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方法文章

一种用于分别分析脉络丛上皮和内皮的高级人源血液-脑脊液屏障共培养模型

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DOI：

10.3791/69275

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2025年11月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

本文内容

摘要

建立了一种人源脉络丛上皮细胞与内皮细胞的共培养体系，以构建一种先进的 体外 血脑脊液屏障模型。我们描述了在特定条件下分别分离上皮细胞和内皮细胞，以进行后续RNA提取和转录分析的方法。

摘要

血供丰富的脉络丛（CP）位于脑室系统内，由多种结构成分组成，包括立方上皮和有孔内皮，是血-脑脊液屏障（BCSFB）的所在部位。为研究脉络丛 体外，可采用多种不同的细胞培养体系。本实验室建立并广泛使用一种基于人脑脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）上皮细胞的、具有强屏障功能的倒置式细胞培养滤膜模型。近期，我们成功构建了一株稳定永生化的人脑脉络丛内皮细胞系（iHCPEnC）。通过联合使用这两种细胞系，我们构建了一种功能更完善的双细胞类型模型，其屏障功能较单独使用HIBCPP细胞时显著增强。由于该模型同时包含脑脉络丛上皮和内皮结构，可在特定条件（如感染、炎症等）下用于研究两类细胞间的相互作用。在本实验方案中，我们描述了构建该双细胞类型模型的方法，并在后续进行转录水平分析时对上皮细胞与内皮细胞进行分离的技术流程。我们提供了特异性针对上皮和内皮细胞的PCR引物序列，可用于检测两类细胞之间可能发生的交叉污染。为探讨在炎症条件下脑脉络丛内皮细胞对该模型中上皮细胞功能的潜在影响，我们分析了脂多糖（LPS）处理后HIBCPP细胞组分中特定基因的表达水平。该优化的脑脉络丛 体外 该模型以及能够分别分析上皮和内皮反应的特点，对于涉及脉络丛生物学和病理学功能的细胞过程研究具有重要意义。

引言

脉络丛（choroid plexus, CP）是位于脑室四个脑室中的一组高度血管化的多种细胞群体。除其他功能外，它还在中枢神经系统（CNS）与血液之间充当一种生理屏障，即所谓的血液-脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB），防止血液中循环的感染性物质等进入脑组织。脉络丛由多种细胞类型组成，包括极化的上皮细胞，这些上皮细胞具有紧密连接、黏附连接以及桥粒结构，并附着于基底膜上。上皮细胞的腔面分布有微绒毛，从而扩大了其表面积。基底膜下方分布着有孔毛细血管内皮细胞，周围被成纤维细胞和免疫细胞等结缔组织所包绕1,2,3。最近有研究报道，脉络丛内皮细胞能够与上皮细胞协同增强BCSFB的完整性，因此可能在炎症过程中发挥脑保护作用4,5。

迄今为止，人脑脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）上皮细胞的倒置培养是最常用的方法 体外 用于模拟具有高跨上皮电阻（TEER）值和强屏障功能的人体血-脑脊液屏障（BCSFB）的模型。为了更深入地理解细胞功能，同时减少动物实验，重要的是从中获取尽可能多的信息 体外 尽可能多地进行实验。我们实验室最近建立了首个稳定且永生化的人类脉络丛内皮细胞系（iHCPEnC）。6,7借助HIBCPP细胞和iHCPEnC，我们能够建立一种共培养体系。 体外 更高级地模拟血脑脊液屏障的模型8利用这种双细胞模型，我们能够证明与单独培养HIBCPP细胞相比，HIBCPP细胞与iHCPEnC共培养可导致TEER值升高。需要注意的是，iHCPEnC单独培养时不会形成TEER7,8分别制备并后续分析该模型中使用的两种细胞类型，将使我们能够研究它们在健康与疾病状态下的相互作用。

在此，我们描述了实现这一目标的两种不同方法。两种方法的基础均在于采用HIBCPP细胞的倒置细胞培养模型（图1）。方法1为"直接共培养"法，即将两种细胞共同培养于同一滤膜插件上。HIBCPP细胞先以倒置方式培养，随后以常规方式接种iHCPEnC细胞7,8。方法2为"膜置插件内"培养法，即在此方法中加入一片与滤膜插件所用材料性质相同的独立膜。将该附加膜置于已进行倒置培养并生长有HIBCPP细胞的滤膜插件中，再以常规培养方式将iHCPEnC细胞接种至该附加膜上。

