清醒大鼠缺血性卒中模型在七天观察期内伴随神经精神并发症

摘要

提出了一种在清醒大鼠中建立局灶性缺血性脑卒中的新模型。该模型通过向大鼠颈内动脉注射空气栓子实现。通过氯化三苯基四氮唑脑组织染色、功能测试以及生理参数评估，证实了局灶性缺血性脑卒中的形成。

摘要

通过逆行插入颈总动脉的血管导管输注大气空气（100 µL），建立由气体栓塞诱发的大鼠实验性脑卒中转化模型，旨在阐明脑卒中发生发展的特征，并评估新型药物及已知有效药物的神经保护作用。该方案耗时和劳动强度适中，可在清醒动物中观察到神经元快速死亡的动态过程，为评估脑卒中的急性期表现（包括谵妄）以及监测自主神经功能紊乱（如血压、体温和每分通气量的变化）提供了独特机会。 通过 通过输注泵将栓塞剂注入颈外动脉。栓塞后24小时，动物出现典型的行为学、运动功能障碍及组织病理学改变。至实验第7天，神经功能状态出现显著改善，行为学测试结果接近对照组水平。与此同时，缺血病灶区域的炎性细胞浸润由以中性粒细胞为主转变为以巨噬细胞为主。该模型可用于临床前研究，因其能够重现脑卒中后时期的神经精神并发症，以及相应的生理、功能和组织病理学变化。

引言

本研究的目的是建立一种清醒大鼠局灶性脑缺血性卒中的模型，并使该模型尽可能接近人类缺血性卒中的临床特征。Söyland 等人的研究表明，62.6% 的患者在清醒状态下表现出明显的缺血性卒中症状，而仅有 19% 的患者为醒后卒中¹。因此，动物在脑动脉栓塞过程中处于清醒状态的情况具有极高的研究价值。用于研究局灶性脑缺血性卒中的经典模型包括：经颅闭塞、血管内线栓法大脑中动脉闭塞（MCAO）、栓塞性闭塞、内皮素-1 诱导闭塞以及光化学血栓形成模型²。传统的建模方法通常需要对动物使用麻醉剂，这可能导致缺血性卒中模型的终点指标发生扭曲。异氟烷作为最常用的气体麻醉方法，被广泛应用于闭塞手术中^3,4,5。然而，研究发现，在大脑中动脉闭塞（MCAO）后 24 小时，脑功能损害的程度与动物接受异氟烷麻醉的持续时间呈负相关。已有研究表明，异氟烷会影响超过 1,000 个与缺血相关的差异表达基因的表达⁶，这一因素可能导致所建立的缺血性卒中模型可靠性不足。

在大鼠中建立缺血性脑卒中模型的一种方法是将血凝块注入颈内动脉⁷。然而，该模型在导管插入术后1小时使用异氟烷进行麻醉，随后才诱导缺血性脑卒中。这种预处理可能干扰了血栓给药后神经和生理后果的正常发展。

提出了一种在清醒大鼠中通过颈内动脉栓塞建立缺血性脑卒中模型的替代方法，随后在大脑中动脉供血区产生局灶性脑损伤。在建立缺血性脑卒中模型前24小时进行导管插入术，以确保栓子给药的效果不受麻醉的影响。

提出的模型未使用内皮素-1⁸，纤丝⁹或可凝固色素¹⁰ 用于缺血。选择给予大鼠的药物 通过 导管的使用基于这一前提：该方法是可行的，从而避免了将动物固定在立体定位仪框架中并对其进行麻醉的必要性^8,10.

