基于PCR的集成分子检测系统，可同时检测多种来源的4种人畜共患肠道寄生虫

Summary

在这里，我们提出了一种基于聚合酶链反应（PCR）的综合分子检测系统的组合，同时检测来自多个来源的四种人畜共患肠道寄生虫的方案。

Abstract

传染病是影响人类健康、经济发展和社会稳定的关键因素。其中，人畜共患肠道寄生虫病作为新兴、重新出现的传染病，特别是 隐孢子虫、 双叶肠细胞虫、 囊胚和 贾第鞭毛虫，日益成为全球关注的焦点。关于上述寄生虫流行病学的研究仅发表了少数，并伴随着检测靶点单一、检出率低、漏检率高等问题。本研究旨在建立一种基于PCR检测组合的综合分子检测系统，同时检测野生小鼠、伴侣宠物和牲畜（牛羊）样本中的上述4种人畜共患肠道寄生虫，为多场景下的常规寄生虫检测提供高效的技术支持，包括动物环境界面，特别是在当地监测设施中。

本研究以95只野鼠和30只猫狗（猫25只，狗5只）粪便中 Enterocytozoon bieneusi 的检测为主要检测结果，当使用两组引物扩增ITS基因时，每次PCR的阳性结果完全相同（5.26%），但2组聚合酶链反应（PCR）检测组合的结果导致 Enterocytozoon bieneusi 的阳性率更高（6.32%）。贾 第鞭毛虫方面，使用β-贾第鞭毛虫（BG）基因检测到9个阳性样本，而使用谷氨酸脱氢酶（GDH）和磷酸三糖异构酶（TPI）基因未检测到阳性样本。上述结果表明，与任何单一的 PCR 检测相比，对多个靶基因片段的 PCR 检测组合增强了对指定病原体的检测能力。通过Sanger测序确认靶序列。该系统旨在加强和促进对人畜共患肠道寄生虫的感染状态、分布和系统发育进化的多来源监测，为早期准确、灵敏的预警提供依据。其目的是为实现跨人类-动物-环境界面的“同一健康”目标搭建一座技术桥梁。

Introduction

隐孢子虫、双肠细胞虫、囊胚和贾第鞭毛虫是常见且容易被忽视的原生动物病原体，在全球范围内流行。近年来，由于自然病灶生态位的开垦和侵入、伴侣动物养殖的普及、畜禽养殖的发展等因素，啮齿动物、伴侣动物（猫狗）、牲畜（牛羊）多源人畜共患肠道寄生虫病的流行日益成为新兴的焦点， 国内外传染病暴发，传染病再次出现，严重危害人类健康和全球公共卫生安全 1,2,3,4.

这些寄生虫具有复杂的属内物种和广泛的宿主适应性。它们不仅可以感染啮齿动物、伴侣动物、牲畜反刍动物、家禽和鸟类，还可以感染人畜共患物种，这些物种可以感染人类，引起腹痛、腹泻和呕吐等临床症状。它们在儿童、老人、孕妇和免疫功能低下的人群中特别容易受到影响，并且可以通过水、食物和空气传播，构成重大的人畜共患公共卫生风险^3,5,6。

目前，上述4种寄生虫的鉴定主要依赖于形态学，由于属内形态相似性和主观因素，特别是在区分物种和基因型方面，容易出现误鉴。分子生物学技术已广泛用于识别这些寄生虫的物种、属和基因型。对于囊胚和隐孢子虫，检测主要集中在小亚基核糖体核糖核酸（SSU rRNA）基因^3,7,8;对于 Enterocytozoon bieneusi，内部转录间隔区 （ITS） 基因 ^4,9;对于贾第鞭毛虫，β-贾第鞭毛虫 （BG）、谷氨酸脱氢酶 （GDH） 和磷酸三糖异构酶 （TPI） 基因^10,11。虽然巢式常规聚合酶链反应（PCR）大大提高了这4种寄生虫的识别和分型能力，但不足以检测漏诊病例和鉴定具有显著遗传特征的新物种或准种。这往往会影响人类、动物和其他宿主的流行病学调查、传播和疾病控制效率，对人类、动物和环境的公共卫生安全构成巨大挑战。

