本方案建立了一种整合的多组学流程（转录组和蛋白质组），并结合网络药理学筛选，以鉴定糖尿病并发症中内皮功能障碍的分子驱动因素和治疗靶点。
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研究文章
* These authors contributed equally
本方案建立了一种整合的多组学流程（转录组和蛋白质组），并结合网络药理学筛选，以鉴定糖尿病并发症中内皮功能障碍的分子驱动因素和治疗靶点。
内皮功能障碍是糖尿病肾病（DKD）的关键驱动因素，但其系统性分子机制尚未完全阐明。我们假设，整合多组学分析能够描绘高糖诱导的内皮损伤图谱，并识别可重复利用的治疗药物。本研究应用一个可重复使用的计算流程，整合了高糖处理的内皮细胞和糖尿病肾脏的转录组/分泌组数据。该分析鉴定出534个共同上调的基因/蛋白质。功能富集分析显示，细胞外基质重塑、细胞间通讯和炎症通路被激活。通过跨数据库验证，筛选出278个高置信度的中介分子，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步确定了十个核心基因。利用网络药理学方法，我们筛选了一个已批准药物库，鉴定出多个可能靶向该网络的候选化合物（例如，布鲁山素 bruceantin、艾代拉里斯 idelalisib）。此外，转录因子调控分析及示例性的分子对接模拟（例如，艾代拉里斯与CTCF/BRD4的结合）为后续实验验证提供了机制假说。综上所述，本研究建立了一个可重复使用的多组学分析框架，阐明了DKD中内皮致病机制，并提出了可再利用的候选药物，为机制探索与治疗发现提供了战略性方法。
糖尿病作为一种全球性健康挑战，2021年全球患者人数达5.29亿，预计到2050年将影响13.1亿人1。除血糖控制外，长期并发症是导致发病率、死亡率上升及生活质量下降的主要原因。这些并发症包括微血管并发症（如糖尿病肾病（DKD）、视网膜病变、神经病变）和大血管并发症（如加速动脉粥样硬化）。其中，糖尿病肾病影响约30%至40%的糖尿病患者，是全球终末期肾病（ESRD）的首要病因2。这些并发症带来的巨大负担凸显了针对其潜在机制开发新型疗法的迫切未满足需求。
内皮细胞（ECs）构成所有血管的内衬，是维持血管健康的关键守门人。高血糖诱导的内皮功能障碍是糖尿病性血管病变和器官损伤的核心驱动因素3,4。高葡萄糖水平在ECs内触发一系列适应不良的反应，包括一氧化氮（NO）生物利用度失调、内皮素-1（ET-1）分泌增加、黏附分子表达上调（如VCAM-1、ICAM-1）、通过过量产生活性氧（ROS）（例如通过NADPH氧化酶）导致氧化应激增强，以及持续的低度炎症3,4。这些改变共同导致血管舒张功能受损、血管通透性增加、白细胞黏附与浸润、促血栓状态，最终引发血管重塑
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动物实验已获得河北以岭医药研究院动物研究与伦理委员会的批准（批准编号：N2024082）。有关本研究中使用的实验材料和仪器，请参见材料表。操作TRIzol（皮肤/眼睛刺激物，含苯酚）和蛋白酶抑制剂（可能引起呼吸道/皮肤致敏）等有害试剂时，人员必须严格穿戴适当的个人防护装备（PPE）。生物性/液体废物应放入可高压灭菌的袋子中，有害化学废物应放入指定容器，交由机构进行有害废物处理。耗材在丢弃前须进行去污处理。
糖尿病肾病小鼠模型构建
雄性 db/db 和 db/m 小鼠（12 周龄）在温度为 22 ± 2 °C、湿度为 56% ± 5% 的特定无病原体（SPF）环境中饲养，光照周期为 12 小时明暗交替，并可自由摄食和饮水。ad libitum 经过 1 周的适应期后，小鼠被随机分配数字编号，并分入不同的实验组。db/db 小鼠接受高蛋白饮食喂养 6 周，以建立糖尿病肾病（DKD）模型。通过尿白蛋白与肌酐比值（UACR）显著高于 db/m 对照组来确认建模成功，其中 UACR >30 mg/g 作为早期 DKD 的主要功能性生物标志物12。
高葡萄糖内皮细胞建模
人肾小球内皮细胞（HRGECs）在标准化条件下进行制备....