随后对细胞进行分离以进行RNA分析，可深入了解脉络丛上皮和内皮在特定条件下的转录反应。我们描述了针对HIBCPP细胞和iHCPEnC的特异性PCR引物，可用于验证两种细胞类型成功且纯净的分离。在脂多糖（LPS）处理后，我们利用所述模型研究炎症条件下脉络丛上皮在内皮存在时的独特反应。

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方案

1. HIBCPP 细胞

注意：以下描述了HIBCPP细胞的培养与维持，以及带有HIBCPP细胞的倒置细胞培养滤膜插件的制备方法。本方案适用于在12孔细胞培养滤膜插件上培养HIBCPP细胞。此前已发表过在24孔细胞培养滤膜插件上培养HIBCPP细胞的详细方案及配套视频9。

  1. 培养 HIBCPP 细胞
    1. 在室温（RT）下解冻一管 HIBCPP 细胞。
    2. 用 10 mL 含 10% 胎牛血清（FCS）和 5 µg 胰岛素/mL 的预温 DMEM/HAMS-F12 培养基（即 10% HIBCPP 培养基）重悬冻存管中的细胞内容物。
    3. 将重悬的 HIBCPP 细胞转移至 T75 细胞培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。
    4. 细胞接种 24 小时后更换培养基，以去除 DMSO。
    5. 继续培养细胞至 90% 汇合度，此过程约需 2 周时间。每周更换两次培养基。
  2. HIBCPP 细胞的连续传代培养
    注意：进行连续培养时，将 HIBCPP 细胞按 1:3 比例传代至新的 T75 培养瓶中。
    1. 从 T75 培养瓶中移除旧培养基。
    2. 用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
    3. 移除 PBS。
    4. 加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液使 HIBCPP 细胞脱落。该步骤在 37 °C 下进行约 10–20 分钟。期间轻轻摇动培养瓶，确保胰蛋白酶-EDTA 完全覆盖细胞层。 
    5. 加入 7 mL HIBCPP 培养基，于室温下以 50 × g 离心 10 分钟。
    6. 将细胞沉淀重悬于 30 mL 10% HIBCPP 培养基中，并分种至 3 个新的 T75 培养瓶中。
    7. 培养细胞至 90% 汇合度；细胞通常约 1 周即可达到汇合。
    8. 每周更换两次培养基。
      注意：HIBCPP 细胞无生长抑制特性，因此培养瓶会完全汇合，细胞将继续生长并形成多层结构。
  3. 在倒置培养系统中接种 HIBCPP 细胞
    1. 从 T75 培养瓶中移除培养基。
    2. 用 10 mL PBS 洗涤细胞一次。
    3. 移除 PBS。
    4. 加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液使 HIBCPP 细胞脱落。该步骤在 37 °C 下进行约 10–20 分钟。期间轻轻摇动培养瓶，确保胰蛋白酶-EDTA 完全覆盖细胞层。
    5. 同时准备滤膜插件。用镊子将 12 孔滤膜插件倒置放入 6 孔细胞培养板中，并加入预温的 10% HIBCPP 培养基。在每个滤膜插件表面滴加一滴培养基以预湿膜表面。
    6. 用 17 mL 10% HIBCPP 培养基重悬胰蛋白酶消化后的细胞。
    7. 于室温下以 50 × g 离心 10 分钟，并将 HIBCPP 细胞调整至浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
      注意：HIBCPP 细胞易形成小的细胞团块。接种至滤膜插件前无需完全分散这些团块，但应确保 90% 的细胞为单细胞状态。
    8. 以倒置方式将 HIBCPP 细胞接种至 12 孔滤膜插件上，接种密度为每插件 4 × 105 个细胞。
    9. 等待细胞悬液被滤膜完全吸收后，盖上 6 孔板盖子。
    10. 将装有倒置滤膜插件的培养板放入培养箱中。
    11. 接种 24 小时后，用镊子将滤膜插件翻转至正常方向，并转移至新的 12 孔细胞培养板中。在下室加入 2 mL 10% HIBCPP 培养基，在上室加入 1 mL 培养基。
    12. 继续培养 5 至 6 天不更换培养基，随后开始进行跨上皮电阻（TEER）测定及共培养体系的建立。

2. 跨上皮电阻（TEER）的测定

注意：TEER 值的测定需借助 MilliCell ERS2 和手持式电极完成。计算时需要使用不含细胞的细胞培养滤膜插件在培养基中的空白电阻值（Ohmblank）。