此外，该模型能够在栓塞后立即观察动物的生理和神经学参数，而其他缺血性卒中建模方法则似乎无法实现这一点。在文献中，缺血性卒中建模后脑损伤和神经功能缺损的终点指标通常在阻塞后24小时进行评估^11,12,13,14。

在缺血性脑卒中建模中使用清醒大鼠，有可能作为现有局灶性缺血性脑卒中经典模型的补充或替代方法。该方法有助于更广泛地研究已上市或正在研发的药物制剂在治疗缺血性脑卒中方面的神经保护潜力。

方案

本研究严格按照实验室标准操作程序进行，并已获得俄罗斯科学院生物有机化学研究所谢米亚金-奥夫钦尼科夫研究所分支机构机构动物护理和使用委员会生物伦理委员会的批准（方案编号：1016/25，日期：2025年1月17日）。本研究共使用28只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄为10至12周，平均体重为301 g，微生物学状态为无特定病原体（SPF）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 动物准备

1. 使用28只雄性SD大鼠，10-12周龄，SPF级。其中12只用于假手术组，16只用于建立伴有脑动脉气体栓塞（CAE）的缺血性脑卒中模型。
2. 将所有器械在消毒液（0.5% 葡萄糖酸氯己定溶于70%乙醇）中浸泡消毒24小时。
3. 通过肌肉注射给予替来他明15 mg/kg与唑拉西泮15 mg/kg联合盐酸赛拉嗪10 mg/kg进行麻醉（遵循机构批准的实验方案）。
4. 确认动物已达到外科麻醉阶段：轻触动物眼角，夹捏尾尖。
   注：当上述操作后无任何反射反应时，判定动物已进入麻醉状态。
5. 去除颈部腹侧手术区域的毛发。
6. 使用软质止血带将动物四肢及上门齿固定于手术台上。
7. 将外径0.8 mm的聚乙烯管剪成10 cm长的管段，然后将管端套在金属管上，浸入热水（90 °C）中，在管端绕制一个宽约5 mm的稳定螺旋结构。用肝素（50 ME）充满管道，并用一段鱼线制成的塞子封闭螺旋的另一端。
   注：导管由医用级聚乙烯管制成。操作时应避免导管扭曲或受压。

2. 颈动脉插管

1. 在动物颈部腹侧做一个约5 mm长的切口。
2. 使用镊子解剖颈部肌肉，暴露颈总动脉分叉为颈外动脉和颈内动脉的区域。
3. 找到沿气管走行的动脉，用镊子小心地将其从结缔组织鞘中分离出来，注意不要触碰伴随动脉走行的迷走神经。
4. 使用镊子分离出一段颈外动脉。
5. 在颈总动脉分叉处远端3-5 mm位置放置一根临时结扎线。
6. 在颈外动脉上放置两根结扎线，一根紧邻分叉处，另一根位于分叉远端4 mm处。
   注意：导管插入将在两根结扎线之间进行。紧邻分叉处的结扎线将用于固定导管在血管内的位置。
7. 在颈内动脉上，于颈总动脉分叉处近端放置一根临时结扎线。
8. 在翼腭动脉上，于分叉后放置一根结扎线。
   注意：在执行步骤2.7和2.8结扎时，由于颈总动脉主干后方可能存在隐藏的侧支循环，可能会发生出血。此时应将这些侧支血管一并结扎。
9. 使用剪刀在颈外动脉的两根结扎线之间做一切口。将已准备好的导管（步骤1.7）插入血管切口，并沿血管向颈总动脉方向引导。
10. 松开远端结扎线，继续推进导管进入血管，直至其进入颈总动脉。小心地在颈外动脉留有导管的节段上打两根结扎线。在导管前方再放置第三根结扎线并扎紧。
    1. 用结扎线将导管固定在缓冲环上。随后移除颈总动脉及颈外动脉上的其余结扎线。
       注意：推进导管过程中，可能有血液从血管中渗出。
11. 若发现血管有血液渗出，应在血管切口与第三根结扎线之间再加结扎一根备用结扎线。
12. 使用带槽针引导器将已固定的导管引至肩胛部。
13. 使用4.0缝合线对腹侧切口进行缝合，采用连续缝合方式。
14. 在背侧皮肤切口处，使用4.0缝合线在导管周围紧密缝合，采用连续缝合方式。将一段胶布贴附于导管外部，并将其绑扎固定在缝线上，以增强固定效果。
15. 以5 mg/kg剂量肌肉注射抗生素环丙沙星。

