本文介绍了一种采用同位素双链标记策略和ArgC消化,实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析的自动化方案。该工作流程使得染色质异质性和表观遗传反应的定量、可重复且高灵敏度的剖析成为可能,且分辨率为单细胞。
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本文介绍了一种采用同位素双链标记策略和ArgC消化,实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析的自动化方案。该工作流程使得染色质异质性和表观遗传反应的定量、可重复且高灵敏度的剖析成为可能,且分辨率为单细胞。
组蛋白翻译后修饰(hPTMs)是染色质组织和基因表达的核心调控因子。它们的失调与发育、癌症和衰老有关。虽然质谱法是研究hPTM的首选方法,但大多数方案设计用于散装样品,无法解析细胞间的变异性。因此,将组蛋白PTM分析扩展到单细胞层面至关重要,但技术上具有挑战性,因为组蛋白数量低、赖氨酸丰富且经过严重修饰。
本文介绍了利用纳米液体处理进行组蛋白PTM分析的自动化单细胞蛋白质组学工作流程。该系统实现纳米级细胞的处理,作最小且重复性高。工作流程包括使用ArgC Ultra蛋白酶消化,该酶能切割精氨酸残基,避免组蛋白蛋白质组学中通常需要的赖氨酸阻断衍生化步骤。为实现条件间的定量比较,我们采用了双重标记策略,使用丙酸酐及其氘化类似物丙酸酐-d10。这种自动样品制备、同位素复用和ArgC Ultra消化的结合,使单细胞组蛋白PTM分析流程更简洁且灵敏。
该方法能够研究染色质的异质性以及表观遗传扰动在单细胞分辨率下的影响。为演示该工作流程,我们从肝细胞癌细胞中生成球状体,并用丁酸钠处理,这是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可诱导高乙酰化。
组蛋白是核小体的蛋白质组成部分,核小体是染色质的重复单位。其N端尾部富含赖氨酸和精氨酸残基,且高度受翻译后修饰(PTMs)调控,如乙酰化、甲基化和磷酸化。这些修饰影响DNA的可及性,从而影响转录、复制和修复等控制过程。组蛋白PTM模式的改变与疾病状态密切相关,从癌症到神经退行性变性,1,2。因此,组蛋白PTM分析在表观遗传学和蛋白质组学研究中备受关注。质谱(MS)提供组蛋白修饰的部位特异性和定量分析,但组蛋白带来了独特的分析挑战。它们的氨基酸组成、多修饰位点以及复杂的组合模式使得它们比普通蛋白质更难分析。既有的方案依赖化学衍生物阻断赖氨酸残基,从而在消化前改善肽回收率和色谱性能 3.虽然在大批量分析中有效,但这些多步衍生化协议可能会引入对单胞体输入来说存在问题的损耗。单细胞分析日益重要,因为生物系统本质上具有异质性。体组蛋白分析了许多细胞的平均信号,因此无法捕捉这种变异性。细胞的亚群体在染色质状态上可能存在差异,这些差异可以驱动发育、细胞重编程或药物反应 4,5。
本文介绍一种用于多重单细胞组蛋白PTM分析(sc-hPTM2)的自动样本制备方法。该方法依赖CellenONE系统,能够以自动化方式精确分配单个细胞和纳米级试剂。该方法是纳米蛋白质组样品制备(nPOP)方法的变体,nPOP首次在玻璃载玻片6上引入了液滴制备。nPOP平台具备先进的自动化单细胞蛋白质组学技术,但其标准的胰蛋白消化方案因组蛋白含量高且修饰密度高,对组蛋白来说并不理想。我们对CellenONE系统进行了调整,纳入了金标准的组蛋白衍生法,并引入了同位素标记,实现了单细胞分辨率下对组蛋白翻译后修饰的准确和全面定量。具体来说,我们通过使用ArgC超蛋白酶进行蛋白质消化,简化了该方案。与胰蛋白酶不同,ArgC仅在精氨酸残基处切割,无需赖氨酸阻断。这消除了两步衍生策略的需求,简化了协议。此外,该方法采用了使用丙酸酐和丙酸酐-d10的双重同位素标记方案,允许同时分析两个细胞7,3。消化和标记后,单细胞样品通过液相色谱-质谱(LC-MS)/MS(数据无关采集DIA)进行回收和分析。在我们手中,该方法已被证明比之前版本的组蛋白PTMs在定量方面提供了更高的灵敏度和重复性8。
