高血糖刺激内皮细胞的综合转录组和分泌组蛋白质组分析及靶标化合物筛选

Summary

该方案建立了一个集成的多组学流程（转录组和蛋白质组），结合网络药理学筛选，以识别糖尿病并发症内皮功能障碍的分子驱动因素和治疗靶点。

Abstract

内皮功能障碍是糖尿病肾病（DKD）的关键驱动因素，但其全身分子机制仍未完全解码。我们假设整合多组学分析能够绘制高血糖引起的内皮损伤，并识别可重复使用的治疗方法。应用了可复用的计算流程，整合了来自高血糖内皮细胞和糖尿病肾脏的转录组/分泌组结构。该研究识别出534个常被上调的基因/蛋白质。功能富集揭示了细胞外基质重塑、细胞间通讯和炎症通路的激活。跨数据库验证精炼出278个高置信度介质，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析确定了10个枢纽基因。利用网络药理学，我们筛选了一个获批的药物库，识别出几种可能靶向该网络的候选化合物（如布鲁西安汀、伊德拉西布）。此外，转录因子调控和典型分子对接模拟（如与CTCF/BRD4的伊德拉西布）为实验验证提供了机制假说。总之，本研究建立了一个可重复使用的多组学框架，阐明DKD中的内皮致病机制，并推荐可再利用的药物候选，为机制和治疗发现提供了战略性方法。

Introduction

糖尿病作为一项全球健康挑战，2021年影响了5.29亿人，预计到2050年将影响13.1亿^人。除了血糖控制外，长期并发症是发病率、死亡率和生活质量下降的主要原因。这些包括微血管并发症（如糖尿病肾病（DKD）、视网膜病变、神经病变）和宏血管并发症（如加速动脉粥样硬化）。关键是，DKD影响30%-40%的糖尿病患者，是全球末期肾病（ESRD）的主要原因^2。这些并发症带来的沉重负担凸显了针对其潜在机制的新疗法的紧迫未满足需求。

内皮细胞（EC）构成所有血管内衬，是血管健康的关键守门人。高血糖诱导的内皮功能障碍是糖尿病血管病变和^{器官损伤的主要}驱动因素^3,4。高血糖水平会引发ECS内一系列不良反应，包括一氧化氮（NO）生物利用度失调、内皮素-1（ET-1）分泌增加、粘附分子表达上调（如VCAM-1、ICAM-1）、通过过量活性氧（ROS）产生（如NADPH氧化酶）引起的氧化应激增强，以及持续的低级别炎症^3,4.这些变化共同导致血管扩张受损、血管通透性增加、白细胞粘附和浸润、促血栓状态，最终导致血管重塑^5。肾小球内皮损伤破坏过滤屏障，促进白蛋白尿，直接促成细胞外基质（ECM）积累、肾小球硬化和微管间质纤维化^5,6。随后常驻肾细胞的激活，加上炎症细胞的涌入，形成恶性循环，加剧肾损伤^5,7。关键的是，临床研究表明，系统性内皮功能障碍的标志物与^{糖尿病患者白}蛋白尿的起始和进展以及肾小球滤过率（GFR）下降密切相关，^6,7,8，凸显了其与人类疾病结局的直接相关性。尽管该研究被公认为核心，但对慢性高血糖在ECS中诱导的精确转录和分泌重编程——尤其是导致ECM重塑的改变（对肾纤维化至关重要）的全面、系统层面理解仍不完全，限制了对DKD及其他糖尿病血管并发症新颖机制治疗靶点的识别 ^7,8。

