为临床实践中不可或缺的组成部分，有助于阐明准确的基因突变谱，从而为后续靶向药物使用、耐药监测及预后评估提供可靠依据。特别是基于高通量测序（NGS）的多基因检测，凭借其高通量和高灵敏度的技术优势，已被推荐用于临床应用9,10,11,12。

与传统分子诊断技术相比，NGS展现出突破性的优势。NGS最主要的优点在于其高通量能力，可同时检测多个基因，包括已知和未知的遗传变异13,14。同时，NGS可在单次运行中实现全面检测，相对降低了成本、样本消耗以及检测周转时间15,16。鉴于这些优势，NGS在临床实践中的应用日益广泛。然而，NGS的流程较为复杂，包括肿瘤细胞含量评估、核酸提取、自动化文库构建以及生物信息学分析。初始样本处理的质量直接影响后续生物信息学分析的性能17。特别是文库构建，涉及一系列步骤，将原始核酸样本转化为适用于测序仪器的标准文库。文库构建包括片段化、末端修复、接头连接和PCR扩增18。这一复杂过程常引入多种技术偏差：例如，片段化可能导致异染色质区域的覆盖不足；连接酶在接头连接过程中对底物的偏好性可能导致某些序列的丢失；而PCR扩增则容易在GC含量极端的区域引起覆盖不均19。这些系统性偏差不仅会降低测序数据的质量，还可能导致后续生物信息学分析得出错误结论。因此，建立严格的质控体系对于确保实验结果的可靠性和一致性至关重要。

为解决这些长期存在的技术难题，该实验室已采用了一套完全自动化的高通量测序（NGS）系统。该系统旨在减少人工操作时间，缩短整体检测周期。通过采用可编程的实验流程，确保操作的灵活性与处理的精确性，同时利用集成化的模块和单元，有效降低每一步骤中潜在的技术偏差。此外，该自动化解决方案不仅提高了文库构建的可重复性和通量，更重要的是确保测序数据能够更准确地反映原始样本的分子组成。本文中，该实验室将通过基于DNA的高通量测序检测驱动基因变异，对该系统进行介绍。

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方案

该方案已获得针对匿名化存档样本的机构审查委员会豁免。

1. 测试前步骤和质控

  1. 在实验室信息管理系统中登记样本信息（表1）。填写基因突变检测的知情同意书。
  2. 接收非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。确保用于检测的样本为储存时间不超过2年的石蜡组织样本。确保样本按照标准病理学方法进行处理和保存。
    注：本研究主要关注方法学流程，而非大规模临床分析，因此本阶段研究未设定具体的样本数量要求。
  3. 使用一次性切片刀进行切片。在不同样本之间更换刀片、镊子和1.5 ml离心管，以防止交叉污染，并避免引入操作者来源的污染物（如毛发、皮肤细胞、唾液）。
    注：大样本（≥ 0.5 cm × 0.5 cm）取6–10 µL，共5张切片；小样本（< 0.5 cm × 0.5 cm）及穿刺样本，取6–10 µL，共10张切片。
  4. 进行常规苏木精-伊红（HE）染色，以评估肿瘤细胞含量。
  5. 选择含有≥20%恶性肿瘤细胞的样本用于后续分析。肿瘤含量由病理医师在HE染色玻片上进行评估20。
    注：若肿瘤含量低于20%，可在HE切片中标记肿瘤区域的指导下，刮取相应肿瘤组织区域。该过程通过有效去除周围非肿瘤成分实现肿瘤组织富集，从而显著提高所采集材料中肿瘤细胞的比例。
  6. 使用自动化纯化系统进行核酸提取，步骤如下。
    1. 使用切片机对FFPE组织块进行切片以获得切片条带，将条带放入1.5 ml微量离心管中，并转移至自动提取仪指定的样本输入位置。
    2. 使用配备自动提取试剂盒的自动提取仪，以自动磁珠法核酸提取系统替代人工移液操作。
      注：该步骤的自动化有助于确保核酸的高精度和可重复性提取，满足下游高通量测序（NGS）应用的要求。
    3. 参照全自动核酸纯化仪及核酸提取试剂的说明书进行核酸提取。
    4. 随后选择C1102程序，设定样本脱蜡孵育时间为16小时，洗脱体积为100 µL。
      注：若提取的DNA溶液不能立即检测，需在-20 °C保存，且保存时间不得超过6个月。
  7. 按照以下方法评估核酸质量（表2）。
    1. 采用琼脂糖凝胶电泳法测定DNA片段大小。对于低浓度样本，可使用Agilent2100等微流控毛细管电泳分析系统。
    2. 将1 g琼脂糖溶于100 mL TAE溶液中，水浴加热至透明，冷却至约60 °C。
    3. 将电泳仪正极（红色）连接，负极（黑色）施加180 V电压，电泳15分钟21,22。
    4. 根据琼脂糖凝胶电泳结果，将片段大小分为四个等级（A–D；表3），选择A–C级核酸用于后续操作。
    5. 采用分光光度法检测纯度，确保OD260/OD280 > 1.8，OD260/OD230 > 2.0，以表明污染物水平在可接受范围内23,24。
    6. 使用基于序列特异性荧光染料的检测试剂盒（材料表），通过荧光定量法精确测定DNA浓度。
    7. 取1 µL待测DNA加入199 µL工作液中，混匀后短暂离心，使用荧光计（材料表）测定其浓度。

