羟基红花黄色素A（HSYA）通过增强软骨细胞自噬与增殖，同时抑制凋亡和炎症，缓解膝骨关节炎 通过 HIF-1α/BNIP3 通路抑制
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羟基红花黄色素A（HSYA）通过增强软骨细胞自噬与增殖，同时抑制凋亡和炎症，缓解膝骨关节炎 通过 HIF-1α/BNIP3 通路抑制
软骨组织中自噬作用的减弱与膝骨关节炎（KOA）的发生发展密切相关，然而羟基红花黄色素A（HSYA）发挥保护作用的机制尚未完全阐明。本研究分离了人KOA软骨细胞，并将其分为不同处理组，包括正常对照组、空白模型组、HSYA组、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）抑制剂组、自噬诱导剂组、HSYA联合HIF-1α抑制剂组以及HSYA联合自噬诱导剂组。采用ELISA法检测促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平，通过Western blotting检测HIF-1α、BNIP3及自噬相关标志蛋白的表达，利用单丹磺酰尸胺染色和透射电子显微镜评估线粒体中的自噬囊泡。与正常对照组相比，空白模型组中IL-1β、TNF-α、IL-6和HIF-1α水平显著升高，同时细胞凋亡率升高、增殖能力下降，且自噬相关蛋白表达下调（P < 0.05）。使用HSYA、HIF-1α抑制剂或自噬诱导剂处理后，自噬相关蛋白表达显著上调，炎症因子水平降低。此外，HSYA联合HIF-1α抑制剂或自噬诱导剂处理效果最为显著，细胞因子释放和细胞凋亡明显减少，软骨细胞增殖能力增强，线粒体自噬囊泡形成增多（P < 0.05）。这些结果表明，HSYA至少部分通过抑制HIF-1α/BNIP3通路，促进软骨细胞自噬，减轻炎症损伤，从而在KOA中发挥软骨保护作用。
膝骨关节炎（KOA）是一种常见的慢性骨科疾病，影响中老年人群，显著降低其生活质量1,2。尽管该病发病率较高，其确切的病因及病理生理机制仍未完全阐明。此外，无论是预防还是治疗方面，均迫切需要深入揭示该疾病的复杂病理基础。近年来备受关注的一个研究领域是自噬在软骨稳态中的作用，越来越多的证据表明，软骨组织中自噬功能减弱可导致KOA中软骨的退变3,4。
自噬是一种对维持细胞稳态至关重要的细胞降解过程，在软骨的维持与修复中具有重要意义。在关节软骨内普遍存在的缺氧微环境中，缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3（BNIP3）信号通路成为调控自噬的关键途径。已在膝骨关节炎（KOA）患者中观察到HIF-1α表达升高，提示该通路的失调可能导致自噬功能受损，进而引发软骨退变5,6,7。
针灸、艾灸、草药和推拿是治疗膝关节炎的四种经典中医方法。目前的治疗方法，如非甾体抗炎药、透明质酸注射和关节成形术，已被证明有效，但也存在一定的副作用。8此外，目前尚无推荐的膝骨关节炎常规治疗方法。随着时间推移，作为膝骨关节炎（KOA）常见的补充疗法，中医（TCM）已发展出多种具有治疗KOA潜力的草药制剂。9其中，羟基红花黄色素A因其抗炎和调节自噬的特性而受到广泛关注10,11然而，羟基红花黄色素A（HSYA）对膝骨关节炎（KOA）发挥治疗作用的具体机制，尤其是在通过HIF-1α/BNIP3通路调控自噬方面的机制，尚不明确。因此，本研究聚焦于HSYA对软骨细胞自噬的影响及其与HIF-1α/BNIP3通路的相互作用，探讨其在KOA中的治疗机制。我们假设HSYA通过增强软骨细胞自噬与增殖，同时抑制细胞凋亡和炎症反应，从而缓解膝骨关节炎 通过 HIF-1α/BNIP3 通路抑制
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所有涉及人体样本的操作均经湛江市中心人民医院伦理委员会批准（批准文号：KY-YS-2021-09）。在样本采集前，已从所有参与者处获得书面知情同意。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 患者与研究设计
纳入30名被诊断为膝骨关节炎（KOA）并接受全膝关节置换术的患者。队列包括14名男性和16名女性，年龄52-75岁（平均值±标准差：64.3 ± 12.6岁），均符合美国风湿病学会KOA诊断标准12。若患者在手术前2周内使用过非甾体抗炎药或类固醇，或在1个月内接受过关节内注射，则予以排除。
2. 原代软骨细胞培养