糖尿病内皮功能障碍背后的深层分子复杂性对传统单靶点治疗方法构成了巨大挑战。这正是计算生物学和生物信息学作为不可或缺工具出现的地方，能够整合和挖掘多样化的高维组学数据集，以优先识别病理网络中的因果枢纽，并识别多靶向治疗^策略。关键是，传统的单一模式方法（如单转录组/蛋白质组或药理筛选）常常忽略分子层之间的关键相互作用（如基因表达、蛋白质动力学、药物反应），未能捕捉协同驱动因素或非靶点效应^10,11。集成多组学流程通过在同一系统内同时分析转录组学、分泌组学和药理学数据，克服了这些局限，从而呈现出整体的疾病机制视角。网络药理学、配体/靶标预测算法以及计算机分子对接技术允许系统性探索获批药物库，加速重新定位或发现能够抵消复杂疾病特征的化合物³.这一范式转变对于识别针对内皮失调及其毁灭性微血管后果的治疗方法（如DKD）具有特别的潜力，有望提升疗效并减少副作用。对高血糖暴露内皮细胞的转录组/分泌组分析整合，识别出534个常见上调分子。功能富集研究发现细胞外基质重塑、氧化应激和炎症与早期DKD发病机制有关。跨数据库分析优先考虑了278个高置信度目标，通过枢纽基因的PPI网络进行细化。对已批准药物的网络药理学筛选预测了85种候选化合物（包括brefeldin-A、溴雄胺素、对乙酰氨基酚和伊德拉西布）靶向这些枢纽。计算机模拟转录因子预测与对接的机制进行了探索。本研究界定了DKD的内皮驱动因素，建立了计算发现流程，并为验证提供了治疗候选方案。最终，该流程有望推动糖尿病并发症的治疗发现项目。

Protocol

动物实验经河北夷陵医学研究院动物研究伦理委员会批准（批准号：N2024082）。 请参阅材料表 ，了解本研究中使用的实验材料和仪器。人员在处理危险试剂如TRIzol（皮肤/眼睛刺激物，含酚）和蛋白酶抑制剂（潜在呼吸/皮肤敏感剂）时，必须严格佩戴适当的个人防护装备（PPE）。将生物/液体废物隔离在可高压灭菌的袋中，危险化学废物则存放在指定容器中，供机构进行危险处置。在丢弃前对消耗品进行消毒。

糖尿病肾病小鼠建模

雄性db/db和db/m小鼠（12周龄）在特定无病原体（SPF）条件下维持，环境为22±2°C，湿度5±6%，12小时光暗循环，并可 自由 获取食物和水。经过一周的高原适应期后，小鼠被随机分配数字标识并分配到实验组。DB/db小鼠被喂食高蛋白饮食6周以确立DKD。成功的模型通过尿液白蛋白与肌酐比值（UACR）显著升高相较对照组的表现得到证实，其中UACR为>30 mg/g，是早期DKD¹²的主要功能生物标志物。

高葡萄糖内皮细胞建模

人类肾小球内皮细胞（HRGEC）在标准条件下制备。HRGEC在正常葡萄糖（NG，5.5 mM D-葡萄糖）或高葡萄糖（HG，30 mM D-葡萄糖）培养基中培养，并在加湿培养箱中保持，温度为37°_C，CO2为5%。细胞要么连续暴露于HG中，要么在对照条件下培养24小时，然后进行后续分析。应包括渗透控制（HM，含5.5 mM D葡萄糖和24.5 mM甘露醇）。所有条件均应符合严格的细胞适应性标准：存活率保持≥85%，细胞凋亡水平保持在15%以下，HG的ROS增加与HM相比不超过20%，LDH释放保持在10%以下，验证了细胞完整性，随后进行后续分析。

制候介质收集

调质培养基（CM）采用标准化的分泌组分析方案¹³ 采集，并进行了修改。经过24小时的高葡萄糖（30 mM D-葡萄糖）、正常血糖（5.5 mM D-葡萄糖）或渗透控制（5.5 mM D-葡萄糖+24.5 mM甘露醇）刺激后，HRGECs被用无菌磷酸缓冲生理盐水（PBS）清洗以去除残留血清蛋白。细胞补充无血清、无酚红的基础内皮培养基，并在37°C下与5% CO₂共孵育12小时以积累分泌因子。

CM通过预冷离心管收集。采样处理按顺序进行如下描述。

主要澄清： CM被转移到无RNase/DNase的锥形管内，并在3000 x g 离心，4°C下离心10分钟。 颗粒状的碎片被丢弃。

蛋白酶抑制：在初次澄清后2分钟内，加入无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒，最终浓度为1倍（1：50），含1倍磷酸酶抑制剂。