2. 文库构建与质控（图 1）

  1. 使用超声处理法（参见材料表）制备基因组DNA片段，具体步骤如下。
    1. 将200 ng基因组DNA溶于50 µL低浓度Tris-EDTA（TE）缓冲液中，然后将样品管置于预冷（8 °C）的样品架中。
    2. 根据表4设置仪器参数，随后启动片段化程序。
    3. 采用琼脂糖凝胶电泳验证片段化效果。此步骤产生的DNA片段末端存在损伤，需进行末端修复，转化为平末端以用于后续操作。
  2. 进行末端修复及3'端加A，具体步骤如下。
    1. 利用酶修复FFPE DNA的损伤末端，形成平末端，确保产生3'-OH和5'-P；在已变平的双链DNA 3'末端添加A碱基。
    2. 通过加入7 µL末端修复缓冲液和3 µL末端修复酶配制ERA混合液，轻轻弹击管壁3–5次，短暂离心1–3秒。
    3. 将ERA混合液加入50 µL断裂后的DNA样品中，轻轻混匀，短暂离心1–3秒。
    4. 将反应管放入PCR仪中，选择ERA程序（20 °C孵育30分钟；65 °C孵育30分钟；4 °C保持；热盖85 °C），并在2小时内进行下一步操作。
  3. 进行接头连接，具体步骤如下。
    1. 通过加入30 µL连接缓冲液、10 µL DNA连接酶和10 µL DNA接头配制反应体系LIG混合液，轻轻弹击3–5次，短暂离心1–3秒。
    2. 将50 µL LIG混合液加入上一步所得60 µL产物中，轻轻混匀，短暂离心1–3秒。
    3. 将混合物放入PCR仪中，选择LIG程序（20 °C孵育15分钟，不加热热盖；70 °C孵育10分钟，加热热盖；4 °C保持；热盖85 °C）。
  4. 进行磁珠纯化。
    1. 取1.5 mL低吸附离心管，加入88 µL均质化磁珠和110 µL接头连接产物，涡旋充分混匀，在室温下孵育5分钟。
    2. 立即短暂离心孵育后的样品1–3秒，将离心管置于磁力架上，静置至溶液澄清（约3–5分钟）。
    3. 保持离心管固定在磁力架上，打开管盖，用移液器小心吸取上清液，避免扰动磁珠沉淀。
    4. 保持离心管在磁力架上，向每管中加入300 µL新鲜配制的75%乙醇。
    5. 静置1分钟，使磁珠完全沉降，缓慢水平旋转离心管一次以吸收乙醇。
    6. 重复步骤2.4.4和2.4.5一次，共进行两次。
    7. 短暂离心1–3秒，将离心管放回磁力架，静置30秒，用移液器去除残留乙醇，并保持管盖打开。
    8. 在室温下干燥磁珠2分钟，直至磁珠表面呈哑光状且无裂纹。
    9. 用28 µL洗脱缓冲液（EB）洗脱连接产物。
      注：磁珠使用前需在室温下平衡至少30分钟。
  5. 扩增并纯化预文库，具体步骤如下。
    1. 通过加入10 µL PCR缓冲液、10 µL PCR引物、1.5 µL dNTP混合液和1 µL PCR酶配制反应体系预混液，轻轻弹击管壁3–5次，短暂离心1–3秒。
    2. 将22.5 µL预混液加入上一步纯化所得27.5 µL产物中，轻轻混匀，短暂离心1–3秒。
    3. 选择程序PRE：98 °C 45秒；(98 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 30秒) 12个循环；72 °C 2分钟；4 °C保持；热盖105 °C。
    4. PCR程序完成后，使用新鲜配制的75%乙醇进行磁珠纯化，用18 µL EB洗脱产物。
  6. 进行杂交捕获，具体步骤如下。
    1. 通过加入15 µL预文库和4 µL阻断剂混合液配制反应体系A。
    2. 置于PCR仪中运行PCR程序HYB（95 °C 5分钟；65 °C保持；热盖105 °C）。
    3. 通过加入10 µL杂交缓冲液、0.5 µL RNase抑制剂阻断剂和1 µL探针配制反应体系B（HYB混合液），轻轻弹击3–5次，短暂离心1–3秒。
      注：探针名称为LCOO1，探针覆盖的基因包括EGFR, KRAS, BRAF, ALK等。
    4. 当PCR仪温度降至65 °C时，向反应体系A中加入11.5 µL HYB混合液，轻轻混匀，盖上PCR仪盖，继续孵育16–24小时。
    5. 将洗涤缓冲液2按每份样品600 µL的量加入15 mL锥形管中，使用金属加热器在65 °C预热。
    6. 取出SCB磁珠，反复颠倒混匀5次，涡旋10秒，在室温下平衡30分钟；再次涡旋10秒，转移25 µL至1.5 mL低吸附离心管中，置于磁力架上3分钟，弃去上清液。
    7. 向25 µL SCB磁珠中加入200 µL磁珠洗涤缓冲液，涡旋混匀3秒，短暂离心1–3秒，置于磁力架上静置3分钟，弃去上清液。
    8. 重复步骤2.6.7两次，共进行三次。
    9. 向磁珠中加入200 µL磁珠洗涤缓冲液，涡旋混匀3秒，重悬备用。
    10. 将约30 µL杂交样品转移至重悬的SCB磁珠中，涡旋混匀，置于旋转混合仪上，在室温下孵育30分钟，短暂离心1–3秒。
    11. 将混合管置于磁力架上静置3分钟，吸走上清液约230 µL；加入500 µL洗涤缓冲液1，涡旋5秒，置于旋转混合仪上，在室温下孵育15分钟，短暂离心1–3秒。
    12. 将磁珠样品混合管置于磁力架上静置3分钟，吸走上清液及残留液体约500 µL。
    13. 将150 µL洗涤缓冲液2预热至65 °C，涡旋10秒，置于恒温混合仪中，以600 rpm振荡并在65 °C孵育10分钟；短暂离心1–3秒，置于磁力架上3分钟，吸走上清液及残留液体约150 µL。
    14. 重复步骤2.6.13三次，共进行四次。
    15. 短暂离心1–3秒，去除样品管中残留液体；加入20 µL EB，上下吹打8–10次，充分混匀，置于冰上备用。
  7. 最终文库的制备与纯化。
    1. 通过加入25 µL扩增混合液、5 µL index和20 µL磁珠文库配制反应体系POST混合液，轻轻弹击3–5次，短暂离心1–3秒，充分混匀后再短暂离心1–3秒。
    2. 选择程序POST：98 °C 45秒；(98 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 30秒) 12个循环；72 °C 10分钟；4 °C保持；热盖105 °C。
    3. PCR程序完成后，使用新鲜配制的75%乙醇进行磁珠纯化，用20 µL EB洗脱最终文库。