由于这四种寄生虫在症状、传播途径和宿主范围上相似，目前还没有任何集成的分子系统来高效检测，同时避免漏检，准确识别具有显着遗传差异的新物种或准种。本研究通过文献综述，建立了基于PCR-高通量测序技术的成熟综合分子检测系统，用于同时检测多源样本（野鼠、伴侣动物、牛和羊）中的4种人畜共患肠道寄生虫。结合生物信息学分析，将该系统应用于识别多源人畜共患肠道寄生虫，监测感染分布和系统发育进化等流行病学因素，对人和动物感染和环境污染进行预警。

Protocol

该研究经江苏省疾病预防控制中心动物伦理委员会批准并开展。本研究根据2020年版《美国兽医协会动物安乐死指南》、《实验动物管理条例指导原则》（中华人民共和国国家科技委令第2号，1988年）、中华人民共和国科学技术部颁布的《人道对待动物指导原则》进行。

1. 制备野生小鼠、伴侣动物和牲畜（牛羊）的新鲜粪便

1. 通过从透明密封塑料盒中的罐装压缩二氧化碳源吸入二氧化碳来麻醉小鼠，更换率为每分钟容器容积的30%-70%。完全麻醉和昏迷后，对小鼠进行颈部脱位。
2. 新鲜粪便样本采集：在排便后1 h内采集狗、猫、牛、羊的粪便样本，每只动物粪便一管，避免交叉污染。
   1. 在不同的野生栖息地使用带有释放装置的诱饵笼捕获啮齿动物。将捕获的小鼠放入小鼠袋中，并立即将它们运送到实验室。在生物安全柜中无菌作下，解剖小鼠以收集含有粪便的直肠，将其放入2mL冷冻管中，并储存在-80°C以备后期检测。
   2. 从不同地区的宠物店中选择狗和猫作为研究对象。立即将新鲜排出的粪便收集到5mL冷冻管中，用完整的样品信息进行标记，并立即将其运送到实验室储存在-80°C下。
   3. 选择畜牧场（集约化或散养）的牛羊作为研究对象。立即将新鲜排泄的粪便收集到50mL冷冻管中，标记有完整的样品信息，并立即将其运送到实验室储存在-80°C下。

2. 从野生小鼠、伴侣动物和牲畜（牛和羊）的新鲜粪便中提取总 DNA

1. 粪便预处理：
   注意：使用QIAamp Fast DNA粪便迷你试剂盒。
   1. 在生物安全柜中进行无菌作，将来自不同来源的约200mg粪便加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中，加入钢珠，并使用组织研磨机彻底均质化。
   2. 将其在70°C下加热5分钟，然后在室温（15-25°C）下以10,000 × g 离心10分钟。
   3. 将 600 μL 上清液加入含有 25 μL 蛋白酶 K 的 2 mL 离心管中，加入 600 μL 缓冲液 AL，涡旋 15 秒。
   4. 在70°C下孵育10分钟。将 600 μL 100% 无水乙醇加入裂解物中并涡旋混合。
2. 小心地将 600 μL 裂解物加入离心柱中，以 14000 × g 离心 1 分钟，然后将离心柱放入新的 2 mL 收集管中。再次重复此步骤。
3. 小心地打开离心柱，加入 500 μL 缓冲液 AW1，以最大速度离心 1 分钟，然后将离心柱放入新的 2 mL 收集管中。小心地打开离心柱，加入 500 μL 缓冲液 AW2，并以最大速度离心 3 分钟。
4. 将离心柱放入新的 2 mL 收集管（单独制备）中，并以 14000 × g 离心 3 分钟。将离心柱放入新的标记的 1.5 mL 离心管中，并将 100 μL 洗脱缓冲液直接添加到离心柱膜中。
5. 在室温（15-25°C）下孵育1分钟，以14000×g离心1分钟以洗脱DNA。
6. 使用超微分光光度计测定 DNA 的浓度和纯度。使用提取的DNA进行后续检测或储存在-20°C下进行长期保存。
   注意：A260/A280 比率应为 1.8-2.0，以确保提取 DNA 的完整性和纯度。

