本文介绍了一种实验方案，旨在首次报道油茶（C. oleifera）叶片在三个生长发育阶段的营养成分及其相关代谢途径，为理解叶片衰老的分子机制提供基础依据。
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本文介绍了一种实验方案，旨在首次报道油茶（C. oleifera）叶片在三个生长发育阶段的营养成分及其相关代谢途径，为理解叶片衰老的分子机制提供基础依据。
为了指示营养成分、与氮代谢相关的基因表达以及淀粉和蔗糖代谢中的变化 C. oleifera 不同生长期的叶片 C. oleifera ‘大别山1号’品种在幼年期（2年生）采集 C. oleifera），果实早期发育阶段（6年生） C. oleifera）以及盛果期（10年生 C. oleifera），选为实验材料。在初花期对叶片样品进行营养成分测定和转录组测序分析，系统研究了营养物质含量及相关代谢途径 C. oleifera 不同生长时期。结果在分别经过处理后，鉴定了9个与氮代谢相关的同源基因和24个与淀粉及蔗糖代谢相关的同源基因 C. oleifera 在幼年期和盛果期采集叶片，用于在KEGG数据库中进行比较。随着树龄增加，氮代谢以及淀粉和蔗糖代谢通路发生变化 C. oleifera叶片 C. oleifera 将增强苯丙氨酸解氨酶途径和蔗糖生物合成，最终导致可溶性蛋白和可溶性糖含量升高 C. oleifera 叶片。本研究为氮代谢、淀粉和蔗糖代谢以及营养成分在转变过程中的变化机制提供了新的见解 C. oleifera 从营养生长转向生殖生长，为理解其开花结果期以及施用植物叶面肥促进开花和结果提供了理论依据。
在幼年阶段，C. oleifera 通常具有未分化的主茎，主要进行营养生长，不具备花芽分化和开花等生殖过程的能力1。嫁接 C. oleifera 实生苗时，通常采用进入成年阶段的春季新梢作为接穗，因其具备诱导开花的能力2,3,4。然而，在早期种植阶段，处于幼年期的 C. oleifera 可能由于营养生长旺盛，加之环境条件限制花芽形成，难以形成花芽并完成花芽分化。尽管如此，随着 C. oleifera 从幼年期逐步过渡到初果期，并最终进入盛果期，其逐渐具备正常花芽形成和开花的能力。C. oleifera 具有树体结构复杂、花果同期并存的特点5。在初果阶段，C. oleifera 可能仅产生少量花朵，而进入盛果期后则开花数量显著增加。在 C. oleifera 的盛果期，生殖生长占据主导地位，对光照、温度、水分和养分的需求也随之增加。显然，像 C. oleifera 这类木本果树在开花前具有较长的营养生长期，这限制了缩短栽培周期和实现早期高产的可能性6。
氮素对植物的生长和发育至关重要。不同种类的植物含氮量各不相同，即使在同一物种中，不同生长期的氮含量也存在显著差异。当植物进入生殖生长期时，氮素会逐渐在花、果实和种子等器官中积累7。氮是酶、蛋白质、特定激素、核酸及其他重要物质合成所必需的元素，从而调控植物的代谢活动8。花芽分化过程是植物由营养生长向生殖生长转变的关键转折点，涉及复杂的发育机制。营养物质的积累是植物花芽分化的基础9。目前普遍认为，成功的花芽分化依赖于碳水化合物的积累10。在果树花芽分化过程中，可溶性糖含量的波动会直接或间接影响该过程10。研究表明，Prunus salicina 叶片中的碳水化合物水平与花芽分化密切相关，因为在生理分化期其可溶性糖含量高于形态分化期，P. salicina在花芽分化期间经历了碳水化合物的快速消耗11。然而，也有研究报道，在Ficus carica的花芽分化过程中，可溶性淀粉含量未出现显著波动12。常绿植物在春季花芽分化期间于子房中积累淀粉，而落叶植物则在芽休眠期储存淀粉13。根据上述信息可以得出结论：不同物种在花芽分化过程中，碳水化合物含量变化的轨迹存在差异。Ying 等人14分析了Vernicia fordii在花芽分化两个不同阶段中，参与氮代谢以及蔗糖和淀粉代谢等基本代谢途径的关键酶基因的表达模式。该分析结合了桐树花芽生理生化指标的动态变化，系统阐明了桐树花芽分化过程中营养物质的积累、利用、运输与分配机制8,14。赖成春等人的研究发现，去除两片叶可调控蔗糖磷酸合成酶（SPS）、中性转化酶（NI）、细胞壁转化酶（CWI）和α-淀粉酶（AMY）等基因的表达，促进蔗糖合成及后续淀粉的积累，为果实成熟、新梢萌发和开花提供了必要的营养基础13,15。