3. 完全自动化的文库构建（表5）

  1. 按下Power按钮以启动系统，并等待初始化完成。进入程序设置界面，选择Run Protocol，然后选择Protocol: Burning Rock HS。
  2. 设置分装质控参数：样本类型为高质量DNA；输入量（ng）：50；PCR前循环数：12；PCR后循环数：12。点击RUN。
  3. 将预封装的试剂盒插入指定卡槽（系统将自动验证试剂的位置和状态）。
  4. 加载样本后，按下Start按钮，系统将自动运行。观察LED指示灯以监控运行进度。
  5. 程序结束后，点击OK，系统将自动把最终文库转移至文库管中，完成文库制备。

4. 测序与质量控制

  1. 按照以下说明进行文库定量和质控。
    1. 使用荧光测定法检测建库前及总文库的浓度。
    2. 检测文库的片段大小。使用试剂盒评估文库的片段大小以及接头的存在情况（Table of Materials）。
      注意：如果最终文库中含有引物二聚体，则在上机混合样本前必须增加一步纯化步骤。插入片段的合格标准为 ≥ 150 bp，预期捕获效率为 ≥ 40 %。
    3. 将测序文库稀释至 1.6 pM 并定容至 1300 µL，用于测序操作。
  2. 按照以下说明进行测序环境监测。
    1. 控制测序环境条件，包括室内温度（19–25 °C）和室内湿度（20%–80%）。
    2. 完成仪器输出数据的质控，包括Q30以上碱基比例和通过滤波的簇密度（PF）。

