本实验展示了大鼠胫骨皮质横向转运技术，可用于观察和分析肢体缺血过程中的血管再生。
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摘要
摘要
胫骨皮质横向搬移术（TTT）是一种用于促进缺血性下肢血管再生的新兴外科技术。本视频展示了一种可重复的TTT大鼠模型，详细介绍了皮质骨片段的手术制备、搬移操作流程以及术后评估方法。该手术可通过可控地上移和下移骨片段，以刺激血管生成反应。术后第1、7和12天的代表性X线图像，以及安乐死后第19天进行的微血管灌注成像，显示了明显的骨片段移动及TTT术后肢体灌注的改善。
该模型为研究牵引成骨诱导血管生成的分子机制以及评估缺血性疾病潜在治疗策略提供了一个实用且可重复的平台。为构建此模型，我们在Sprague-Dawley大鼠中模拟了临床牵引成骨术（TTT）操作，包括三个主要手术步骤：股浅动脉结扎、皮质骨片段的制备与游离，以及定制外固定器的应用。在12天内，骨片段被逐步前移，随后后移。灌注成像证实，在运输周期完成后，缺血肢体的血管化程度显著增强。总体而言，这一标准化的大鼠模型高度模拟了临床TTT操作，为研究缺血肢体条件下力传导、血管生成及血管再生提供了有价值的实验体系。
引言
下肢缺血性疾病，如动脉硬化闭塞症（ASO）、血栓闭塞性脉管炎（TAO）和糖尿病足（DF），其特征是下肢动脉血流受限1,2。在疾病早期，患者通常表现为间歇性跛行和静息痛。随着病情进展，长期缺血可导致组织坏死、感染，严重时甚至需要截肢1。目前的标准治疗手段——包括药物治疗、血管腔内介入治疗和开放性外科手术——往往疗效有限，尤其是在疾病晚期阶段3。
胫骨皮质横向搬移术（TTT）是一种治疗多种下肢缺血性疾病的创新治疗策略4。该技术源于Ilizarov方法和"张力-应力法则"5,6，通过截骨术在胫骨中创建可移动的皮质骨瓣片段。随后施加持续、缓慢且可控的牵张力，以刺激骨组织、血管及周围软组织的再生。这一再生过程有助于重建微循环，并恢复患肢的氧供平衡。最终，TTT可改善缺血组织的血液灌注并促进功能恢复7。
传统的下肢缺血血管重建技术可恢复小腿大动脉的血流，但在再血管化足部较小动脉或促进受损微血管的修复与再生方面常无效，因而限制了其完全解决缺血的能力8。经皮牵引疗法（TTT）持续对骨骼及周围软组织施加牵张力，从而诱导大量趋化因子和细胞因子的释放9。这些趋化因子可调控干细胞的多种功能，在缺血条件下会大量分泌进入循环系统，主动募集内源性干细胞至损伤部位，从而在无需直接移植干细胞的情况下促进血管修复与再生。由于具备上述优势，TTT已成为治疗下肢缺血的一种有前景的治疗策略，并 increasingly 被用于治疗影响下肢的各种缺血性疾病7,9,10。
尽管兔子和狗常被用于基础的经胸超声心动图（TTT）研究，但针对这些物种缺乏合适的分析工具，限制了机制性研究的开展。相比之下，大鼠TTT模型在保持实用性及较低成本的同时，与现有的分子和成像技术具有更好的兼容性，使其成为机制研究中更易获取且可重复性更高的研究平台。然而，迄今为止，尚无研究系统地描述或评估过在下肢缺血大鼠模型中TTT的有效性。
由于胫骨尺寸较小且皮质较薄，大鼠TTT模型需要精细的显微外科技术，其牵张范围也受皮质厚度的限制。在评估该模型是否适用于特定研究环境时，应考虑这些实际限制因素。
在本研究中，我们通过复制临床胫骨横向搬运装置的核心结构和工作原理，建立了一种大鼠特异性的胫骨横向搬运（TTT）模型。该操作方法基于临床验证过的方案进行优化，以确保在小型动物中实施的可行性和一致性。我们的目标是建立并验证一种标准化且可重复的大鼠TTT模型，适用于研究缺血性肢体疾病中的血管生成和力传导机制。
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方案
所有动物实验均经广西医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准（批准号：2025-E0642）。雄性Sprague-Dawley大鼠（300-350 g）饲养于广西医科大学动物研究中心的标准环境中。大鼠可自由摄取普通饲料和清洁饮用水，并维持12小时人工光照/黑暗循环。动物饲养室温度控制在20-26 °C，相对湿度保持在40%-70%。所有手术器械在使用前均经过彻底灭菌。本研究中所用试剂和材料的详细信息见表1。
通过腹腔注射过量戊巴比妥钠实施安乐死。通过心跳和呼吸的永久性停止、瞳孔散大以及对有害刺激无反应来确认死亡。所有操作均由经过培训的人员进行，以最大程度减少动物痛苦，且安乐死方案已事先经过机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. TTT 外固定器