然而，关于营养成分、氮代谢以及淀粉和蔗糖代谢变化的研究 C. oleifera 在不同阶段的研究鲜有报道。大多数研究集中于构建单核苷酸多态性（SNP）图谱、开发SSR标记，以及解析生理和分子水平上的响应 C. oleifera 在低温或高温条件下16,17,18,19,20因此，在本研究中，常见的 C. oleifera 品种 "大别山 1" 选择，并采集春季新梢在不同生长期（幼年期、初果期和盛果期）的叶片样品 C. oleifera 用于营养成分和转录组测序分析的样品已被收集。目的是鉴定在生长发育过程中不同阶段的营养成分含量、氮代谢以及蔗糖和淀粉代谢相关基因表达的差异 C. oleifera 叶片。阐明氮代谢、蔗糖和淀粉代谢途径及其与相关营养物质的关系，可为研究其作用机制奠定基础 C. oleifera 花芽分化并揭示其分子机制 C. Oleifera 开花。
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1. 实验材料
C. oleifera ‘Dabieshan 1’的叶片在三个关键发育阶段采集：幼年期（约2年生）、初果期（约6年生）以及盛果期（约10年生）。上述三个发育阶段的C. oleifera植株均采用相同规格的容器苗进行栽植，品种均为C. oleifera ‘Dabieshan 1’。C. oleifera林地土壤的理化性质见表1。
2. 采集地点概述
实验材料采自安徽省中部的和平镇。舒城县位于该省中部地区，属于大别山的边缘区域，地理坐标为北纬31°11′，东经116°47′，平均海拔90米。土壤类型为黄棕壤。该地区属湿润亚热带季风气候，年平均气温15.6 °C，年均降水量约1100 mm，年均日照时数约1969小时，无霜期长达224天。
3. 样品采集与预处理
在开花前期（9月下旬）采集样品。每个发育阶段均选择生长状况相似、一致且健壮的C. oleifera植株。从每株植株上自上而下取第三片叶，该叶片来自C. oleifera树冠外围东、西、南、北四个方向生长适中的春梢。样品以连续字母和数字标记：YAT1、YAS2 和 YAT3 分别代表C. oleifera幼年期、进入初果期以及盛果期的叶片。样品采集后立即置于液氮中保存。每个发育阶段随机选取5株样树作为一个生物学重复，所有阶段共设置三个生物学重复。所采集的样品当天带回实验室，并于-80 °C条件下保存。
4. 生理指标测定
采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量21。有机碳含量通过重铬酸钾氧化-硫酸亚铁滴定法测定22。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定23。总氮浓度通过凯氏定氮法进行定量22。
5. 进行了完整RNA的提取，随后构建互补DNA（cDNA）文库并进行测序
使用植物RNA提取试剂盒从不同发育阶段的C. oleifera叶片中提取总RNA。采用全波长紫外-可见分光光度计测定总RNA浓度。利用生物分析仪检测RNA的完整性和清晰度。在构建并验证cDNA文库后，采用边合成边测序的高通量测序平台进行转录组测序。测序过程产生长度均为100个碱基对的单端读长24,25,26。使用RSEM软件对序列比对结果进行统计分析27。采用DESeq差异分析软件鉴定C. oleifera不同发育阶段的差异表达基因（DEGs）28,29。
6. 从头合成 组装与UniGene注释
使用 SeqPrep（http://github.com/jstjohn/SeqPrep）和 Sickle（http://github.com/najoshi/sickle）对原始数据进行过滤，包括去除低质量序列和受污染的接头序列。随后，利用 Trinity 软件30,31对各样本获得的高质量测序读段进行转录本组装。将所有组装得到的转录本依次与 Swiss-Prot、真核生物完整基因组直系同源簇（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）以及 KEGG 数据库进行 BLASTX 比对。设定常用的 E 值截断阈值（E-value <10−5）以获取其功能注释信息。采用 KEGG 数据库进一步分析相关的代谢通路32。
7. 基因功能注释与差异表达基因分析
使用RSEM软件对基因和转录本的丰度进行统计分析27。设定筛选阈值（P < 0.05，FDR < 0.01，|log2FC|>1），用于鉴定差异表达基因（DEGs）。每百万映射片段中每千碱基转录本的期望片段数（FPKM）是目前最广泛使用的基因表达水平估算方法28。计算了来自三个不同生长发育阶段（YAT1、YAS2和YAT3）的所有基因的FPKM值。通过层次聚类分析评估差异表达基因的表达水平。同时，利用KOBAS进行KEGG通路分析，以鉴定在经Bonferroni校正后P ≤ 0.05条件下，相较于整个转录组在代谢通路中显著富集的差异表达基因29。