3. CAE 组动物局灶性脑缺血模型的建立

1. 大鼠插管后24小时，将动物置于清醒状态，并放入实验动物固定器中，以便能够接触到位于肩胛部的插管。
2. 将装有0.5 mL生理盐水（0.9% NaCl）并带有30 G针头的注射器放入输液泵中。
3. 将注射器针头连接至一段空的聚乙烯导管（容量100 µL），再通过接头将聚乙烯导管的另一端与植入式导管相连。
   注意：当植入导管中的肝素转移至含有空气的导管中并导致空气轻微压缩时，即可证明导管植入正确且无血栓形成。其原因为大鼠血压高于连接导管内空气的压力。
4. 将输液泵的注射速率设为10 µL/min，注射体积设为120 µL。
5. 启动输液泵，从聚乙烯导管中注入100 µL空气和20 µL生理盐水（0.9% NaCl）。
   注意：注射过程持续10分钟。在此期间观察动物行为。注射过程中，动物可能出现发声、啃咬或抓挠固定器等行为。
6. 将动物从固定器中取出。
7. 立即采用0-5分制评估动物的神经功能状态：0分 = 无神经功能缺损，1分 = 前肢无法完全伸直，2分 = 身体旋转，3分 = 肢体支撑力丧失，4分 = 无自主行走且意识水平下降，5分 = 死亡。
   注意：更详细的描述请参见文献¹⁵。在注入空气后，动物可能不会立即表现出神经功能障碍，这表明由于动物的解剖结构特征或血压升高，未发生血管闭塞。
8. 若动物未出现神经症状，则将其排除在实验之外。
   注意：发生脑动脉空气栓塞（CAE）的大鼠在神经功能缺损评分中通常得分为1-4分，最常见表现为肢体支撑力丧失，或无自主行走伴意识水平下降。
9. 以5 mg/kg剂量经肌肉注射给予抗生素环丙沙星。

4. 生理参数的评估

1. CAE 后 1 小时，使用 0-5 分制评估动物的神经功能状况：0 = 无神经功能缺损，1 = 前肢无法完全伸直，2 = 旋转，3 = 肢体支撑力丧失，4 = 无自主行走且意识水平下降，5 = 死亡¹⁵。
   注意：1 小时后，动物可能未表现出任何症状，这是由于气泡被迅速吸收，提示动脉栓塞不充分。
2. 若动物在 CAE 后 1 小时无神经功能症状（神经功能缺损评分 0 分¹⁵），则将其排除出实验。
3. 在 CAE 后 24 小时和 48 小时，以 5 mg/kg 剂量肌内注射抗生素环丙沙星。
4. 将假手术组和 CAE 组的动物随机分组，用于生理参数的评估。
5. 在 CAE 前立即称量动物体重，并在 CAE 后 3 小时、24 小时、4 天和 7 天，使用精度为克的 Sartorius 天平进行称重。
6. 在 CAE 前立即测量大鼠的直肠体温，并在 CAE 后 3 小时、24 小时、4 天和 7 天，使用测温范围为 32 °C 至 42 °C 的数字体温计进行测量。
7. 使用尾套法在计算机化系统上无创测量 CAE 前即刻以及 CAE 后 3 小时、24 小时、4 天和 7 天的收缩压和心率，以记录血压和呼吸参数。
   1. 打开加热垫并将其加热至 40 °C。
   2. 将动物放入动物固定器中，并置于加热垫上，使其安静适应 3-5 分钟。
   3. 然后将用于测量心血管参数的带传感器袖带放置于动物尾部，距离尾根部 2-3 cm 处。
   4. 调整换能器位置，使其正对尾腹侧动脉。
   5. 确保信号稳定且程序中显示心率，开始记录信号。
   6. 启动袖带加压。
   7. 持续记录脉搏和收缩压，直至袖带压力完全释放。
   8. 确保动物心率信号的恢复过程在记录中清晰可见。
   9. 重复步骤 4.4.3–4.4.5 两次，然后将动物从固定器中释放。
   10. 根据三次测量结果计算平均脉搏和收缩压。
8. 使用计算机化系统在 CAE 前即刻以及 CAE 后 3 小时、24 小时、4 天和 7 天测量呼吸频率和呼吸容积，以记录血压和呼吸参数。
   1. 用手将动物以自然体位固定。
   2. 将连接导管的面罩置于动物鼻部。
      注意：动物需要一定时间适应通过面罩呼吸。
   3. 确保动物已安静下来。
   4. 记录 10 秒内的呼吸容积和呼吸频率。
   5. 确保记录期间动物未出现叹气或吞咽动作。
   6. 重复步骤 4.5.2–4.5.3 两次。
   7. 根据三次测量结果计算平均呼吸容积和呼吸频率。
   8. 使用以下公式计算每分钟通气量：
      每分钟通气量 = 呼吸频率 × 呼吸容积。

