使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

摘要

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗的成功依赖于对驱动基因变异的精确诊断，包括突变、基因融合和扩增。下一代测序（NGS）作为一种全面的分子诊断工具，能够检测已知和 novel 的基因组异常，为NSCLC个体化治疗提供关键支持。然而，NGS仍是一种技术复杂且操作难度较高的方法。尽管该技术已广泛应用，但仍面临技术复杂性和检测周期较长等挑战。本文介绍了在临床实验室中实施的通过ISO15189认证的NGS检测流程。该标准化流程包括肿瘤细胞含量评估（≥20%）、从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取DNA（DNA输入量≥50 ng）、自动化文库构建以及生物信息学分析。通过在每个步骤中整合严格的质控（QC）措施，该流程确保了数据的高度可靠性。此外，该流程的关键创新在于NGS文库构建的自动化。NGS文库自动化系统涵盖末端修复、A尾添加、接头连接、杂交捕获及纯化等步骤，有效减少了人为误差，提高了实验的可重复性，缩短了操作时间，从而提升了整体效率。综上经验表明，严格的质控和自动化文库制备对于保障临床NGS检测的准确性与可扩展性至关重要。这一优化方案不仅确保了符合ISO15189标准，也满足了NSCLC管理中精准肿瘤学日益增长的需求。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的75%–85%，既是临床重点，也是治疗上的挑战^1,2,3。近年来，随着表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）等分子靶向药物的成功研发和临床应用，晚期非小细胞肺癌的治疗已进入个体化精准治疗时代^4,5,6。靶向治疗具有疗效精准、特异性强和副作用小的优点^7,8。这种治疗模式的转变同时提高了对分子诊断技术的需求。

目前，全面的肿瘤靶向检测已成为临床实践中不可或缺的组成部分，有助于阐明准确的基因突变谱，从而为后续靶向药物使用、耐药监测及预后评估提供可靠依据。特别是基于高通量测序（NGS）的多基因检测，凭借其高通量和高灵敏度的技术优势，已被推荐用于临床应用^9,10,

方案

该方案已获得针对匿名化存档样本的机构审查委员会豁免。

1. 测试前步骤和质控

1. 在实验室信息管理系统中登记样本信息（表1）。填写基因突变检测的知情同意书。
2. 接收非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。确保用于检测的样本为储存时间不超过2年的石蜡组织样本。确保样本按照标准病理学方法进行处理和保存。
   注：本研究主要关注方法学流程，而非大规模临床分析，因此本阶段研究未设定具体的样本数量要求。
3. 使用一次性切片刀进行切片。在不同样本之间更换刀片、镊子和1.5 ml离心管，以防止交叉污染，并避免引入操作者来源的污染物（如毛发、皮肤细胞、唾液）。
   注：大样本（≥ 0.5 cm × 0.5 cm）取6–10 µL，共5张切片；小样本（< 0.5 cm × 0.5 cm）及穿刺样本，取6–10 µL，共10张切片。
4. 进行常规苏木精-伊红（HE）染色，以评估肿瘤细胞含量。
5. 选择含有≥20%恶性肿瘤细胞的样本用于后续分析。肿瘤含量由病理医师在HE染色玻片上进行评估²⁰。
   注：若肿瘤含量低于20%，可在HE切片中标记肿瘤区域的指导下，刮取相应肿瘤组织区域。该过程通过有效去除周围非肿瘤成分实现肿瘤组织富集，从而显著....

结果

利用具有严格质量控制的自动化NGS分析流程，该实验室对非小细胞肺癌（NSCLC）样本进行了全面的基因组谱分析。优化后的检测流程（图2）在代表性肿瘤样本中可靠地鉴定出多种具有临床可操作性的基因组变异（图3）。

测序结果表明存在高频的EGFR p.L858R错义突变（突变等位基因频率=89.25%），并伴有显著的EGFR基因拷贝数扩增（拷贝数=14.7）。此外，还观察到MET基因的中度扩增（拷贝数=5.0）和BRAF基因的低水平扩增（拷贝数=3.8）。在所分析的基因检测 panel 中未发现其他致病性基因变异。关于免疫治疗相关生物标志物，结果显示肿瘤突变负荷处于中等水平（TMB=9.0个突变/Mb），微卫星状态为稳定（MSS；表6）。

通过使用标准品MPC01进行四次独立的重复实验，评估了该工作流程的重复性。.......

讨论

每一份合格的二代测序（NGS）报告背后都依赖于一个严格但复杂且耗时的流程²⁸。为解决这些问题，实验室开发了一套完全自动化的NGS系统。该操作显著减少了人工干预，最大限度地降低了实验误差，并大幅缩短了检测周期。因此，该系统为NGS提供了更可靠、更高效的策略，为基因组研究中的数据质量建立了新的思路。

该集成系统实现了整个工作流程的全面自动化，显著提升了处理效率和结果的可靠性。首先，在核酸提取环节，实验室采用基于磁珠的自动化核酸提取系统来处理福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。FFPE样本是医院病理科常见的存档标本，具有重要的回顾性研究价值，但其核酸容易受损，且传统提取流程繁琐²⁹。该自动化系统可精确控制裂解、结合、洗涤和洗脱等步骤，不仅减少了人为操作误差，还能实现高通量处理，显著提高DNA/RNA的纯度和得率。

此外，超声处理在实验室中也用于DNA片段化。与酶法相比，超声处理可直接产生适用于下游检测的DNA片段，无需额外的纯化步骤

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agilent  高灵敏度 DNA 检测试剂盒	Agilent	5067-4626	与  Agilent 2100 Bioanalyzer 系统配合使用
Agilent DNA 1000 试剂盒	Agilent	5067-1504	与  Agilent 2100 Bioanalyzer 系统配合使用
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939A	用于评估文库片段大小及接头的存在情况
Concert 全自动核酸提取仪	CONCERT	MC1002	用于 DNA 提取
Equalbit 1×dsDNA HS 检测试剂盒	Vazyme	EQ121-02-AA	与  Qubit 3.0 荧光计配合使用
人 EGFR/KRAS/BRAF/ALK 基因突变联合检测试剂盒	Burning Rock	BR-LC00102	文库构建
Magnis BR	Agilent Technologies	G7595AA	自动化 NGS 文库制备
ME220 专注式超声破碎仪	Covaris	500396	超声破碎
NanoDrop One/OneC	Thermo Fisher	ND-ONE-W	全波长紫外-可见光分光光度检测
NextSeq 550Dx	Illumina	20005715	测序
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5(300CYS)	Illumina	20024908	与 NextSeq 550Dx 配合使用
核酸提取试剂	CONCERT	RC1102	用于 DNA 提取
Qubit 3.0 荧光计	Life	Q33216	用于核酸或文库浓度检测
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Life	Q32851	与  Qubit 3.0 荧光计配合使用