手术后立即在无菌条件下采集关节软骨，并置于冷的PBS中。使用无菌手术刀片在冰冷的玻璃板上将软骨切成约1 mm³的碎片，转移至含有10 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA的50 mL离心管中。将离心管置于37 °C、80 rpm的摇动水浴中孵育30分钟，每5分钟轻轻倒置一次以促进消化。吸除上清液，用PBS洗涤组织沉淀一次，于200 × g 离心5分钟。将沉淀重悬于10 mL 0.02% II型胶原酶中，在37 °C条件下振荡消化4小时。每30分钟用移液器吹打悬液数次以促进细胞解离，随后通过70 µm细胞筛过滤，再于200 × g 离心5分钟。将所得沉淀重悬于DMEM培养基中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，接种至T25培养瓶中。细胞在37 °C、5% CO2条件下培养，每2–3天更换一次培养基，实验使用第1–2代细胞。实验分组包括正常对照组、空白模型组、羟基红花黄色素A（HSYA，100 µmol/L）、HIF-1α抑制剂YC-1（10 µmol/L）、雷帕霉素（10 nmol/L）、HSYA + YC-1和HSYA + 雷帕霉素。
3. siRNA 介导的 HIF-1α 和 BNIP3 沉默
将原代软骨细胞以每孔2-5 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 °C培养至细胞融合度达到30%-50%。每个孔中，将5 µL的20 µM siRNA溶于250 µL Opti-MEM中，同时将5 µL脂质转染试剂单独稀释于250 µL Opti-MEM中。将两种溶液轻轻混合后，在室温下孵育15-20分钟以形成复合物。弃去原培养基，每孔加入1.5 mL含10%胎牛血清（FBS）的新鲜DMEM培养基，然后沿孔壁缓慢滴加500 µL siRNA-脂质复合物，并轻轻摇动混匀。细胞继续孵育6小时后，更换为完全培养基，继续培养48-72小时。在进行后续处理前，通过qRT-PCR和Western blot检测基因敲低效率。
4. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
收集细胞培养上清液，必要时在200 × g 条件下离心5分钟，并用检测缓冲液按1:2比例稀释。IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA试剂盒按照制造商提供的说明书使用。标准品、空白孔和样品均设三个重复孔。底物反应后，需在15分钟内使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。
5. MTT 检测
将软骨细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL完全培养基，分别培养0 h、24 h、48 h或72 h。在每个时间点，向每孔直接加入20 µL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），于37 °C孵育30 min，直至孔底出现紫色甲臜结晶。小心吸除上清液，避免扰动结晶，每孔加入150 µL DMSO，并将培养板置于摇床以100 rpm振荡10 min，使结晶完全溶解。使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。选择较短的孵育时间以避免高代谢活性细胞产生信号饱和。
6. 流式细胞术
细胞通过胰蛋白酶消化收集，在200 × g 条件下离心5分钟，并用预冷的PBS洗涤两次。将细胞重悬于500 µL结合缓冲液中，浓度约为1 × 106 个细胞/mL，加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI。轻轻混匀后，室温避光孵育15分钟。使用流式细胞仪分析样品，每份样品至少采集10,000个事件（激发波长488 nm，FITC发射波长530/30 nm，PI > 600 nm）。采用标准软件对凋亡细胞进行定量分析。
7. 蛋白质印迹