5. 功能与行为学参数的评估

1. 使用0-5分制评估动物的神经功能状况：0分 = 无神经功能缺损，1分 = 前肢无法完全伸直，2分 = 身体旋转，3分 = 肢体支撑力丧失，4分 = 无自主行走且意识水平下降，5分 = 死亡¹⁵。
2. 在CAE前即刻以及CAE后3小时、24小时、4天和7天，使用转棒仪（Rota-Rod）评估运动功能和协调性。
   1. 对动物进行转棒仪测试前的训练。
      1. 将动物置于静止的转棒上持续5-30秒。
      2. 对于能够在静止棒上抓握至少10秒的动物，让其在低速缓慢加速的旋转棒上运行约30秒。
      3. 持续训练动物，直至其能够在适当加速度下自由站立于旋转棒上。
   2. 将动物置于直径为7 cm的水平旋转棒上，起始转速不低于1 rpm。
   3. 每10秒增加1 rpm的转速，直至最高转速60 rpm。
   4. 记录大鼠在旋转棒上停留的时间。
3. 在CAE前即刻以及CAE后3小时、24小时、4天和7天，使用计算机化系统评估大鼠的自主活动能力。
   1. 将动物置于开放场地中央，记录5分钟内其移动的总距离及活动时间。
4. 在CAE后3小时、24小时、4天和7天，使用握力计（Grip Strength Meter）评估前肢握力。
   1. 用手握住动物的尾巴，使其前肢抓住握力计的横杆。
   2. 沿与格栅平行的方向向外牵拉，直至大鼠松开格栅。
   3. 进行三次尝试，取其中最大值作为最终结果。

S100 钙结合蛋白 B（S100b）水平的评估

1. 在建立CAE模型前、CAE后24小时及7天，分别测定大鼠血清S100b水平。
   1. 将动物放入实验动物固定器中。
   2. 打开加热垫，并将其加热至40 °C。
   3. 将动物置于加热垫上的实验动物固定器中，静置5分钟，使其适应并安静下来。
   4. 将动物侧卧放置。
      注：尾部的尾静脉应清晰可见。
   5. 将静脉导管插入尾静脉。
   6. 用1.5 mL离心管采集1 mL血液。
   7. 将血液在室温下静置40分钟。
   8. 在4 °C条件下，以1500 × g 离心15分钟。
   9. 用自动移液器将血清转移至另一支1.5 mL离心管中。
      注：血清应清澈透明，不得混有红细胞。
   10. 使用相应的ELISA试剂盒，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析血清样本。