3. 靶向小亚基核糖体 RNA （SSU rRNA） 的 隐孢子虫 和 囊胚 的巢式常规 PCR 检测

注意：此步骤使用 Dream Taq Green PCR 混合物。

1. 使用 PCR 混合物在冰上制备 PCR 反应系统：25 μL 2× Taq 缓冲液、2 μL 正向和反向引物各 2 μL、16 μL ddH₂O 和 5 μL 模板，总体积为 50 μL。
2. 对于 隐孢子虫，请按照步骤 3.2.1-3.2.2 进行作。
   1. 使用 F1R1¹ 和 F-1R1-1 ^8,11 作为第一轮反应引物。设置反应程序：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸90秒，最终在72°C下伸长7分钟。
   2. 使用 F2R2¹ 和 F-1R2-1 ^8,11 作为第二轮引物，反应程序如下：在 94 °C 下初始变性 5 分钟，在 94 °C 下变性 30 次循环 40 秒，在 55 °C 下退火 40 秒，在 72 °C 下延伸 1 分钟，最终在 72 °C 下伸长 7 分钟。
3. 对于 囊胚，请按照步骤 3.3.1-3.3.4 进行作。
   1. 使用 F1R1³ 和 F1-1R-1 ^3,12 作为第一轮反应引物。将F1R1的反应程序设置为：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在60°C下退火40秒，在72°C下延伸100秒，最终在72°C下伸长7分钟。
   2. 将F1-1R-1的反应程序设置如下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸1分钟，最终在72°C下伸长7分钟。
   3. 使用 F2R2³ 和 F2-1R-1 ^3,12 作为第二轮引物。F2R2的反应程序设置如下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在60°C下退火40秒，在72°C下延伸1分钟，最终在72°C下伸长7分钟。
   4. 将F2-1R-1的反应程序设置为：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸50秒，最终在72°C下伸长7分钟。
      注意：引物序列如表1所示 1,3,8,11,12。

病原体	预期产品尺寸 （bp）	引物序列 （5'-3'）			引用
隐孢子虫 Cryptosporidium	830	F1：CCATTTCCTTCGAAACAGGA			1
		R1：TTCTAGAGCTAATACATGGG
		F2：AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
		R2：GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
	607	F-1：GACATATCATTCAAGTTTCTGACC			8,11
		R1-1：CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
		R2-1：TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
囊胚	600	F1：GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC			3
		R1：GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
		F2：ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
		R2：GAGCTTTTTAACTGCAACAACG
	460	F1-1：TGCTTTCGCACTTGTTCATC			3,12
		F2-1：GATTTATTGTCACTACCTCC
		R-1：ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

表1：隐孢子虫和囊胚的SSU rRNA的引物序列。

4. Enterocytozoon bieneusi ITS 基因、 贾第鞭毛虫 BG、GDH 和 TPI 基因的巢式常规 PCR 检测

注意：此步骤使用 Dream Taq Green PCR 混合物。

1. 使用 PCR 混合物在冰上制备 PCR 反应系统：25 μL 2× Taq 缓冲液、正向和反向引物各 2 μL、16 μL ddH₂O 和 5 μL 模板，总体积为 50 μL。
2. 对于 Enterocytozoon bieneusi，请按照步骤 4.2.1-4.2.2 进行作。
   1. 使用 F1R1⁹ 和 F1-1R1-1² 作为第一轮反应引物。将反应程序设置如下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次，40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸50秒，最终在72°C下伸长7分钟。
   2. 使用F2R2⁹ 和F2-1R2-1² 作为第二轮引物，反应程序如下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸50秒，最终在72°C下伸长7分钟。
3. 对于 贾第鞭毛虫，请按照步骤 4.3.1-4.3.3 进行作。
   1. 使用BG-F1R1，GDH-F1R1和TPI-F1R1 ^2,10作为三个靶基因的第一轮反应引物。将所有反应程序设置为以下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40s，在50°C下退火40秒，在72°C下延伸1分钟，最终在72°C下伸长7分钟。
   2. 将BG-F2R2 ^2,10和TPI-F2R2 ^2,10的第二轮反应程序设置为：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次，40秒，在55°C下退火40秒，在72°C下延伸50秒，最终在72°C下伸长7分钟。
   3. GDH-F2R2 ^2,10的第二轮反应程序设置如下：在94°C下初始变性5分钟，在94°C下变性30次40秒，在60°C下退火40秒，在72°C下延伸50秒，最终在72°C下伸长7分钟。
      注意：引物序列如表2 ^2,9,10所示。

