高血糖刺激内皮细胞的综合转录组和分泌组蛋白质组分析及靶标化合物筛选

Summary

该方案建立了一个集成的多组学流程（转录组和蛋白质组），结合网络药理学筛选，以识别糖尿病并发症内皮功能障碍的分子驱动因素和治疗靶点。

Abstract

内皮功能障碍是糖尿病肾病（DKD）的关键驱动因素，但其全身分子机制仍未完全解码。我们假设整合多组学分析能够绘制高血糖引起的内皮损伤，并识别可重复使用的治疗方法。应用了可复用的计算流程，整合了来自高血糖内皮细胞和糖尿病肾脏的转录组/分泌组结构。该研究识别出534个常被上调的基因/蛋白质。功能富集揭示了细胞外基质重塑、细胞间通讯和炎症通路的激活。跨数据库验证精炼出278个高置信度介质，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析确定了10个枢纽基因。利用网络药理学，我们筛选了一个获批的药物库，识别出几种可能靶向该网络的候选化合物（如布鲁西安汀、伊德拉西布）。此外，转录因子调控和典型分子对接模拟（如与CTCF/BRD4的伊德拉西布）为实验验证提供了机制假说。总之，本研究建立了一个可重复使用的多组学框架，阐明DKD中的内皮致病机制，并推荐可再利用的药物候选，为机制和治疗发现提供了战略性方法。

Introduction

糖尿病作为一项全球健康挑战，2021年影响了5.29亿人，预计到2050年将影响13.1亿^人。除了血糖控制外，长期并发症是发病率、死亡率和生活质量下降的主要原因。这些包括微血管并发症（如糖尿病肾病（DKD）、视网膜病变、神经病变）和宏血管并发症（如加速动脉粥样硬化）。关键是，DKD影响30%-40%的糖尿病患者，是全球末期肾病（ESRD）的主要原因^2。这些并发症带来的沉重负担凸显了针对其潜在机制的新疗法的紧迫未满足需求。

内皮细胞（EC）构成所有血管内衬，是血管健康的关键守门人。高血糖诱导的内皮功能障碍是糖尿病血管病变和^{器官损伤的主要}驱动因素^3,4。高血糖水平会引发ECS内一系列不良反应，包括一氧化氮（NO）生物利用度失调、内皮素-1（ET-1）分泌增加、粘附分子表达上调（如VCAM-1、ICAM-1）、通过过量活性氧（ROS）产生（如NADPH氧化酶）引起的氧化应激增强，以及持续的低级别炎症^3,4.这些变化共同导致血管扩张受损、血管通透性增加、白细胞粘附和浸润、促血栓状态，最终导致....

Protocol

动物实验经河北夷陵医学研究院动物研究伦理委员会批准（批准号：N2024082）。 请参阅材料表 ，了解本研究中使用的实验材料和仪器。人员在处理危险试剂如TRIzol（皮肤/眼睛刺激物，含酚）和蛋白酶抑制剂（潜在呼吸/皮肤敏感剂）时，必须严格佩戴适当的个人防护装备（PPE）。将生物/液体废物隔离在可高压灭菌的袋中，危险化学废物则存放在指定容器中，供机构进行危险处置。在丢弃前对消耗品进行消毒。

糖尿病肾病小鼠建模

雄性db/db和db/m小鼠（12周龄）在特定无病原体（SPF）条件下维持，环境为22±2°C，湿度5±6%，12小时光暗循环，并可 自由 获取食物和水。经过一周的高原适应期后，小鼠被随机分配数字标识并分配到实验组。DB/db小鼠被喂食高蛋白饮食6周以确立DKD。成功的模型通过尿液白蛋白与肌酐比值（UACR）显著升高相较对照组的表现得到证实，其中UACR为>30 mg/g，是早期DKD¹²的主要功能生物标志物。

高葡萄糖内皮细胞建模

人类肾小球内皮细胞（HRGEC）在标准条件下制备。HRGEC在正常葡萄糖（NG，5.5 mM D-葡萄糖）或高葡萄糖....

Results

高血糖内皮分泌物对肾小管致病影响的证明

本研究始于验证高血糖内皮分泌组的致病效应。与对照组相比，高血糖人类肾小球内皮细胞（HG-CM）的调控培养基显著降低了人类近端小管上皮细胞（HK-2）的存活能力。

基于这些功能性证据，进行了综合糖尿病肾转录组和高葡萄糖治疗内皮分泌组分析（LC-MS/MS OF HG-CM）。该研究鉴定出一组协调上调的致病基因及其相应分泌蛋白。利用这些常见的致病靶点，L1000CDS2化合物文库被计算筛选出预测会功能性下调其表达或活性的药物。同时，利用转录因子（TF）数据库识别出调控这些致病靶的关键转录因子。通过分子对接进行计算机辅助筛选，评估候选再利用化合物对致病TFs的结合潜力。最后，应通过qPCR（mRNA水平）和ELISA（分泌蛋白产物）验证TFs下游致病基因的表达，确认.......

Discussion

本研究通过综合多组学和计算方法，确立了高血糖诱导的内皮分泌组功能障碍作为糖尿病肾损伤的关键驱动因素。证明，分泌组介导的肾小管细胞毒性与534个内皮衍生因子的系统失调一致，这些因子在DKD发病机制中趋同于基质重塑、氧化应激和炎症核心通路。鉴定出278个高置信介导因子，包括机制验证的CCL2、VWF、SERPINE1和THBS1（表现出1.15至2630倍的共上调），通过绘制内皮转录重编程如何转化为分泌促纤维化、促炎效应物，解决了一个关键知识空白^26,33。特别值得注意的是CCL2（MCP-1），这是一种强效趋化因子，负责协调单核细胞/巨噬细胞向肾组织的招募。临床和实验证据一致表明CCL2是糖尿病肾损伤进展的主要介质，其过度表达会加重白蛋白尿、间质性炎症和微管间质纤维化^34,35。这里观察到的CCL2诱导极高，可能反映了其在建立促进糖尿病肾脏.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCL2 ELISA 套件	赛莫飞世尔科学	#88-7399-88
CCR2抑制剂	默克米利波尔	#227016
细胞存活能力检测套件	七项生物技术	CCK-8，SC119-01
DNA测序仪	光辉	NovaSeq 6000
高性能液相色谱系统	赛莫飞世尔科学	UltiMate 3000 二进制 RSLC
HRGECs培养基	上海中中桥鑫周生物技术有限公司	1001
人类肾肾小球内皮细胞（HRGEC）	上海中桥新州生物技术	PRI-H-00038
人类肾脏管上皮细胞完整培养基	Procell	CM-H193
人体肾脏管上皮细胞（HK2）	Procell	CP-H193
公性DB/DB和db/m小鼠（4周大）	杭州紫源生物科技有限公司	SCXK 20190004
质谱仪	赛莫飞世尔科学	星界
微板吸收读器	分子器件	SpectraMax iD5
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（无EDTA）	罗什	cOmplete，#5056489001
RNA提取试剂	赛莫飞世尔科学	TRIzol，#15596026
RNA质量分析仪	安捷伦科技	5300碎片分析仪，M5311AA
RNA定量仪器	赛莫飞世尔科学	量子比特3.0，Q33216
ROS检测套件	赛莫飞世尔科学	#EEA019
超滤离心装置（3千道散MWCO）	默克米利波尔	阿米康Ultra-4