专注方向： 上清液立即装入预冲洗的PBS离心滤器（3千达尔MWCO），并在4,000 x g 离心90分钟、4°C下达到10倍浓度。

二次澄清： 浓缩液被转移到预冷的微离心管中，并在4°C下以12,000 x g 离心15分钟。 收集上清液，避免了沉淀骨灰。

存储： 在无菌低蛋白结合冷冻容器中制成50微升容量的分量样品。这些小瓶在收获完成后30分钟内被液氮快速冷冻。小瓶保存温度为-80°C（无冻融循环）。

CM批次接受内毒素检测（<0.25 EU/mL）。无血清培养方案显示无应激诱导（经HSP70/CHOP免疫印迹验证）。采集时CM蛋白产量已归一为可存活的细胞计数/DNA含量。处理严格性保持：全程无菌技术;≤采收到冷冻时间窗口30分钟;转子温度平衡确认。

调节培养基处理肾小管细胞的CCK-8检测法

为评估内皮分泌组对肾小管细胞存活性的功能影响，对采用人类肾肾小球内皮细胞（HRGECs）衍生CM处理的人类肾近端管状上皮细胞系HK-2进行了CCK-8检测，符合既定方案。HK-2细胞在DMEM培养基中培养，辅以10%胎儿牛血清（FBS）。在该检测过程中，细胞被以每孔5 x 10³细胞密度的96孔板中播种。在CM治疗前，细胞在含0.5% FBS的培养基中进行了12小时的血清缺氧。

CM应用时总归一化蛋白质质量相等。冷冻CM分量在37°C干浴（<5分钟）下解冻，并通过10,000 x g 离心、4°C离心5分钟澄清。HK-2细胞（100微升/孔）用HG-CM、NG-CM或HM-CM处理，蛋白质/DNA含量相匹配。每个条件共准备了3个生物复制品（每个条件3个技术复制）。样本在37°C与5%二氧化碳下孵育24小时。使用细胞计数套件-8评估了细胞存活能力。为此，每孔加入10微升CCK-8溶液，并在37°C下孵育1-4小时。 吸收率通过微板读取器测量为450纳米。可行性计算公式如下：

可行性（%） = [（A_sample - A_blank） / （A_baseline_control - A_blank）] x 100

氧化应激检测

通过TBA测定，细胞乙醛（MDA）水平被定量，MDA是膜脂质过氧化的主要终产物之一。细胞裂解液（1 x 10⁷ 细胞）通过在10,000 x g 离心15分钟后，将0.02 mL上清液与0.02 mL的MDA标准液一起放入样品管中。在分级中加入0.02毫升澄清剂和0.6毫升酸试剂。样品/标准样品用0.2毫升色原剂处理（对照管：加入0.2毫升50%醋酸）。在密封、混合并在100°C下培养40分钟后，样品被冷却，然后以9569 x g 离心10分钟。上清液被转移到250微升的微板上进行OD₅₃₂测量。

转录组分析

按照制造商的方案，使用TRIzol试剂分离出总RNA。分别用分光光度计和片段分析仪评估RNA数量和纯度。仅使用高质量RNA样本，RNA完整性数（RIN）> 7.0用于测序文库构建。

通过两轮基于寡果（dT）的磁珠选择，富集了聚腺苷酸化（poly（A）+）mRNA。纯化后的mRNA在94°C下使用镁基断片试剂盒，5-7分钟被断裂为200-300核苷酸。第一股cDNA合成采用逆转录酶，随后使用大 肠杆 菌DNA聚合酶I和RNase H在dUTP存在下合成第二股cDNA（以实现链特异性）。后续步骤包括端部修复、A尾连接、适配器连接以及使用磁珠选择尺寸。在PCR扩增之前，dUTP掺入的第二股链被UDG酶消化。

利用PCR构建了一个链特异性文库，插入件平均尺寸为400 ± 50 bp，条件如下：初始变性为98°C持续1分钟;在98°C下进行14个变性循环，持续10秒，在60°C退火30秒，在72°C下拉伸30秒;最后一次延长温度为72°C，持续5分钟。在Illumina平台上进行的对端150碱基测序，测序深度为每个样本≥4000万次（Q30 > 85%）。

转录组数据的生物信息学分析

原始读段的质量检查使用FastQC（v0.11.8）进行，并与HISAT2（v2.2.1）的GRCh38.p13参考基因组进行比对。转录本定量和每样本转录本组装使用StringTie（v2.1.6）执行，使用默认参数。所有组装的转录组均从单个样本合并，使用gffcompare软件（v0.12.6;gffcompare是独立工具，非StringTie的一部分，其版本已修正为通用稳定版）。使用DESeq2（v1.38.3）进行差异表达分析，使用|log2重变化（FC）阈值。> 1，伪发现率（FDR）<0.05。批次效应通过 variancePartition 包进行校正。