5. 测序数据分析与质控

  1. 按照以下说明进行原始数据处理和分子谱型分析。
    1. 使用 Burrows-Wheeler Aligner（版本 0.7.10）将测序数据比对至 hg19 参考基因组。
    2. 使用 Genome Analysis Tool Kit（版本 3.2）和 Vardict（版本 1.5.1）进行局部比对、优化、重复标记和变异检测。
    3. 使用 VarScan（版本 2.4.3）的 fpfilter 流程过滤变异，并剔除测序深度低于 50 的位点。根据 ExAC、1000 Genomes、dbSNP 或 ESP6500SI-V2 数据库中群体频率超过 0.1% 的情况，将相应变异分类并排除为单核苷酸多态性（SNPs）。
    4. 使用 SnpEff（版本 3.6）对剩余变异进行注释。
    5. 使用 MarkSV（Burning Rock 算法工具）分析结构变异（SVs），包括大片段基因组重排（LGRs）。基于捕获区间的覆盖深度数据，分析拷贝数变异（CNVs）。
    6. 校正由于鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量和探针设计引起的测序偏差对覆盖度数据的影响。
  2. 评估样本质量，包括平均深度、中位深度、唯一深度、插入片段大小、文库复杂性、覆盖度、Q30 比例以及配对样本相关性比例，具体方法见文献25。
  3. 在生成报告时，核实分析流程的版本和参数，完成生物信息学审核。依据相关指南评估突变的致病性26,27，签发最终报告。

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结果

利用具有严格质量控制的自动化NGS分析流程，该实验室对非小细胞肺癌（NSCLC）样本进行了全面的基因组谱分析。优化后的检测流程（图2）在代表性肿瘤样本中可靠地鉴定出多种具有临床可操作性的基因组变异（图3）。

测序结果表明存在高频的EGFR p.L858R错义突变（突变等位基因频率=89.25%），并伴有显著的EGFR基因拷贝数扩增（拷贝数=14.7）。此外，还观察到MET基因的中度扩增（拷贝数=5.0）和BRAF基因的低水平扩增（拷贝数=3.8）。在所分析的基因检测 panel 中未发现其他致病性基因变异。关于免疫治疗相关生物标志物，结果显示肿瘤突变负荷处于中等水平（TMB=9.0个突变/Mb），微卫星状态为稳定（MSS；表6）。

通过使用标准品MPC01进行四次独立的重复实验，评估了该工作流程的重复性。...

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讨论

每一份合格的二代测序（NGS）报告背后都依赖于一个严格但复杂且耗时的流程28。为解决这些问题，实验室开发了一套完全自动化的NGS系统。该操作显著减少了人工干预，最大限度地降低了实验误差，并大幅缩短了检测周期。因此，该系统为NGS提供了更可靠、更高效的策略，为基因组研究中的数据质量建立了新的思路。

该集成系统实现了整个工作流程的全面自动化，显著提升了处理效率和结果的可靠性。首先，在核酸提取环节，实验室采用基于磁珠的自动化核酸提取系统来处理福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。FFPE样本是医院病理科常见的存档标本，具有重要的回顾性研究价值，但其核酸容易受损，且传统提取流程繁琐29。该自动化系统可精确控制裂解、结合、洗涤和洗脱等步骤，不仅减少了人为操作误差，还能实现高通量处理，显著提高DNA/RNA的纯度和得率。

此外，超声处理在实验室中也用于DNA片段化。与酶法相比，超声处理可直接产生适用于下游检测的DNA片段，无需额外的纯化步骤

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由中华人民共和国北京自然科学基金（7252122）、中华人民共和国北京希思科临床肿瘤研究基金会（Y-HS202402-0021）、中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院住院医师培训教学研究基金（E2025004）以及国家高水平医院临床研究经费（2025-LYZX-R-B03）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 Agilent  高灵敏度 DNA 检测试剂盒 Agilent5067-4626与  Agilent 2100 Bioanalyzer 系统配合使用
 Agilent DNA 1000 试剂盒 Agilent5067-1504与  Agilent 2100 Bioanalyzer 系统配合使用
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939A用于评估文库片段大小及接头的存在情况 
Concert 全自动核酸提取仪CONCERTMC1002用于 DNA 提取
Equalbit 1×dsDNA HS 检测试剂盒VazymeEQ121-02-AA与  Qubit 3.0 荧光计配合使用
人 EGFR/KRAS/BRAF/ALK 基因突变联合检测试剂盒Burning RockBR-LC00102文库构建
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AA自动化 NGS 文库制备
ME220 专注式超声破碎仪Covaris500396超声破碎
NanoDrop One/OneCThermo FisherND-ONE-W全波长紫外-可见光分光光度检测
NextSeq 550DxIllumina20005715测序
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)Illumina20024908与 NextSeq 550Dx 配合使用
核酸提取试剂CONCERTRC1102用于 DNA 提取
Qubit 3.0 荧光计LifeQ33216用于核酸或文库浓度检测
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒LifeQ32851与  Qubit 3.0 荧光计配合使用

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