  1. 将筷子式电极干燥保存。在开始测量前，将电极放入80%乙醇中浸泡10分钟以进行消毒。
  2. 随后用PBS冲洗电极。
  3. 开始测量：将电极的长端插入培养板孔中，短端插入含有接种细胞的滤膜插件中。
  4. 记录12孔细胞培养滤膜插件的电阻值（Ohmsample）。
  5. 按以下公式计算TEER值：Ohm·cm2 = (Ohmsample - Ohmblank) × 1.1 cm2。
  6. 测量结束后，用80%乙醇冲洗电极，然后干燥保存。
    注意：在不同实验条件之间或不同细胞系的测量之间，必须对筷子式电极进行消毒，并用PBS冲洗，以防止交叉污染。

3. iHCPEnC

  1. 接种 iHCPEnC 细胞进行培养
    1. 在室温下解冻一管 iHCPEnC 细胞。
    2. 用预热的 5 mL 完全经典内皮细胞培养基（iHCPEnC 培养基）重悬管内细胞内容物。
    3. 在室温下以 500 g 离心 5 分钟。
    4. 在此期间，用 2 mL 附着因子对 T25 细胞培养瓶进行包被，约 1 分钟。吸除附着因子后，将培养瓶留置备用，直至接种 iHCPEnC 细胞。
    5. 用 5 mL iHCPEnC 培养基重悬细胞沉淀，并将其转移至已准备好的 T25 细胞培养瓶中。
    6. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养 1 周，期间不更换培养基。
  2. iHCPEnC 的连续培养
    ​注意：进行连续培养时，将 iHCPEnC 按 1:4 比例传代至新的 T25 细胞培养瓶中。
    1. 移除 iHCPEnC 培养基，并用 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。操作时注意避免细胞脱落。
    2. 吸除 PBS。
    3. 使用 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 消化汇合的 iHCPEnC 细胞。此步骤在室温下约需 3–5 分钟。
    4. 用 5 mL iHCPEnC 培养基重悬细胞。
    5. 在室温下以 500 g 离心 5 分钟。
    6. 在此期间，每瓶使用 2 mL 附着因子对 4 个新的 T25 培养瓶进行包被。
    7. 用 20 mL iHCPEnC 培养基重悬细胞沉淀。
    8. 将 5 mL 细胞悬液分别接种至 4 个已准备好的培养瓶中。
    9. 再次于 1 周内不更换培养基进行培养。细胞将在 1 周内达到汇合状态。
      注意：iHCPEnC 细胞具有生长抑制特性；因此，培养瓶中的细胞将形成汇合单层，而多余的细胞会悬浮于培养基中。

4. 共培养实验的准备工作

  1. 方法1：对于 "直接共培养" （培养上皮细胞 且不要准备任何额外物品（包括同一插入物两侧的内皮细胞）。
  2. 方法2：对于 "膜插入" 方法，执行以下步骤：
    1. 使用11号打孔器（直径11 mm）从一张独立的A4尺寸膜上切下12孔细胞培养滤插膜大小的膜片。
    2. 将打孔的膜放入培养皿中。
    3. 使用紫外线（UV-C，254 nm）对打孔的膜进行60分钟的灭菌。
      注意：可预先制备打孔并灭菌的12孔细胞培养滤插膜，并在无菌条件下保存。

5. 建立共培养体系

注意：在此阶段，HIBCPP 细胞已准备好用于双细胞类型实验 体外 培养模型。HIBCPP细胞已培养5至6天（参见步骤1.3.8–1.3.12）。HIBCPP细胞应开始形成TEER（约20 Ohm·cm²）2).

  1. 对于方法1（"直接共培养"）和方法2（"膜插入式"），将10% HIBCPP培养基更换为1% HIBCPP培养基。为此，向12孔细胞培养板的每个孔中加入2 mL的1% HIBCPP培养基。
  2. 使用移液器和镊子将倒置培养的含滤膜插件取出，并将其以标准方向放入已准备好的12孔板中。
  3. 对于方法2（"膜插入式"），按如下步骤准备滤膜插件：
    1. 用镊子将打孔并灭菌后的膜放入已准备好的12孔滤膜插件中，该插件内含有在倒置培养条件下的HIBCPP细胞。
  4. 将细胞培养板放回培养箱中，以进行iHCPEnC的胰蛋白酶消化（见步骤6所述）。

6. 共培养体系中iHCPEnC的接种与培养

注意：以下部分描述了在12孔细胞培养滤膜插件上建立HIBCPP细胞与iHCPEnC共培养体系的方法。此前已有文献详细描述了在24孔细胞培养滤膜插件上进行HIBCPP细胞与iHCPEnC共培养的实验方案8。在消化iHCPEnC之前，需计算共培养所需的细胞数量。一个汇合的T25细胞培养瓶可提供约5 × 105个细胞。

