羟基红花黄A通过抑制HIF-1α/BNIP3通路 调节 自噬治疗膝骨关节炎的分子机制

膝骨关节炎 （KOA） 是一种普遍存在的慢性骨科疾病，影响中老年人，显着影响他们的生活质量 ^1,2。尽管 KOA 广泛存在，但其确切的病因和病理生理机制仍不完全清楚。此外，对于预防和治疗来说，都强调了解开这种情况错综复杂的病理基础的紧迫性。一个新兴的兴趣领域是自噬在软骨稳态中的作用，越来越多的证据表明，软骨组织内自噬减少会导致其在 KOA 中的退化 ^3,4。

自噬是一种对维持细胞稳态至关重要的细胞降解过程，在软骨的维持和修复中具有重要意义。在关节软骨内普遍存在的缺氧微环境中，缺氧诱导因子 1α （HIF-1α）/腺病毒 E1B 19 kDa 相互作用蛋白 3 （BNIP3） 信号通路成为自噬的关键调节因子。在KOA患者中观察到HIF-1α表达升高，表明该途径的失调可能导致自噬受损和随后的软^{骨变性5,6,7}。

针灸、艾灸、草药、推拿是中医治疗膝关节炎的四种经典方法。目前的治疗方法，如非甾体抗炎药、透明质酸注射和关节置换术，已被证明是有帮助的，但也与某些副作用有关⁸。此外，没有推荐的膝骨关节炎常规治疗方法。随着时间的推移，作为 KOA 的常见补充疗法，中医 （TCM） 已经开发出许多草药，在治疗 KOA⁹ 方面显示出前景。其中，羟基红花黄A因其抗炎和自噬调节特性而受到广泛关注^10,11。然而，HSYA 对膝骨关节炎 （KOA） 发挥治疗影响的确切机制，特别是在通过 HIF-1α/BNIP3 途径调节自噬方面，仍不确定。因此，我们通过重点研究 HSYA 对软骨细胞自噬的影响及其与 HIF-1α/BNIP3 通路的相互作用，研究 HSYA 在 KOA 中的治疗作用机制。我们假设 HSYA 通过增强软骨细胞自噬和增殖来减轻膝骨关节炎，同时通过抑制 HIF-1α/BNIP3 通路抑制细胞凋亡和炎症。

所有涉及人体样本的程序均经湛江市中心人民医院伦理委员会批准（批准号KY-YS-2021-09）。在样本采集之前，已获得所有参与者的书面知情同意书。所使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 患者和研究设计

招募了 30 名诊断为膝骨关节炎 （KOA） 并接受全膝关节置换术的患者。该队列包括 14 名男性和 16 名女性，年龄在 52-75 岁之间（平均±标准差：64.3 ± 12.6 岁），均符合美国风湿病学会 KOA 标准¹²。如果患者在手术前 2 周内接受过非甾体抗炎药或类固醇治疗或在 1 个月内接受过关节内注射，则被排除在外。

2.原代软骨细胞培养

手术后立即在无菌条件下收集关节软骨并放入冷 PBS 中。使用无菌手术刀，在冰冷的玻璃板上将软骨切成~1mm³碎片，并转移到含有10mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA的50mL离心管中。将试管在 37 °C 的摇动水浴中以 80 rpm 孵育 30 分钟，并每 5 分钟轻轻倒置一次以促进消化。吸出上清液，用PBS洗涤组织沉淀一次，以200 × g 离心5 min。然后将沉淀重悬于 10 mL 0.02% II 型胶原酶中，并在 37 °C 下摇动消化 4 小时。悬浮液每30分钟上下移液以促进解离，通过70μm过滤器，并再次以200× g 离心5分钟。将所得沉淀重悬于补充有 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 中，并接种到 T25 烧瓶中。将细胞与 5% CO₂ 在 37 °C 下孵育，每 2-3 天更换一次培养基，并使用第 1-2 代的细胞进行实验。实验组为正常对照组、空白模型、HSYA（100 μmol/L）、HIF-1α抑制剂YC-1（10 μmol/L）、雷帕霉素（10 nmol/L）、HSYA+YC-1、HSYA+雷帕霉素。

3. siRNA介导的HIF-lα、BNIP3敲低

将原代软骨细胞接种在6孔板中，接种2-5个×10个⁵ 个细胞/孔，并在37°C下培养直至达到30%-50%汇合度。对于每个孔，将 5 μL 20 μM siRNA 稀释在 250 μL Opti-MEM 中，将 5 μL 基于脂质的转染试剂分别稀释在 250 μL Opti-MEM 中。将两种溶液轻轻混合并在室温下孵育15-20分钟以形成络合物。用含有10%FBS的1.5 mL新鲜DMEM替换培养基，并沿孔壁滴加siRNA-脂质复合物（500μL），轻轻旋转。将细胞孵育6小时，用完全培养基代替培养基，继续培养48-72小时。进一步处理前通过qRT-PCR和Western blot验证敲低效率。