细胞用冰冷的PBS洗涤两次，加入含有蛋白酶抑制剂的200 µL RIPA裂解缓冲液，冰上裂解30分钟。用塑料刮棒刮下细胞，反复吹打以降低黏度，然后在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白（30 µg）与5×上样缓冲液混合，95 °C加热5分钟，随后在10%-12% SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。浓缩胶电泳电压为80 V，分离胶为120 V；之后在300 mA电流下将蛋白转移至PVDF膜上，持续90分钟。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4 °C与一抗（1:1,000）孵育过夜。用TBST洗涤三次后，室温下与HRP标记的二抗（1:5,000）孵育1小时。使用ECL底物显色，并通过化学发光检测系统曝光30-120秒获取图像。采用ImageJ软件对条带强度进行定量分析，以GAPDH作为上样内参。
8. 单丹磺酰尸胺（MDC）染色
使用前立即从原液配制50 µM MDC工作液。细胞在室温下用1 mL 4%多聚甲醛固定10分钟，用PBS洗涤两次后，加入500 µL MDC工作液，在37 °C避光孵育30分钟。再用PBS洗涤两次后，将盖玻片用抗荧光淬灭封片剂封片，并在荧光显微镜下观察（激发波长355 nm，发射波长512 nm）。
9. 透射电子显微镜（TEM）
细胞经200 × g离心5分钟收集并形成沉淀，随后在4 °C条件下用2%戊二醛固定过夜。样品用PBS洗涤3次，每次5分钟，然后在通风橱内于4 °C用1%四氧化锇后固定1小时。通过30%、50%、70%、90%和100%的梯度丙酮溶液进行脱水，每步10分钟。样品先用1:1丙酮/环氧树脂混合液浸透1小时，再用纯树脂浸透过夜。将样品包埋于新鲜树脂中，并在60 °C聚合48小时。使用超薄切片机切取50–70 nm的超薄切片，置于200目铜网上，先用2%醋酸铀染色30分钟，再用柠檬酸铅染色15分钟，随后用蒸馏水洗涤，空气干燥后在80 kV透射电子显微镜下观察。安全提示：戊二醛和四氧化锇具有毒性和挥发性，必须在通风橱内佩戴手套和护目镜操作。废弃物应根据机构安全规程丢弃至指定的危险废物容器中。
10. 统计学分析
所有实验均重复三次。数据以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学显著性检验，随后进行LSD事后检验，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。
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HSYA 对软骨细胞促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）表达的影响
与正常对照组相比，其他各组的促炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α 和 IL-6）水平均显著升高（P < 0.05，表1，图1A-G）。与空白模型组相比，使用 HSYA、HIF-1α 抑制剂、自噬诱导剂、HSYA + HIF-1α 抑制剂或 HSYA + 自噬诱导剂处理均显著降低了细胞因子水平（P < 0.05）。其中，联合处理组（HSYA + HIF-1α 抑制剂或 HSYA + 自噬诱导剂）进一步降低了细胞因子的表达，与模型组相比下降约 35%–40%（P < 0.05）。在基因干扰实验中（图1H-J），与模型 + 空白组相比，siRNA 沉默 HIF-1α 或 BNIP3 可使细胞因子水平降低约 25%–3...
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骨关节炎（OA）是一种常见的慢性疾病，显著影响患者的生活质量。在各种OA亚型中，膝骨关节炎（KOA）最为常见，是全球疾病负担的重要组成部分。尽管其发病率较高，但KOA的精确病因及潜在的病理生理机制仍不明确。关节软骨内机械与生化过程之间的复杂相互作用，特别是软骨细胞功能的调控，在KOA的发病机制中起着关键作用。值得注意的是，自噬活性的显著降低已成为KOA发生与进展的关键因素13,14。因此，增强自噬作用为促进软骨细胞存活、减轻疾病严重程度提供了一种有前景的治疗策略。
膝骨关节炎（KOA）的治疗遵循逐步推进的原则。非药物治疗（如减重、锻炼和物理治疗）是治疗的基础。尽管这些方法无副作用且可延缓关节退变，但起效较慢，仅适用于症状较轻的患者。在药物治疗中，外用非甾体抗炎药（NSAIDs）安全性较高，但疗效有限；口服NSAIDs可快速缓解疼痛，但存在胃肠道和心血管系统风险，且不能保护软骨。软骨保护剂（如氨基葡萄糖）安全性良好，但起效缓慢，且其疗效尚存争议。关节腔内注射透明质酸钠...