分泌组蛋白质组分析

CM采集自在NG、HG或HM对照条件下培养的HRGECs，采用之前描述的方法¹³ ，并对释放组分析进行了修改。细胞在刺激后用PBS洗涤，并在无血清培养基中培养12小时。CM被采集，并在3000 x g 离心10分钟（4°C）。

从每个样品中混合等量肽，然后用溶剂A（5% ACN，pH 9.8）稀释后注入柱中。肽混合物的分离使用3.5微米、4.6 x 150 300Extend-C18柱，使用二元快速分离系统完成。梯度洗脱以0.3 mL/min的流量进行：38分钟内5%至21%溶剂B（97% ACN，pH 9.8），20分钟内21.5%至40%溶剂B，2分钟内40%至90%溶剂B，90%溶剂B3分钟，5%溶剂B平衡10分钟。在214纳米处监测洗脱峰，每分钟采集一次分馏。根据洗脱峰的色谱图，组分被合并。共收集了10个分馏，随后进行冻干处理。

调制了流动相A（100%水，0.1%甲酸）和B相（80%丙腈），干燥肽样品用0.1%甲酸复原，并在20,000 x g 离心10分钟。分离采用UHPLC液相系统完成。样品送入ES906高效液相色谱柱（150毫米），梯度为8分钟，速率为2.5微升/分钟，分离时有效梯度为0-4分钟，4%流动B相线性递增至25%;4-6.9分钟，移动阶段B线性递增，从25%升至35%;6.9-7.3分钟，移动阶段B线性上升，从35%升至99%;7.3-8.0分钟，移动B相保持在99%。液相分离肽被转移到质谱仪中进行DIA模式采集。主要参数设定如下：碰撞能量归一化25%，默认电荷状态2，分辨率240,000，每0.6秒扫描一次，扫描范围380-980米/z，质谱AGC500%。破碎离子扫描记录时长最大为3毫秒，使用了300个二次扫描窗口，范围为380至980 m/z。

DIA-NN（https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x，版本1.9.1）被用于无库方法分析DIA数据。通过从Uniprot数据库下载的MS/MS数据进行MS/MS数据检索，这些序列由Uniprot数据库下载，设置如下：酶：胰蛋白酶/P;最大未击切割：2;固定修饰：氨酰甲基（C）;可变修饰：氧化（M）和乙酰（蛋白质N-项）;前体质量耐受：20 ppm;碎片质量容忍度：0.05Da。结果采用1%的FDR过滤，仅使用符合该过滤标准的蛋白基团进行后续分析。

组学功能富集分析（GO、KEGG和GSEA）

在经过筛选的差异表达基因（转录组学）和蛋白质（分泌蛋白组学）集合上进行了功能富集分析，遵循既定的生物信息学流程。标识符通过Org.Hs.eg.db映射。通过clusterProfiler实现了生物过程、分子功能、细胞组分的富集。Benjamini-Hochberg 调整 p 值< 0.05，并对凝约项应用语义相似度降低（截断=0.7）。KEGG通路分析使用KEGG REST API（HAS，2023年版本）进行。采用了高几何测试，配合耶库蒂埃利FDR修正。路径拓扑可视化是用Pathview完成的。GSEA采用基于秩的方法和信噪基因排序法。对MSigDB集合（HALLMARK， C2， C5;v2023.2）进行了测试富集，并收集了精选的糖尿病内皮特征。在1000个表型排列后评估显著性（FDR为25%<）。

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

为了识别病原候选池中的核心分子调控因子，采用了综合计算流程，进行了PPI网络构建和拓扑分析。278个候选基因被提交到STRING数据库（v12.0;智 人;证据来源包括实验数据库、共表达数据库和策划数据库;高置信边的交互置信度（综合得分）阈值>0.7;且无额外的相互作用膨胀。结果被导入 Cytoscape（v3.9.1），并使用 MCODE（v1.5.2）和 CytoHubba（v0.4.1）插件进行网络拓扑分析。随后，网络根据节点连接程度进行了视觉优化，使得连接性较高的节点颜色更深、体积更大、标签更突出。