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高血糖内皮细胞分泌组对肾小管致病作用的演示
本研究首先验证了高血糖内皮细胞分泌组的致病效应。与对照组相比，高血糖人肾小球内皮细胞（HG-CM）的条件培养基显著降低了人近端肾小管上皮细胞（HK-2）的存活率。
在上述功能证据的基础上，整合了糖尿病肾病的转录组数据以及高糖处理的内皮细胞分泌组分析（高糖条件培养基的LC-MS/MS检测），鉴定出一组表达一致上调的核心致病基因及其相应的分泌蛋白。基于这些共有的致病靶点，利用L1000CDS2化合物库进行计算筛选，以寻找可预测功能性下调这些靶点表达或活性的候选药物。同时，通过转录因子（TFs）数据库筛选出调控上述致病靶点的关键转录因子，并采用分子对接的计算机辅助方法，评估候选再利用化合物与致病性转录因子之间的结合潜力。最后，应通过qPCR（检测mRNA水平）和.......
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本研究通过整合多组学与计算方法，确立了高血糖诱导的内皮细胞分泌组功能障碍是糖尿病肾损伤的关键驱动因素。研究证实，分泌组介导的对肾小管的细胞毒性作用伴随着534种内皮源性因子的系统性失调，这些因子汇聚于细胞外基质重塑、氧化应激和炎症——这些正是糖尿病肾病（DKD）发病机制的核心通路。研究鉴定了278个高置信度的介导分子，包括经机制验证的关键枢纽分子CCL2、VWF、SERPINE1和THBS1（共上调1.15至2630倍），填补了关键知识空白，阐明了内皮细胞转录重编程如何转化为分泌型促纤维化和促炎效应分子。26,33尤其值得注意的是CCL2（MCP-1），它是一种强效趋化因子，可调控单核细胞/巨噬细胞向肾组织的募集。临床与实验研究一致表明，CCL2是介导糖尿病肾损伤进展的核心因子，其过表达会加重蛋白尿、间质性炎症以及肾小管间质纤维化。34,35此处观察到的CCL2诱导幅度异常显著，可能反映了其在建立促进炎症.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到国家自然科学基金（32200644）、河北省科技计划项目（246W2501D，252W7716D）和燕赵金台（A20240022）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CCL2 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #88-7399-88 | |
| CCR2抑制剂 | Merck Millipore | #227016 | |
| 细胞活力检测试剂盒 | Seven Biotechnology | CCK-8, SC119-01 | |
| DNA测序仪 | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| 高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | UltiMate 3000 Binary RSLC | |
| 人肾小球内皮细胞培养基 | 上海中乔新舟生物科技有限公司 | 1001 | |
| 人肾小球内皮细胞（HRGECs） | 上海中乔新舟生物科技 | PRI-H-00038 | |
| 人肾小管上皮细胞完全培养基 | Procell | CM-H193 | |
| 人肾小管上皮细胞（HK2） | Procell | CP-H193 | |
| 雄性db/db和db/m小鼠（4周龄） | 杭州紫源生物科技有限公司 | SCXK 20190004 | |
| 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | Astral | |
| 微孔板吸光度读数仪 | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA） | Roche | cOmplete, #5056489001 | |
| RNA提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | TRIzol, #15596026 | |
| RNA质量分析仪 | Agilent Technologies | 5300 Fragment Analyzer, M5311AA | |
| RNA定量仪 | Thermo Fisher Scientific | Qubit 3.0, Q33216 | |
| 活性氧检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | #EEA019 | |
| 超滤离心管（3 kDa截留分子量） | Merck Millipore | Amicon Ultra-4 |
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