- 使用一种按比例缩小、定制设计的临床胫骨皮质横向搬运外固定器（TTT-EF），该装置由骨段牵引单元和外固定架组成。
- 通过内置螺纹机构实现两个组件的垂直移动（图1）。
- 在牵引单元和固定架横截面的两侧各钻两个贯穿孔，用于插入克氏针。
- 将克氏针穿过指定孔洞，并使用六角螺钉从侧方固定，以确保稳定性。
- 使用直径0.8 mm的克氏针将TTT-EF的牵引部件连接至骨段。
- 使用直径1.0 mm的克氏针将固定部件锚定于胫骨的近端和远端。
2. 手术步骤
- 对8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠进行TTT手术。通过腹腔注射0.35 mg/kg戊巴比妥钠和0.3 mg/kg水合氯醛对大鼠进行麻醉。
- 通过检测足底回缩反射和角膜反射评估麻醉效果。在整个操作过程中持续监测生命体征和麻醉深度。术前按照《实验动物使用指南》要求，在大鼠眼部涂抹眼用软膏以保护角膜。
- 剃除手术区域毛发，并注射0.5%利多卡因以减轻术后疼痛。
- 使用11号手术刀在右侧腹股沟区域做10 mm皮肤切口。
- 钝性分离筋膜，暴露股浅动脉。
- 使用眼科镊子在股神经与股浅静脉之间分离出动脉，结扎并切断其两端。
- 使用4-0可吸收缝线缝合切口。
- 使用11号手术刀在胫骨内侧上部做15 mm纵向切口。
- 仔细分离皮下组织及深层肌肉，避免损伤骨膜。轻柔解剖软组织，充分暴露胫骨内侧面。
- 使用手术刀在胫骨内侧表面标记骨片区域（8 mm × 4 mm），沿标记边界使用0.6 mm钻头进行密集钻孔，在胫骨内侧上部形成一个骨窗片段（8 mm × 4 mm）。
- 在骨片内植入两根直径0.8 mm带螺纹的克氏针，间距0.5 mm，以便后续牵移。将克氏针连接至TTT-EF装置并固定。
- 在骨片两侧各插入一根1.0 mm克氏针，穿透胫骨后侧皮质。
- 组装并安装TTT-EF装置。
- 使用眼科剪刀沿标记线完成截骨。
- 轻柔抬高骨片以实现垂直移动，避免损伤骨髓组织。
- 用10%聚维酮碘溶液冲洗手术部位，随后用无菌生理盐水冲洗。
- 使用4-0可吸收缝线逐层缝合切口。
- 术后立即皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg），之后每12小时给药一次，持续最多3天，以确保有效镇痛。
3. 术后监测
- 术后密切监测动物，以确保其正常恢复并及早发现潜在并发症。术后前48小时内，每6-8小时检查一次动物，评估其一般活动情况、姿势、理毛行为、食物和水的摄入量以及手术切口状况。
- 从术后第3天起，直至牵张和巩固阶段结束，每天至少进行一次监测。通过确认动物行走正常、体重稳定、食物和水的摄入持续正常，且无伤口渗出、明显肿胀或疼痛相关行为表现，来判断其是否充分恢复。
- 根据机构指南，按需继续给予镇痛治疗。
- 如出现伤口感染（例如红斑、肿胀、脓性分泌物），应根据兽医建议，采取局部伤口护理和全身性抗生素治疗。
- 若外固定器出现松动或移位，应立即在短时麻醉下进行矫正，以维持骨骼对位并对准，确保准确实施牵张。
- 及时评估并处理任何可能的并发症。对于出现严重影响活动能力、进食或伤口愈合的严重并发症的动物，应与兽医人员协商后进行评估和管理。
- 若动物达到预设的人道终点标准，应实施人道安乐死。
4. 骨碎片转运方案
- 使用胫骨皮质横向搬运外固定器（TTT-EF）进行术后骨段搬运。
- 将术后第1天定为潜伏期。
注意：在此期间不得对骨段进行任何操作。 - 从第2天开始进入上行搬运阶段。以每12小时0.5 mm的速度推进骨段，连续进行5天（第2天至第6天）。第7天暂停搬运，以利于稳定。
- 从第8天开始进入下行搬运阶段。
- 以相同的速率（每12小时0.5 mm）回缩骨段，持续5天（第8天至第12天）。确保骨段在第12天结束前回到原始位置。
- 继续进行为期2天的巩固期（第13天至第14天），期间不再进行搬运。
- 在巩固期结束时拆除外固定器。
注意：搬运程序及评估时间安排请参见图2。
5. 评估
注意：使用成像技术评估骨碎片位置和血流恢复情况。
- 在第1、7和12天对下肢进行X射线成像，以监测移位骨段的进展过程及其最终位置。
- 在预定的成像时间点，使用2.0%异氟烷与氧气混合对大鼠进行麻醉。
- 将每只大鼠置于配备加热垫的恒温成像平台上，以防止在操作过程中发生低体温。
- 通过监测呼吸频率和足底反射来评估麻醉深度，确保动物稳定固定。
- 在所有动物中以标准化的方向摆放肢体和外固定装置，以尽量减少X射线采集时的变异性。
- 获取X射线图像，以确认骨段的移位和复位情况。
- 在术后第19天进行血管灌注成像，以评估下肢的微血管灌注情况。
- 处死大鼠，并通过股动脉灌注对比剂以显示血管结构。