糖尿病肾病靶基因集的开发

共上调mRNA/蛋白的标准定义如下：转录组（FDR < 0.05和|log2FC| >1）和分泌组（FDR < 0.01和|log2FC| > 1.5）。蛋白质和基因名通过UniProt进行归一化，并转换为统一格式（基因符号）。通过整合多个公共数据库中的疾病相关基因，构建了糖尿病肾病的靶基因集，包括GeneCards（版本5.25，查询词：糖尿病肾病，访问日期2025年7月）、比较毒理基因组学数据库（CTD;https://ctdbase.org/，查询词：糖尿病肾病，访问日期2025年7月）和Open Targets Platform（https://platform.opentargets.org/，版本0.13.8，查询词：糖尿病肾病，访问日期2025年7月） 13,14,15。该系统被指定为综合糖尿病肾病参考集。共上调的mRNA/蛋白质与该基因组的交汇点被识别出来，用于后续分析。

CCL2蛋白检测

为定量CCL2,96孔板涂覆捕获抗体（100微升/孔），并在4°C下过夜孵育。次日，用2倍缓冲液清洗平板，并用ELISA稀释剂（200微升/孔）在RT下封闭1小时。通过对S1标准品进行2倍序列稀释制得7点标准曲线，然后加入样品（100微升/孔）并以400转/分钟孵育2小时。清洗5次后，加入检测抗体（100微升/孔），在400转/分钟下培养1小时，随后加入酶溶液（100微升/孔），并以400转/分钟培养30分钟。样品采用TMB底物（15-30分钟，RT）冲洗。反应在酸性（100微升/孔）时停止，吸收度读数为450纳米（620纳米可选）。关键步骤包括严格清洗、定时孵育和标准化稀释，以确保可重复性。

药物重新定位

治疗性化合物的预测使用以下平台：LINCS L1000特征方向特征特征搜索引擎（L1000CDS2;https://maayanlab.cloud/L1000CDS2）。该平台采用MODZ方法和特征方向分析，识别能够逆转或模拟输入基因表达特征的小分子或化合物组合¹⁶。候选药物被确定为利用该平台逆转差异表达肾基因失调的药物。这些化合物根据组织柱中特定肾脏在肾细胞系中的逆转分数进行排名，排名最高的候选者则通过分子连接分析其与关键蛋白靶点的结合亲和力。

协调转录因子筛选

查询了hTFtarget数据库对基因集的共调控TFsbind。通过计算分析跨细胞、组织和疾病的大规模ChIP-Seq数据集，分析hTFtarget数据库，识别人类转录因子（TF）与靶向基因之间的关系。整合管线将ChIP-Seq峰值信号与表观遗传情境结合，精确定位启动子/增强子中的TF结合，明确解释时空调控动态。正如 Zhang 等人展示的，它作为一个多维平台，支持探索TF靶点或基因调控因子、ChIP-Seq数据可视化、TF合作度研究以及^结合位点的预测。

小分子-蛋白质对接的计算流程和分析

AutoDock Vina 1.2.0¹⁸ 用于对活性成分与转录因子BRD4、CTCF、EP300和SPI1之间的结合相互作用进行分子对接分析。BRD4（PDB ID：7REK）、CTCF（PDB ID：5K5I）、EP300（PDB ID：5NU5）和SPI1（PDB ID：8E3K）的晶体结构来自蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）^19,20。SDF格式的小分子结构从PubChem数据库下载（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ²¹，使用Open Babel 2.4.1转换为MOL2格式，并用PyRx 0.8进行能量最小化处理）。蛋白质预处理通过去除水分子、添加氢原子、计算加斯泰格电荷并将其转换为PDBQT格式（AutoDock Vina所需）来完成。采用了半灵活的对接策略，根据每个蛋白质中共结配体的结合位点定义对接网格的位置和尺寸。MA9-086作为BRD4的阳性对照配体，以及EP300的XDM-CBP配体。对于CTCF和SPI1（缺乏已知正配体），通过Proteins Plus在线平台（https://proteins.plus/）结构分析识别了潜在结合口袋。对接网格参数设置如下（坐标和尺寸为Å，沿x、y、z轴）：BRD4中心为（-11.907， -8.617， -3.973），盒大小为（18.387， 18.387， 18.387）;CTCF中心尺寸为（15.165、4.854、6.388）和盒型尺寸（17.25、20.25、9.75）;EP300中心（39.781、5.326、9.998）和盒装尺寸（16.516、16.516、16.516）;SPI1中心为（3.155，-3.853,0.668），盒大小为（17.25,25.5,10.5）。对接时，能量范围设置为3，穷尽参数为8，栅格间距为0.375埃。结合稳定性从结合能评估，较低值表示构象更稳定且相互作用概率较高，强结合活性定义阈值为<-5 kcal/mol^22,23。最后，利用PyMOL鉴定了化合物与受体之间的相互作用模式。