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作者声明无竞争利益。
本工作由广东省中医药局资助
（项目编号：20221446）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19150 | 用于透射电镜分析样品的进一步固定和染色 |
| 2% 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G5882 | 用于透射电镜样品制备的细胞固定 |
| 4% 多聚甲醛 | Servicebio | G1101 | 用于MDC染色和透射电镜样品制备的细胞固定 |
| AG1478 | Selleck Corporation | S1005 | 20 mg/kg 静脉注射，大鼠模型中ErbB受体激酶抑制剂 |
| Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 | Bioswamp | BS3030 | 用于流式细胞术检测凋亡细胞的染色 |
| 自噬诱导剂（RAPA） | Sigma Corporation | R0395 | 雷帕霉素，自噬诱导剂，在软骨细胞实验中使用浓度为10 nmol/L |
| Beclin1 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48341 | 用于Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1的一抗 |
| BNIP3 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-517348 | 用于Western blot检测BNIP3的一抗 |
| 二氧化碳培养箱 | Yiheng | BPN-150CW | 用于细胞培养 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 在MTT实验中溶解甲臜晶体 |
| DMEM | Beyotime | C0001 | 细胞培养基，添加10% FBS用于软骨细胞培养 |
| ELISA酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | Multiskan FC | 用于ELISA和MTT实验中OD值的测定 |
| 增强型化学发光（ECL）试剂 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | 用于Western blot中蛋白条带的显影 |
| 环氧树脂（EPON812） | Electron Microscopy Sciences | 14120 | 用于透射电镜切片样品的包埋 |
| FBS | Beyotime | C0205 | 胎牛血清，添加至DMEM中以提供软骨细胞营养 |
| 流式细胞仪 | Beckman（文中提及用于凋亡检测） | CytoFLEX S | 检测软骨细胞凋亡率及细胞标志物 |
| 荧光显微镜 | Olympus | IX73 | 观察MDC染色的自噬囊泡 |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | 捕获并定量Western blot中的蛋白条带 |
| HIF-1α 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13515 | 用于Western blot检测HIF-1α的一抗 |
| HIF-1α 抑制剂（YC-1） | Selleck Corporation | S1047 | HIF-1α 通路抑制剂，在细胞实验中使用浓度为10 μmol/L |
| 高速冷冻离心机 | Eppendorf | 5430R | 用于组分分离 |
| HRP标记的二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | 结合一抗，用于Western blot中的信号放大 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Shenggong Biology | C5236 | 通过ELISA定量细胞上清液中IL-1β 水平 |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Shenggong Biology | C5237 | 通过ELISA定量细胞上清液中IL-6水平 |
| LC3 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398822 | 用于Western blot检测自噬相关蛋白LC3的一抗 |
| Lipofectamine 3000 试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | 基于脂质的转染试剂，用于转染 |
| 单丹磺酰尸胺（MDC） | Sigma-Aldrich | D4008 | 0.05 mol/L，用于荧光显微镜下自噬囊泡的染色 |
| MTT试剂 | Beyotime | C0009 | 0.5 mg/mL，用于MTT实验评估软骨细胞增殖 |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | 测定RNA浓度 |
| NRG1 ELISA试剂盒 | Abcam (UK) | ab213961 | 通过ELISA测定心肌组织中NRG1浓度 |
| P62 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28359 | 用于Western blot检测自噬相关蛋白P62的一抗 |
| 磷酸化ErbB4（p-ErbB4）抗体 | Affinity | AF3445 | 用于Western blot检测活化ErbB4的一抗 |
| PrimeScript RT 试剂盒 | TaKaRa | RR047A | 将RNA逆转录为qPCR实验提供模板 |
| 实时定量PCR系统 | Bio-Rad | CFX96 | 用于RT-PCR检测 |
| 重组人NRG1（rh-NRG1） | R&D Systems | 396-HB | 5 mg/kg 静脉注射，用于在大鼠模型中激活NRG1/ErbB4通路 |
| RIPA裂解缓冲液 | Meilunbio | MA0151 | 含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液，用于蛋白提取 |
| 羟基红花黄色素A（HSYA） | 成都曼思特生物科技有限公司 | Must-160601 | 来源于红花（Carthamus tinctorius L.）的生物活性成分，在软骨细胞处理中使用浓度为100 μmol/L |
| SDS-PAGE设备 | Bio-Rad | Mini-PROTEAN Tetra | 按分子量分离Western blot中的蛋白质 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | 用于qPCR实验 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Shenggong Biology | C5238 | 通过ELISA定量细胞上清液中TNF-α 水平 |
| 总ErbB4抗体 | Proteintech | 19943-1-AP | 用于Western blot检测总ErbB4的一抗 |
| 透射电子显微镜（TEM） | Hitachi（文中提及用于自噬囊泡观察） | H-7650 | 在超微结构水平观察线粒体中的自噬囊泡 |
| Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | 用于RNA提取 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco (Thermo Fisher) | 25200056 | 用于关节软骨的酶消化以分离软骨细胞 |
| II型胶原酶（0.02%） | Worthington Biochemical | CLS-2 | 消化软骨组织以分离软骨细胞 |
| β-catenin 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | 用于Western blot归一化的内参抗体 |
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