  1. 移除含有融合生长的 iHCPEnC 的 T25 培养瓶中的培养基。
  2. 用 3 mL PBS 清洗 iHCPEnC，避免细胞脱落。
  3. 移除 PBS。
  4. 加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使融合生长的 iHCPEnC 脱落，室温下操作约需 3–5 分钟。
  5. 用 5 mL iHCPEnC 培养基重悬细胞（每 T25 培养瓶）。
  6. 在血细胞计数板（Neubauer 计数室）中对细胞进行计数。
  7. 室温下以 500 × g 离心 5 分钟。
  8. 用 iHCPEnC 培养基将细胞沉淀重悬，调整终浓度为 1 × 105 个细胞/mL。
  9. 方法一（"直接共培养"）和方法二（"插入式膜结构"）：在 12 孔板的滤膜插入式培养小室中接种 700 µL iHCPEnC 细胞悬液（含 7×105 个细胞）。
  10. 在接种 iHCPEnC 后 24 小时首次检测共培养体系及其对照组（即仅 HIBCPP 细胞或仅 iHCPEnC 细胞的培养）的 TEER 值，之后每日检测一次。

7. LPS 处理

注意：与仅含 HIBCPP 细胞的培养相比，共培养体系应表现出更高的 TEER 值（建议倍数：1.5 或更高）。

  1. 测量并记录用于实验的细胞培养小室的TEER值。
  2. 配制含有5 µg/mL LPS的1% HIBCPP培养基母液。
  3. 准备新的12孔板，每孔加入2 mL 1% HIBCPP培养基。
  4. 借助镊子和移液器将小室中的液体吸除。
  5. 将小室放入预先准备好的孔板中。
  6. 分别向小室中加入1 mL LPS母液或1% HIBCPP培养基（阴性对照）。
  7. 在37 °C条件下孵育4小时。
  8. 在进入第8节操作前，测量并记录TEER值。

8. 从 HIBCPP 细胞和 iHCPEnC 中分别分离 RNA，用于后续转录分析

注意：为了获得两个独立的细胞组分并避免共培养模型中不同培养细胞之间的交叉污染，需分别小心地将细胞从插入式培养器中刮取下来。每个滤膜插入式培养器的RNA提取步骤均需连续进行（插入式培养器不得干燥）。

  1. 用 PBS 清洗滤插膜一次。为此，准备含有 1.5 mL PBS/孔的 12 孔细胞培养板。
  2. 使用移液器和镊子清空细胞培养滤插膜，将滤插膜放入盛有PBS的12孔细胞培养板中。
  3. 向插入物中加入 1 mL PBS。
  4. 为方法1准备iHCPEnC和HIBCPP细胞"直接共培养" ），执行以下步骤：
    1. 移除插入物中的 PBS，并将其放入一个空的干燥 12 孔细胞培养板中。
    2. 借助移液器吸头，用10–20 µL PBS反复吹打，通过刮擦使iHCPEnC从插入物上脱落。
    3. 将该细胞组分转移至含有350 µL RNA裂解缓冲液的1.5 mL离心管中。用移液器反复吹打，使细胞与RNA裂解缓冲液充分混匀。
    4. 完成iHCPEnC组分的收获后，将插入物倒置放入细胞培养板的盖子中。
    5. 将HIBCPP细胞从膜上取下，如同iHCPEnC组分一样，放入预先准备好的含有350 µL RLT-β-巯基乙醇的1.5 mL离心管中。
      注意：若为同一条件准备多个共培养样本，每个插入物和细胞组分需加入 350 µL RNA 裂解缓冲液。同一条件下单个制备的细胞组分应依次在同一个层析柱上进行纯化。
  5. 为方法2准备iHCPEnC和HIBCPP细胞"膜插入"），执行以下步骤：
    1. 用镊子取出多余的膜，放入12孔细胞培养板的干燥盖中。将100 µL RNA裂解缓冲液移取到膜上，以裂解iHCPEnC。
    2. 将100 µL裂解液加入含有250 µL RNA裂解缓冲液的1.5 mL离心管中，充分混匀。
    3. 从滤芯中移除 PBS，将滤芯倒置放入 12 孔细胞培养板的盖子中。向滤芯的膜上加入 100 µL RNA 裂解缓冲液，裂解 HIBCPP 细胞组分。
    4. 将此100 µL裂解液加入含有250 µL RNA裂解缓冲液的1.5 mL离心管中。
  6. 按照制造商的说明书进行RNA提取。
  7. 使用分光光度计测定RNA的含量。
  8. 按照制造商说明对RNA样本进行逆转录和qPCR分析。
    注意：由于共培养体系中iHCPEnC的数量少于HIBCPP细胞，因此需要使用多个12孔板滤膜插入式培养小室，以获得足够量的iHCPEnC RNA，具体数量取决于后续分析需求。不同滤膜插入式培养小室的RNA裂解液需合并。逆转录和qPCR可按先前所述方法进行。6.