4. ELISA

收集细胞培养上清液，以200 × g 离心5 min，必要时在测定缓冲液中以1：2稀释。根据制造商的方案使用用于 IL-1β、TNF-α 和 IL-6 的 ELISA 试剂盒。标准品、空白品和样品一式三份运行。底物反应后，在15分钟内使用酶标仪在450nm处测量吸光度。

5. MTT测定

将软骨细胞在 100 μL 完全培养基中以 5,000 个细胞/孔接种到 96 孔板中，并孵育 0 小时、24 小时、48 小时或 72 小时。在每个时间点，将 20 μL MTT 溶液（PBS 中的 5 mg/mL）直接添加到每个孔中，并将板在 37 °C 下孵育 30 分钟，直到在孔底部可见紫色甲臜晶体。在不干扰晶体的情况下小心地吸出上清液，向每个孔中加入150μL DMSO，并将板以100 rpm的转速放在振荡器上10分钟，以完全溶解晶体。使用酶标仪在490 nm处测量吸光度。选择较短的孵育时间以避免高代谢活跃细胞中的信号饱和。

6. 流式细胞术

通过胰蛋白酶消化收获细胞，以 200 × g 离心 5 分钟，并用冷 PBS 洗涤两次。将它们以 ~1 × 10⁶ 个细胞/mL 重悬于 500 μL 结合缓冲液中，并加入 5 μL 膜联蛋白 V-FITC 和 5 μL PI。温和混合后，将细胞在室温下在黑暗中孵育15分钟。在流式细胞仪上分析样品，每个样品至少收集 10,000 个事件（激发 488 nm，发射 FITC 530/30 nm，PI > 600 nm）。使用标准软件对细胞亡细胞进行定量。

7. 蛋白质印迹

用冷PBS冲洗细胞两次，并在冰上裂解200μL 含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液30分钟。用塑料刮刀刮擦细胞，上下移液以降低粘度，并在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。 收集上清液，并使用 BCA 测定法测量蛋白质浓度。将等量的蛋白质（30μg）与5×上样缓冲液混合，在95°C下加热5分钟，并在10%-12%SDS-PAGE凝胶上分离。电泳在 80 V 下进行堆叠，在 120 V 下进行分离，并将蛋白质以 300 mA 转移到 PVDF 膜上 90 分钟。将膜在室温下在 5% 脱脂牛奶中封闭 1 小时，并与一抗 （1：1,000） 在 4 °C 下孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP偶联的二抗（1：5,000）在室温下孵育1小时。用 ECL 底物可视化蛋白质条带，并使用化学发光检测系统对蛋白质条带进行成像，曝光 30-120 秒。使用ImageJ量化能带强度，并使用GAPDH作为负载对照。

8. 单丹基卡维林 （MDC） 染色

使用前立即从储备溶液中制备 50 μM MDC 工作溶液。细胞在室温下用 1 mL 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，用 PBS 洗涤两次，然后与 500 μL MDC 工作溶液在 37 °C 下在黑暗中孵育 30 分钟。用PBS洗脱两次后，用抗褪色封片介质封片盖玻片，并在荧光显微镜下观察（激发355nm，发射512nm）。

9. 透射电子显微镜 （TEM）

收获细胞并通过在 200 × g 下离心 5 分钟沉淀，然后在 4 °C 下用 2% 戊二醛固定过夜。样品用PBS洗涤3次，每次5分钟，并在通风橱中在4°C下在1%四氧化锇中后固定1小时。通过30%、50%、70%、90%和100%的分级丙酮系列进行脱水，每个系列10分钟。用1：1的丙酮/环氧树脂浸润样品1 h，然后用纯树脂浸润过夜。在新鲜树脂中进行包埋，并在60°C下聚合48 h。用超微切片机切割50-70 nm的超薄切片，安装在200目铜网格上，用2%醋酸铀酰染色30分钟，然后用柠檬酸铅染色15分钟，用蒸馏水洗涤，风干，并在80 kV的透射电子显微镜下检查。作为安全注意事项，戊二醛和四氧化锇有毒且易挥发，只能在通风橱中戴上手套和防护眼镜进行处理。废物应根据机构安全规程处理在指定的危险容器中。

10. 统计分析

所有实验一式三份进行。数据表示为平均值±标准差。使用单因素方差分析评估统计显着性，然后进行 LSD 事后检验，P < 0.05 被认为是显着的。

HSYA对软骨细胞促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）表达的影响
与正常对照组相比，所有其他组均表现出促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α和IL-6）水平显着升高（P < 0.05，表1，图1A-G）。HSYA、HIF-1α抑制剂、自噬诱导剂、HSYA+HIF-1α抑制剂或HSYA+自噬诱导剂治疗相对于空白模型组，细胞因子水平显著降低（P < 0.05）。其中，联合治疗（HSYA+HIF-1α抑制剂或HSYA+自噬诱导剂）进一步降低细胞因子表达，较模型组降低约35%-40%（P < 0.05）。在基因干扰实验（图1H-J）中，与模型+空白组相比，HIF-1α或BNIP3的siRNA敲低导致细胞因子水平降低~25%-30%。HSYA 治疗进一步增强了这些效果。具体而言，siHIF-1α + HSYA组的细胞因子水平比siHIF-1α+空白组低~20%，siBNIP3 + HSYA组的细胞因子水平比siBNIP3 + 空白组低~22%（P < 0.05）。

