单细胞组蛋白翻译后修饰（sc-hPTM2）多复分析的自动样品制备

Summary

本文介绍了一种采用同位素双链标记策略和ArgC消化，实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析的自动化方案。该工作流程使得染色质异质性和表观遗传反应的定量、可重复且高灵敏度的剖析成为可能，且分辨率为单细胞。

Abstract

组蛋白翻译后修饰（hPTMs）是染色质组织和基因表达的核心调控因子。它们的失调与发育、癌症和衰老有关。虽然质谱法是研究hPTM的首选方法，但大多数方案设计用于散装样品，无法解析细胞间的变异性。因此，将组蛋白PTM分析扩展到单细胞层面至关重要，但技术上具有挑战性，因为组蛋白数量低、赖氨酸丰富且经过严重修饰。

本文介绍了利用纳米液体处理进行组蛋白PTM分析的自动化单细胞蛋白质组学工作流程。该系统实现纳米级细胞的处理，作最小且重复性高。工作流程包括使用ArgC Ultra蛋白酶消化，该酶能切割精氨酸残基，避免组蛋白蛋白质组学中通常需要的赖氨酸阻断衍生化步骤。为实现条件间的定量比较，我们采用了双重标记策略，使用丙酸酐及其氘化类似物丙酸酐-d10。这种自动样品制备、同位素复用和ArgC Ultra消化的结合，使单细胞组蛋白PTM分析流程更简洁且灵敏。

该方法能够研究染色质的异质性以及表观遗传扰动在单细胞分辨率下的影响。为演示该工作流程，我们从肝细胞癌细胞中生成球状体，并用丁酸钠处理，这是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可诱导高乙酰化。

Introduction

组蛋白是核小体的蛋白质组成部分，核小体是染色质的重复单位。其N端尾部富含赖氨酸和精氨酸残基，且高度受翻译后修饰（PTMs）调控，如乙酰化、甲基化和磷酸化。这些修饰影响DNA的可及性，从而影响转录、复制和修复等控制过程。组蛋白PTM模式的改变与疾病状态密切相关，从癌症到神经退行性变性，^1,2。因此，组蛋白PTM分析在表观遗传学和蛋白质组学研究中备受关注。质谱（MS）提供组蛋白修饰的部位特异性和定量分析，但组蛋白带来了独特的分析挑战。它们的氨基酸组成、多修饰位点以及复杂的组合模式使得它们比普通蛋白质更难分析。既有的方案依赖化学衍生物阻断赖氨酸残基，从而在消化前改善肽回收率和色^{谱性能 3}.虽然在大批量分析中有效，但这些多步衍生化协议可能会引入对单胞体输入来说存在问题的损耗。单细胞分析日益重要，因为生物系统本质上具有异质性。体组蛋白分析了许多细胞的平均信号，因此无法捕捉这种变异性。细胞的亚群体在染色质状态上可能存在差异，这些差异可以驱动发育、细胞重编程或药物反应 ^4,5。

本文介绍一种用于多重单细胞组蛋白PTM分析（sc-hPTM2）的自....

Protocol

1. 缓冲剂和试剂

1. HepG2/C3A细胞培养基：准备Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM，4.5g/L葡萄糖），含10%胎儿牛血清（FBS）、非必需氨基酸（1% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）和青霉素/链霉素（0.5% v/v）。培养基储存在4°C。
2. 主混合液：在LC-MS级水中制备ArgC Ultra 60 ng/μL，HEPES 6 mM，n-十二烷基-β-麦芽苷（DDM）0.03%，二硫环醇（DTT）10 mM，液质素级水。
3. HA溶液：在LC-MS级水中制备1%（v/v）羟胺。
4. 洗涤液：准备10毫升50：50的乙腈/水混合物，含0.1%（含水/水）甲酸（均为LC-MS级）。
5. 流动A相（MPA）- 0.1%甲酸：将1毫升浓缩甲酸加入999毫升高效液相色谱级水中，充分混合。
6. 移动B相（MPB）- 80% HPLC 级乙酰腈 + 0.1% 甲酸：将800毫升HPLC级乙酰腈加入199毫升 HPLC 级水中。接着，加入1毫升浓甲酸并混合。

2. 球体制备

1. 关于球状体的制备，请参见Stransky S等人¹¹页。
....