7. 导管移除

1. 在CAE术后24小时且完成步骤5中的测试后，进行导管拔除操作。
   1. 将动物置于连接有气体麻醉系统和氧气浓缩器的吸入室中，通入异氟烷（体积分数为2.5%-3.5%），氧气流速为3 L/min，持续1-2分钟。
   2. 将动物转移至加热垫（37.5 °C）上，通过面罩供气，采用异氟烷2%-3%的给药模式，氧流量为1.0-2.0 L/min。
   3. 剪除标记物，注意不要剪到伤口缝线或损伤导管。
   4. 清洁导管外端，并用消毒液（0.5%乙醇氯己定溶液）处理。
   5. 从颈部腹侧拆除前次手术的缝线。通过切口使用镊子轻柔分离导管螺旋部分。
   6. 从腹侧切口将导管的长端拉出。
   7. 在颈外动脉分叉处与导管插入部位之间，预先打一个未收紧的结扎线结。
   8. 小心剪开固定导管的结扎线，用镊子将导管拔出，随后收紧血管上的结扎线并重新打结固定。
   9. 修剪结扎线残端并缝合伤口，采用连续缝合法。

8. 氯化三苯基四氮唑染色的评估

1. 在闭塞后24小时，对假手术组6只动物和CAE组6只动物，以及在CAE后第7天对假手术组6只动物和CAE组10只动物，通过肌肉注射给予替来他明15 mg/kg和唑拉西泮15 mg/kg + 盐酸赛拉嗪10 mg/kg，实施终末麻醉。
2. 按照步骤1.3所述，确认已达到外科麻醉阶段。
3. 使用2 mL注射器和24 G针头，从后腔静脉进行全血采样。
4. 打开颅骨背侧骨板，注意不损伤脑组织。
5. 检查硬脑膜。
6. 使用切片刀将脑组织从额叶开始切成2 mm厚的冠状切片。
7. 将切片放置在显微镜载玻片上。
8. 将切片放入1%氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液中，并置于37 °C恒温箱中孵育10–12分钟。
9. 检查所有脑切片，观察TTC染色的颜色变化。
   注：未受损组织染成鲜粉色，而受损组织染成淡粉色。
10. 对切片两面进行拍照。
11. 将切片固定于10%中性缓冲福尔马林溶液中。
12. 使用科学图像分析软件估算局灶性病变区域的面积。

9. 苏木精-伊红染色评估

1. 将固定的脑切片置于梯度乙醇（70%、80%、100%）中进行脱水处理。
2. 将脱水后的切片浸入石蜡并切成7 mm厚的切片。
3. 使用苏木精和伊红对切片进行染色。
4. 利用透射光显微镜对切片进行显微分析。

10. 统计分析

1. 在统计软件中进行统计分析。
2. 应用描述性统计方法（计算均值 ± 均值标准误），并绘制图表以直观展示结果。
3. 在检验各组数据正态性后，采用邓肯（Duncan）秩次检验法进行多重比较。
4. 在5%显著性水平上判定差异的显著性。

结果

存活率与总体状况
在注射气泡后，所有大鼠立即出现短暂的异常状态，并伴有明显的震颤，持续数秒，随后所有运动活动停止，并丧失意识，持续1-2分钟。部分动物在恢复意识后，仍有10-15分钟的四肢支撑力丧失。

动物在CAE后3小时的存活率为100%，24小时后存活率下降至80%，第3天^rd 当天为60%。在栓塞后对动物进行长达7天的随访期间，未观察到新的死亡情况。图1A).

体重
导管插入术导致所有动物的体重均下降，无一例外。因此，在研究的第2天，所有组别的动物均出现负体重增长（图1C）。这归因于动物在导管插入期间处于全身麻醉状态，麻醉本身对体重下降具有相同的影响。脑缺血的模拟引起了体重的显著变化。中风动物在24小时内体重减少了9.2%。在CAE术后第7^天，动物的体重增长为负值，达10.8%，且中风...