病原体	预期产品尺寸 （bp）	引物序列 （5'-3'）			引用
双叶肠细胞动物 Enterocytozoon bieneusi	390	F1：GGTCATAGGGATGAAGAG			9
		R1：TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
		F2：GCTCTGAATATCTCATGGCT
		R2：ATCGCCGACGGATCCAAGTG
	390	F1-1：GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT			2
		R1-1：TATGCTTAAGTCCAGGGAG
		F2-1：AGGGATGAAGAGCTTCGGCTG
		R2-1：AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
贾弟虫	511	BG-F1：AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC			2,10
		BG-R1：GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
		BG-F2：GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
		BG-R2：CTCGACGAGCTTCGTGTT
	530	GDH-F1：TTCCGTRTYCAGTACAACTC			2,10
		GDH-R1：ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
		GDH-F2：ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
		GDH-R2：GTGGCGCARGGCATGATGCA
	530	TPI-F1：AAATIATGCCTGCTCGTCG			2,10
		TPI-R1：CAAACCTTITCCGCAAACC
		TPI-F2：CCCTTCATCGGIGGTAACTT
		TPI-R2：GTGGCCACCACICCCGTGCC

表 2： Enterocytozoon bieneusi ITS 基因以及 贾第鞭毛虫 BG、GDH 和 TPI 基因的引物序列。

Results

小鼠 隐孢子虫、 囊胚 SSU rRNA 基因、 双胞菌肠细胞动物 ITS 基因和 贾第鞭毛虫 BG 基因 PCR 检测结果
使用两组引物检测所有 95 份小鼠直肠粪便样本的 Enterocytozoon bieneusi 的 ITS 基因，每种方法得到 5 个阳性样本，总共得到 6 个阳性样本。在 图 1 中，泳道 1-6 和 7-12 分别使用每组引物加载来自 2 种不同 PCR 的 PCR 产物。每次 PCR 检测都遗漏了不同的阳性样本。对于 双肠细胞瘤，两次单次PCR检测的阳性率均为5.21%（5/95），低于联合PCR检测的阳性率（6.32%，6/95

Discussion

隐孢子虫、双肠细胞虫、囊胚和贾第鞭毛虫是常见的人畜共患肠道寄生虫;前两种被美国国立卫生研究院 （NIH） 列为 B 类生物病原体，这四种都被世界卫生组织 （WHO） 列为全球 24 种最重要的食源性寄生虫。它们可能会感染人类、动物并污染环境，从而可能导致疾病爆发并严重影响公共卫生安全¹³。目前，传染性寄生虫的鉴定主要依靠技术人员进行的形态学分析，主观性强、速度慢、效率低。因此，迫切需要整合现有检测技术，建立基于PCR-高通量测序技术的高效综合分子检测系统，用于同时检测多源样本中的4种人畜共患肠道寄生虫和其他寄生虫。

近年来，分子生物学技术已成功应用于SARS-CoV-2等公共卫生大流行中传染病病原体的快速鉴定，在疫情控制中发挥了决定性作用。目前，4种肠道寄生虫的分子检测主要集中在18S rRNA基因区，适用于属鉴定和种内、种间鉴定14,15,16。<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂糖	青歌科技	TSJ001
Qiaquick凝胶提取套件	Qiagen	28704	DNA凝胶提取套件
100碱基对加DNA阶梯	TransGen 生物	BM311	DNA阶梯
4S绿色加核酸染色	BBI	A616696-0500	DNA染色
10次以上;TBE缓冲器	太阳生物	T1051	电泳缓冲液
量子比特4.0	热	https://www.thermofisher.com/in/en/home /工业/光谱-元素 -同位素分析/分子光谱/ fluorometers/qubit/models/qubit-4.html？ ef_id=：G：s&;s_kwcid=AL！3652！10！77515 785702067!!!!77516061528018!!380468 453！1240249321530142&cid=bid_pca_ aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid 00000_0se_bng_bt_pur_con	荧光定量仪器
迷你空间1000	塔农	http://en.biotanon.com/PRODUCT/ PRODUCTLIST？ID=3040& 类型=细节	凝集成像仪
快速DNA粪便提取迷你套装	奇根	51604	核酸提取套件
ProFlex 底座	热	https://www.thermofisher.com/ 在/en/home/life-science/pcr/ 热循环器-实时- 仪器/热循环器 /proflex-pcr-system.html	PCR
Dream Taq Green PCR 混合液	热	K1082	PCR扩增