8. 分析方法
使用 Excel 计算数据的平均值和标准差。采用 SPSS 软件进行方差分析（ANOVA）以进行统计分析，并使用 Duncan 多重极差检验评估三个阶段之间营养成分的显著差异。随后，通过最小显著差异法（LSD）进行事后多重比较，以确定组间的显著差异。使用 Origin 软件生成图表，以可视化实验和分析结果。无统计学显著性以“ns”表示（P > 0.05）。具有统计学显著性的差异分别以“*”（P < 0.05）、“**”（P < 0.01）、“***”（P < 0.001）和“****”（P < 0.0001）表示。
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不同生长期油茶（C. oleifera）叶片中含氮化合物含量的比较
氮素在促进植物生长发育方面至关重要，对其生殖过程具有深远影响。因此，了解植物整体氮含量对于科研工作具有重要意义。C. oleifera叶片中的全氮含量随着植株从幼年期经初果期到盛果期的成熟过程而逐渐降低，测得值分别为14.76 g/kg、13.84 g/kg和13.21 g/kg（图1）。
图2展示了不同生长期可溶性蛋白含量的变化。C. oleifera叶片中的可溶性蛋白含量随树龄增长呈逐步上升趋势，初果期和盛果期的含量分别比幼年期高出1.30倍和1.35倍（图2）。这表明在开花前的初果期和盛果期，C. oleifera<...
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可溶性糖在植物中作为重要的能量来源和结构组分，为多种生理活动和生物合成过程提供能量10。可溶性糖含量的变化会直接或间接影响果树由营养芽向花芽转化的过程10。一些研究发现，充足的可溶性糖是果树花芽分化所必需的33。可溶性蛋白在物质合成中发挥关键作用。已有观察表明，在植物花芽分化前，枝条和叶片中会出现可溶性蛋白的显著积累，为花芽发育提供营养和结构基础34。可溶性蛋白是植物花器官形成的物质与能量基础，在花芽分化期间需要大量积累35。本研究发现，油茶（C. oleifera）叶片在初果期和盛果期的可溶性糖和可溶性蛋白含量均高于幼年期。
Poorter 和 Bongers 的研究表明，较高的叶片碳含量表明叶片质量较大、光合速率和生长速率较低，并对不利环境条件具有更强的抗性；而较高的氮和磷含量则表明光合速率较高、生长较快，以及对生长资源具有...
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本工作得到安徽省自然科学基金青年项目（2008085QC135）、皖西学院博士后科研工作站研究项目（WXBSH2020003）、安徽省博士后科学研究计划项目（2024A767）、安徽省科技特支计划高校青年人才企业挂职项目（2024jsqygz79）以及安徽省林业科学研究与创新项目（2024年第4号文件）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物分析仪 2100 | Agilent Technologies, Inc. (USA) | — | 用于评估 RNA 的完整性与纯度 |
| DESeq 软件 | 源代码 | 3.2 | 用于差异表达分析 |
| EASYspin Plus 试剂盒（总 RNA 提取） | 艾德莱生物科技有限公司 (中国) | RN 28 (Aidlab) | 用于从油茶叶片中提取总 RNA |
| HiSeq 2000 测序平台 | Illumina (中国) | — | 用于转录组测序，读长为 100 bp |
| 凯氏定氮法/Kjeltec 2300 | Foss Tecator(瑞典) | — | 用于测定总氮浓度（Bao 2007） |
| 可溶性蛋白测定方法 | 浓硫酸 | 6104-58-1(aladdin) | 由陈建勋建立的方法（Chen 等，2015） |
| 可溶性糖测定方法 | 蒽酮 | 90-44-8 (Macklin) | 张志良’s 方法（Zhang 等，2003） |
| 重铬酸钾氧化-硫酸亚铁滴定法 | 重铬酸钾 硫酸亚铁 | NA (aladdin) 7782-63-0(aladdin) | 用于有机碳测定（Bao 2007） |
| RSEM 软件 | 源代码 | 1.2.3 | 用于序列比对与统计分析 |
| Thermo Scientific NanoDrop 2000C 分光光度计 | ABI(USA) | — | 用于测定 RNA 浓度 |
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