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结果

在本实验方案中，我们描述了在细胞培养滤膜插件上逐步构建由上皮细胞（HIBCPP细胞）和内皮细胞（iHCPEnC）组成的人类脉络丛双细胞模型的方法，如图1所示。在该模型系统中，HIBCPP细胞以倒置方式培养于滤膜的下表面，而iHCPEnC则接种于插件滤膜的上表面，或接种于放置在插件膜顶部的第二层滤膜上。

双细胞模型的TEER值
我们最近的研究表明，将HIBCPP细胞与iHCPEnC在细胞培养滤膜插件中进行共培养，可随着时间推移增强屏障功能，该结论通过TEER测量结果确定。这些实验此前使用的是24孔、孔径为0.4 µm的细胞培养滤膜插件6,7,8。在本实验方案所述的两种双细胞共培养体系中，我们进一步在12孔、孔径为3 µm的细胞培养滤膜插件上验证了其对屏障功能的促进作用（

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讨论

人类脉络丛（CP）由多种不同类型的细胞组成，包括形成屏障的上皮细胞以及延伸血管系统的内皮细胞3。尽管脉络丛的内皮细胞具有窗孔结构，但近期研究表明其在脑脊液-血液屏障（BCSFB）的屏障功能中亦发挥重要作用4,7。为了研究脉络丛等器官中内皮细胞与上皮细胞之间复杂的相互作用，需要建立可同时分析这两种细胞类型的先进体外（in vitro）模型2。

此处，我们介绍一种双细胞类型生成方案 体外 由上皮细胞（HIBCPP细胞）和内皮细胞（iHCPEnC）组成的人类脉络丛（CP）模型。在执行本方案时，定期监测培养物的经皮电阻（TEER）值至关重要，这是验证屏障功能的可靠指标。在方案部分，我们已在关键步骤中标明了理想的TEER值，例如建立共培养的时机（步骤5）以及判断培养物是否适合用于实验的时机（步骤7）。需要注意的是，这些TEER值不一定在培养的相同...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies 25200056
12 孔细胞培养板 StarLabCC7682-7512
12 孔滤插件（3 µM 孔径）Greiner Bio One665631
24 孔细胞培养板 StarLabCC7672-7524
24 孔滤插件 （0.4 µM 孔径）Greiner Bio One662641
24 孔滤插件（3 µM 孔径）Greiner Bio One662631
6 孔细胞培养板 StarLabCC7682-7506
AffinityScript cDNA 合成试剂盒（cDNA 合成）Agilent600559
贴壁因子Cell Systems4ZO-500完整经典内皮细胞培养基试剂盒的组成部分。
Brilliant II SYBR Green qPCR 主混合液（实时 PCR）Agilent600828
筷子式电极MilliporeMERSSTX01该产品已停产。
完整经典内皮细胞培养基（iHCPEnC 培养基）Cell Systems4ZO-500试剂盒，包含培养基、补充剂以及用于包被的贴壁因子。
含酚红的 DMEM/F-12（1:1）（10% HIBCPP 培养基）Thermo Fisher31330-038
不含酚红的 DMEM/F-12（1:1）（1% HIBCPP 培养基）Thermo Fisher11039-021
胎牛血清（FCS）（1% 和 10% HIBCPP 培养基）Thermo Fisher10270-106
胰岛素（1% 和 10% HIBCPP 培养基）SigmaI9278
脂多糖（LPS）SigmaL3024
MilliCell ERS2 MilliporeMERS00002该产品已停产。
Nanodrop（分光光度计）Thermo ScientificND1000该产品已停产。
11 号穿孔器Würth880223211
PBSLife Technologies 14190169
引物设计工具NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
引物 SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microQiagen74004
RLT + β-巯基乙醇（Qiagen RNeasy micro 试剂盒组分）Qiagen74004
T25 细胞培养瓶Sarstedt AG &Co KG83,39,10,002
T75 细胞培养瓶Sarstedt AG &Co KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc（独立膜）SabeuSK4580
紫外光Carl RothH469.1

参考文献

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