Results

为了演示单细胞组蛋白组学工作流程的应用，我们分析了用5 mM丁酸钠处理的HepG2/C3A细胞球体，持续24小时。采集LC-MS/MS后，原始数据使用EpiProfile处理，分别进行轻度（丙酸酐）和重度（丙酸酐-d10）标记，获得代表肽和组蛋白标记丰度的归一化数据。随后，QuantQC R封装被用来将液体处理机的采集元数据映射到EpiProfile输出，以获取每个细胞的肽含量和相关丰度信息，然后过滤掉至少50%单细胞中检测不一致的肽形态，并排除单细胞强度信号不超过空白细胞150%信号的肽形态。随后通过log（1+x）变换对数据进行归一化，得到用于下游分析的结果表，该表包括一列列出各种肽形态和每个单元格的列，显示各识别肽形态的丰度。

图7A 展示了结果表中代表性的子集，包含前20种组蛋白H3肽形态的定量。这些数值以对照组和丁酸钠处理条件下的相对丰度表示。本概述强调了该工作流程如何以单细胞分辨率检测多种PTM状态，包括甲基化、乙酰化和组合标记。例如，H3K9ac和H3K14ac在丁酸钠处理后均表现出相对丰度增加，这与预期抑制.......

Discussion

能够在单细胞层面测量组蛋白翻译后修饰，是理解染色质调控真正异质性的关键一步。传统的体检方法为hPTMs在组织中的平均分布提供了宝贵的见解，但它们掩盖了细胞间的变异性，而这种变异性越来越被认可为生物学^意义5。单细胞蛋白质组学方法使我们能够解析这一隐藏的复杂层面，揭示可能支撑基因调控差异、细胞可塑性和疾病脆弱性的独特染色质^状态4。组蛋白修饰特别适合单细胞探测，因为它们编码了指导转录结果的组合信息¹³。例如，H3K9ac和H3K14ac标记同时存在，比单个标记¹⁰更能指示转录激活。以单细胞分辨率捕捉此类共现模式，是描述染色质地貌及其动态的新视角。

尽管有这些优势，单细胞组蛋白PTM分析在技术上仍然具有挑战性。局限性包括极低的蛋白质输入、需要精确的样本处理，以及难以区分技术噪声与生物噪声⁵

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5毫升微离心管	生物辐射	2239480
1000 和微型;L宽管径移液头头	费舍尔科学	14222703
200 和微型;L宽管径移液头头	费舍尔科学	14222730
384孔PCR板Lo Bind	埃彭多夫	30129547
96孔真空歧管	米利波尔	MAVM0960R
乙腈，Optima LC-MS/MS 级	费舍尔科学	A955-1
粘着性PCR板箔	赛莫飞舍尔	AB0626
无水乙腈	费舍尔科学	AA42311AK	标签：散装用的原装溶液
Arg-C Ultra，质谱级	普罗梅加	VA1831
细胞培养级水	科宁	25-055-CV
CellenVIALs（玻璃瓶）	风景	/	目录号附带引言
DMSO，无水	赛莫飞舍尔	D12345	标签 库存溶液
数字地面电视	西格玛	D0632-5G
杜尔贝科改良鹰中型（DMEM）	费舍尔科学	MT17205CV
胎牛血清	费舍尔科学	MT35010CV
甲酸	热力学	28905
甲酸98%–100%支持LC-MS LiChropur	西格玛	5330020050
汉克的平衡盐溶液（HBSS）	费舍尔科学	MT21022CV
HEPES（超纯）	赛莫飞舍尔	11344041
高效液相色谱级乙腈	费舍尔科学	A955-4
高效液相色谱级水	费舍尔科学	W5-4
羟胺溶液在H2O中	西格玛	438227-50ML
L-谷氨酰胺	费舍尔科学	MT25015CI
正十二烷基-β麦芽苷（DDM）洗衣粉	费舍尔科学	BN2005
非必需氨基酸	费舍尔科学	MT25025CI
Orbitrap Exploris 480质谱仪	赛莫飞舍尔	BRE725539
16%水溶液对甲醛电磁级	电子显微镜科学	15710-S
PDC-CM（2型涂层）	风景	/	目录号附带引言
青霉素-链霉素	费舍尔科学	MT3002CI
磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），10x，pH值7.4，无RNase	赛莫飞舍尔	AM9625
Pierce二甲基亚砾（DMSO），LC-MS级	赛莫飞舍尔	85190
移液枪	埃彭多夫	Z666467（米利波尔西格玛）
丙酸酐 & ge;99%	西格玛	240311-50G
丙酸酐-d10 ≥98 原子 % D， & ge;99%（同党）	西格玛	615692-1G
冷藏离心机	热力学	75-217-420
SciCHIP H1涂层玻璃滑板	风景	/	目录号附带引言
SpeedVac真空浓缩器（96孔板）	热力学	15308325	天才SPD1010
无菌罩	热力学	1375
无菌血清移液器	费舍尔科学	1367549
SYTOX 绿色死细胞染色法，用于流式细胞术	赛莫飞舍尔	S34860
TrypLE表达酶（1X），无酚红	赛莫飞舍尔	12604013
漩涡	西格玛	Z258415
水浴	费舍尔科学	FSGPD10