- 将处死的大鼠置于标准仰卧位，以确保成像设置的一致性。
- 在稳定的室温条件下，通过股动脉持续灌注对比剂，使血管系统充分填充。
- 进行血管成像以评估微血管结构和灌注情况。确保所有样本均以一致的肢体方向和固定器对齐方式摆放，以保证各次成像之间的可重复性。
- 利用所得图像评估下肢血流恢复及血管结构重建情况。
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结果
图3 展示了构建经TTT处理的下肢缺血动物模型的操作流程。在我们的实验中，该手术的成功率约为90%。少数失败案例主要归因于技术问题，例如外固定架松动或术中骨片段骨折，导致后续牵张无法进行。该模型通过暴露并结扎股浅动脉以诱导缺血（图3A）。随后，切开皮肤和肌肉暴露胫骨内侧，制备一块4 mm × 8 mm的骨片段（图3B）。在胫骨上标记骨片段的预定位置，随后依据标记进行钻孔和截骨（图3C、D）。完成截骨后，安装固定针和外固定架以稳定骨片段（图3E、F）。为进一步加强固定效果，在骨片段的近端和远端额外置入螺钉（图3G）。最后，使用缝线关闭手术切口（
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讨论
所有涉及麻醉和手术的操作均严格遵循动物安全及机构动物护理指南进行。在切口前，通过足底回缩或角膜反射测试确认麻醉深度，并在手术过程中定期监测。提供充分的保温支持（如使用加热垫）以防止低体温，并在长时间麻醉期间涂抹眼药膏以保护角膜。
麻醉相关的潜在风险包括呼吸抑制、低体温、苏醒延迟和意外过量。因此，必须持续观察，并随时备有复苏设备，包括辅助氧气。
手术风险主要包括出血、软组织损伤、手术区域污染以及对骨髓或神经血管结构的医源性损伤。为尽量降低这些风险，操作者采用严格的无菌技术，轻柔处理组织，并确保精确制作骨窗。一旦出现意外的骨髓穿透、过度的皮质破坏或血流动力学不稳定，将立即予以处理。
所有生物和化学废弃物均按照机构的生物安全和化学安全规定进行处理。被血液、组织或体液污染的材料作为生物危害废弃物收集，并通过经批准的高压灭菌或焚烧系统进行处理。化学试剂（包括麻醉剂和消毒剂）按照化学废弃物处理程序丢弃。所有锐器立即放入经认证的锐器容器中。在整个废弃物处理过程中，均保持适当的记录并遵守...
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披露
作者声明无竞争利益。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型横向牵开器 | Tianjin Xinzhong Medical Equipment Co., Ltd | A61B17/66 | 用于骨碎片牵引 |
| 小型骨科钻 | Yancheng Ruiao Technology Co. LTD | RA-II | 用于胫骨钻孔截骨术 |
| 0.6 mm 不锈钢钻头 | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | 用于胫骨钻孔截骨术 |
| 0.8 mm 螺纹型克氏针 | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | 用于骨瓣和牵开器的固定 |
| 1.0 mm 螺纹型克氏针 | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | 用于牵开器的固定 |
| 戊巴比妥钠 | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | - | 用于动物麻醉 |
| 内六角扳手 | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | 用于固定螺钉 |
| 布托啡诺 | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | 用于动物镇痛 | |
| MICROFIL | Flow Tech,Inc Co., Ltd | 用于动物血管造影 | |
| 异氟烷 | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | 用于诱导和维持吸入麻醉 | |
| 盐酸利多卡因（0.5%） | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | 用于局部浸润，以减轻术后疼痛，并在手术过程中减少组织刺激 |
参考文献
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