HSYA对软骨细胞增殖的影响
正常对照组表现出基线增殖活性，而空白模型组表现出显着降低（P < 0.05， 图2A）。HSYA、HIF-1α抑制剂或自噬诱导剂治疗后增殖部分恢复，HSYA+HIF-1α抑制剂或HSYA+自噬诱导剂联合治疗可显著增强（P < 0.05）。在siRNA实验（图2B）中，与模型对照组相比，敲低HIF-1α或BNIP3可促进增殖~25%。HSYA治疗进一步增强增殖，与模型组相比增殖率高~40%（P < 0.05）。

HSYA对软骨细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响
蛋白质印迹分析显示各组之间的蛋白质表达存在显着差异（表2）。与对照组相比，空白模型组HIF-1α明显上调，LC3、P62、Beclin1和BNIP3表达降低（P < 0.05）。用 HSYA、HIF-1α 抑制剂或自噬诱导剂处理可增加 LC3、P62、Beclin1 和 BNIP3 表达，降低 HIF-1α 水平 （P < 0.05）。HSYA+HIF-1α抑制剂或HSYA+自噬诱导剂联合治疗产生最大变化，LC3和Beclin1水平比空白模型组增加近一倍。尽管当自噬被激活时，P62 通常会降低，但 HSYA 治疗后其水平会增加。这可能表明自噬体积累增强或通量不完全，这种现象在之前的软骨细胞自噬研究中也报道过。

HSYA对软骨细胞凋亡率的影响
流式细胞术分析显示，空白模型组的细胞凋亡率显著高于正常对照组（P < 0.05，图3A，B）。HSYA、HIF-1α抑制剂和自噬诱导剂均降低了细胞的死亡，而联合治疗（HSYA+HIF-1α抑制剂或HSYA+自噬诱导剂）的细胞灭亡率最低，与空白模型组相比降低了~45%-50%（P < 0.05）。在siRNA实验中，敲低HIF-1α或BNIP3也降低了细胞凋亡，HSYA处理进一步降低了细胞灭亡。

HSYA对软骨细胞凋亡率和自噬囊泡形成的影响
MDC染色和TEM成像显示各组自噬囊泡形成的明显差异（图4A-D）。空白模型组囊泡分布稀疏，而HSYA、HIF-1α抑制剂或自噬诱导剂处理增加了囊泡数量。联合治疗（HSYA + HIF-1α 抑制剂或 HSYA + 自噬诱导剂）产生了最显着的增强，与模型组相比，TEM 观察到的囊泡大约多两倍。与这些发现一致，通过流式细胞术测量的细胞凋亡率（图5A-E）在联合治疗组中最低。

数据可用性：
本研究中生成的所有数据均在 补充文件 1 中提供。

图1：每组软骨细胞促炎细胞因子（IL-1β，TNF-α，IL-6）的表达（n = 3）。 （A-G）Western blotting（WB）检测IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白表达水平。（H-J）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-1β、TNF-α、IL-6含量（P < 0.05）。请点击此处查看此图的大图。

图2：每组软骨细胞增殖活性的比较（n = 3）。 （A）处理组，（B）HIF-1α和BNIP3敲低组，P< 0.05。 请点击此处查看此图的大图。

图3：各组细胞凋亡率的比较（n = 3）。 （A）1、正常组;2、模型组;3、HSYA组;4、HIF-1α抑制剂组;5、自噬组;6、HSYA+HIF-1α抑制剂组;7、HSYA+自噬诱导剂组。（B）HIF-1α和BNIP3基因敲低组。与正常对照组相比，*P<0.05。与空白模型组相比，#P< 0.05。与HSYA+HIF-1α抑制剂组相比，P<0.05。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：线粒体中自噬囊泡形成的 TEM 成像。（A） 空白模型。（B） HSYA 组。（C）HIF-1α抑制剂组。（D）自噬诱导组。比例尺 = 1 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图5：HSYA对每组细胞凋亡率的影响（n = 3）。（A） 空白模型。（B） HSYA 组。（C）HIF-1α抑制剂组。（D）自噬诱导组。（E）与正常对照组相比，各组的总分析，**P< 0.01。请点击此处查看此图的大图。

表 1：每组促炎细胞因子水平的比较。与正常对照组相比，*P<0.05。与空白模型组相比，#P< 0.05。与HASY、HIF-1α抑制剂和自噬诱导剂治疗组相比，&<0.05。

表2：不同组中蛋白质的比较。与正常对照组相比，*P< 0.05。与接受HSYA、HIF-1α抑制剂和自噬诱导剂治疗的组相比，为 #P<0.05。

补充文件 1：研究期间生成的原始数据。 请点击此处下载此文件。

作者声明没有利益冲突。