统计分析

数据以SEM±均值呈现。统计检验基于正态性（Shapiro-Wilk）和方差均质性（Levene检验）选择。组间比较采用了两组未配对t检验或单向方差分析加LSD事后检验（≥组3组）。p<0.05被定义为显著性阈值。图表使用GraphPad Prism 9.0生成。

Results

高血糖内皮分泌物对肾小管致病影响的证明

本研究始于验证高血糖内皮分泌组的致病效应。与对照组相比，高血糖人类肾小球内皮细胞（HG-CM）的调控培养基显著降低了人类近端小管上皮细胞（HK-2）的存活能力。

基于这些功能性证据，进行了综合糖尿病肾转录组和高葡萄糖治疗内皮分泌组分析（LC-MS/MS OF HG-CM）。该研究鉴定出一组协调上调的致病基因及其相应分泌蛋白。利用这些常见的致病靶点，L1000CDS2化合物文库被计算筛选出预测会功能性下调其表达或活性的药物。同时，利用转录因子（TF）数据库识别出调控这些致病靶的关键转录因子。通过分子对接进行计算机辅助筛选，评估候选再利用化合物对致病TFs的结合潜力。最后，应通过qPCR（mRNA水平）和ELISA（分泌蛋白产物）验证TFs下游致病基因的表达，确认...

Discussion

本研究通过综合多组学和计算方法，确立了高血糖诱导的内皮分泌组功能障碍作为糖尿病肾损伤的关键驱动因素。证明，分泌组介导的肾小管细胞毒性与534个内皮衍生因子的系统失调一致，这些因子在DKD发病机制中趋同于基质重塑、氧化应激和炎症核心通路。鉴定出278个高置信介导因子，包括机制验证的CCL2、VWF、SERPINE1和THBS1（表现出1.15至2630倍的共上调），通过绘制内皮转录重编程如何转化为分泌促纤维化、促炎效应物，解决了一个关键知识空白^26,33。特别值得注意的是CCL2（MCP-1），这是一种强效趋化因子，负责协调单核细胞/巨噬细胞向肾组织的招募。临床和实验证据一致表明CCL2是糖尿病肾损伤进展的主要介质，其过度表达会加重白蛋白尿、间质性炎症和微管间质纤维化^34,35。这里观察到的CCL2诱导极高，可能反映了其在建立促进糖尿病肾脏...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCL2 ELISA 套件	赛莫飞世尔科学	#88-7399-88
CCR2抑制剂	默克米利波尔	#227016
细胞存活能力检测套件	七项生物技术	CCK-8，SC119-01
DNA测序仪	光辉	NovaSeq 6000
高性能液相色谱系统	赛莫飞世尔科学	UltiMate 3000 二进制 RSLC
HRGECs培养基	上海中中桥鑫周生物技术有限公司	1001
人类肾肾小球内皮细胞（HRGEC）	上海中桥新州生物技术	PRI-H-00038
人类肾脏管上皮细胞完整培养基	Procell	CM-H193
人体肾脏管上皮细胞（HK2）	Procell	CP-H193
公性DB/DB和db/m小鼠（4周大）	杭州紫源生物科技有限公司	SCXK 20190004
质谱仪	赛莫飞世尔科学	星界
微板吸收读器	分子器件	SpectraMax iD5
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（无EDTA）	罗什	cOmplete，#5056489001
RNA提取试剂	赛莫飞世尔科学	TRIzol，#15596026
RNA质量分析仪	安捷伦科技	5300碎片分析仪，M5311AA
RNA定量仪器	赛莫飞世尔科学	量子比特3.0，Q33216
ROS检测套件	赛莫飞世尔科学	#EEA019
超滤离心装置（3千道散MWCO）	默克米利波尔	阿米康Ultra-4