讨论

MCAO 是一种在大鼠中建立局灶性缺血性脑卒中的常用方法，通过血栓形成、大脑中动脉局部痉挛以及使用栓线进行暂时性阻塞来实现²。此类模型的目的包括：(1) 实现神经脑组织的局灶性凋亡¹⁶，并具有标准化的病灶体积和范围¹⁷；(2) 对动物的神经功能缺损进行 2 至 7 天的监测¹⁸。

空气给药的速率和体积是通过经验确定的。先前的一项研究已探讨过空气给药速率和体积的选择¹⁹。在初步实验中，以每30秒100 µL的速度给予总量为3 mL/kg的空气推注。然而，该给药方式导致动物在观察初期数小时内死亡。逐步降低空气给药的总体积和给药速率可减少致死率；但这些条件未能满足实验性脑卒中模型的要求。因此采用自动输注泵，以精确控制向颈内动脉注入100 µL空气。实验结果表明，当空气给药速率超过10 µL/min时，会引起显著的脑卒中，累及双侧大脑半球。这一现象可能归...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带有2 mL针头的三组分注射器	LEIKO	523222	23G
Aladdin 单通道输液泵	World Precision Instruments	AL-1000
环丙沙星	Pharmavet	3897744	5% 环丙沙星溶液
计算机化系统 PowerLab 8/35	ADInstruments	3508-1090
德津	Apteka.ru		70% 乙醇中的 0.5% 氯己定双葡糖酸盐
数字温度计	B.Well Swiss AG	LOT 0413
电子测力计 握力计	BioMed Easy Technologies	007231024415MC01
S100钙结合蛋白B（S100B）ELISA试剂盒	CLOUD-CLONE CORP.（CCC）	SEA567Ra	48T
钓鱼线			直径 0.9 mm
气体麻醉系统	UGO BASILE	21100
GraphPad 统计软件	Prism		v.10
带槽针导向器	Fisher Scientific	目录编号 11-00	12.7 cm
肝素	莫斯科内分泌药厂 Endopharm	30122
ImageJ	美国国立卫生研究院与中国台湾光学与计算仪器实验室
胰岛素注射器	SFM 医院产品	160303	0.5 mL，U-100，30G
静脉导管	KD Medical		G24
异氟烷（Isoflurin）	Vetpharma		100 mL，1000 mg/kg
实验室动物固定器	开放科学	AE1001-R1
光学显微镜	ZEISS		Axio Scope.A1
光学显微镜载玻片	赛默飞世尔科技	15442933
医用级聚乙烯微管	Scientific Commodities 公司	BB31695-PE/4	内径 0.76 mm
医用无菌纱布擦拭巾	新生		45x29 厘米
微量离心管	SARSEDT AG & Co. KG	S044378	1.5 mL
微量移液器 Eppendorf research plus	Eppendorf		200 µL
显微镜载玻片	Fisher Scientific	11562203
显微外科镊（弯型）	喀山医疗器械厂	F0106
显微外科镊（直型）	RWD生命科学	F11029-11
切片机刀片	赛默飞世尔科技	3052835	MX35 Premier+
多条件控制系统	TSE Systems	131202-10
中性缓冲甲醛	血红素	1072024	pH 6.8–7.2
不可吸收外科缝合线Lavsan	Lintex	2022-01
用于虹膜切除术的眼科剪刀	CM 仪器	AJ-410-05
氧气浓缩器	武装	YYT32700960	7F-3L
磷酸盐缓冲液	AMRESCO	2120C462
移液器吸头	Servicebio		200 µL
大鼠	来自实验动物繁育室 “普希诺” （www.spf-animals.ru），俄罗斯科学院谢米亚金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所
冷藏型多功能离心机	Eppendorf	5804 R
Rota-Rod Rotamex-5	COLUMBUS INSTRUMENTS	210426
梅茨鲍姆剪刀	Medstandart-Instrument	MT-H-256
外科缝合材料	REPROMED	114/0042011124	Kaproag 4/0
手术台	VetKormTorg	VETBOT STL-1，TD00472
Telazol	硕腾	672913	50 mg/mL 替来他明和 50 mg/mL 唑拉西泮，5 mL
氯化三苯基四氮唑	Dia-M	TTC1809
赛拉嗪	NITA-FARM	151	2% 盐酸赛拉嗪 50mL