为验证该方法,我们分析了源自HepG2/C3A肝细胞癌细胞的球体中单细胞组蛋白PTM动态。我们用丁酸钠处理这些球状体,丁酸钠是一种经过充分研究的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,能增加组蛋白乙酰化,并作为探测染色质调控的基准指标9,10。通过单细胞分辨率比较对照组和丁酸钠处理球体,我们展示了具有代表性的原理验证,凸显了在染色质生物学和癌症表观遗传学中更广泛应用的潜力。值得注意的是,关于该方案,我们参考了之前的一篇关于三维球体10的生长和处理、质谱11中组蛋白肽获取以及使用EpiProfile12软件进行数据分析的相关论文。
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1. 缓冲剂和试剂
2. 球体制备
3. 细胞培养与处理
4. 细胞分离与单细胞悬浮制备
5. 软件连接与系统初始化
6. 液体处理机的预运行配置
7. 在滑套边缘施加二甲基亚硫酸盐(DMSO)“护城河”
注: 图3B 代表了从DMSO护城河开始在cellenONE中准备样品的步骤。为防止液滴蒸发,DMSO会沿载玻片边缘喷洒。
8. DMSO发放
9. 细胞分配
10. 消化主混合分配
11. 过夜潜伏
12. 蒸发
注意:在进入标记步骤前,建议检查水滴的状况,确保水肿胀过多,因为水可能会干扰标签的效率。为此,建议采用蒸发阶段。
13. 标签分配
14. HA分配
15. 样品取件
16. 取货后处理
17. 散装样品制备
18. LC/MS的设置与数据采集
注:为收集本稿数据,采用LC-MS\MS系统,配备离子光学75微米内径 x 25厘米 x 1.7微米分析柱。
19. 数据分析
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为了演示单细胞组蛋白组学工作流程的应用,我们分析了用5 mM丁酸钠处理的HepG2/C3A细胞球体,持续24小时。采集LC-MS/MS后,原始数据使用EpiProfile处理,分别进行轻度(丙酸酐)和重度(丙酸酐-d10)标记,获得代表肽和组蛋白标记丰度的归一化数据。随后,QuantQC R封装被用来将液体处理机的采集元数据映射到EpiProfile输出,以获取每个细胞的肽含量和相关丰度信息,然后过滤掉至少50%单细胞中检测不一致的肽形态,并排除单细胞强度信号不超过空白细胞150%信号的肽形态。随后通过log(1+x)变换对数据进行归一化,得到用于下游分析的结果表,该表包括一列列出各种肽形态和每个单元格的列,显示各识别肽形态的丰度。
图7A 展示了结果表中代表性的子集,包含前20种组蛋白H3肽形态的定量。这些数值以对照组和丁酸钠处理条件下的相对丰度表示。本概述强调了该工作流程如何以单细胞分辨率检测多种PTM状态,包括甲基化、乙酰化和组合标记。例如,H3K9ac和H3K14ac在丁酸钠处理后均表现出相对丰度增加,这与预期抑制...
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能够在单细胞层面测量组蛋白翻译后修饰,是理解染色质调控真正异质性的关键一步。传统的体检方法为hPTMs在组织中的平均分布提供了宝贵的见解,但它们掩盖了细胞间的变异性,而这种变异性越来越被认可为生物学意义5。单细胞蛋白质组学方法使我们能够解析这一隐藏的复杂层面,揭示可能支撑基因调控差异、细胞可塑性和疾病脆弱性的独特染色质状态4。组蛋白修饰特别适合单细胞探测,因为它们编码了指导转录结果的组合信息13。例如,H3K9ac和H3K14ac标记同时存在,比单个标记10更能指示转录激活。以单细胞分辨率捕捉此类共现模式,是描述染色质地貌及其动态的新视角。
尽管有这些优势,单细胞组蛋白PTM分析在技术上仍然具有挑战性。局限性包括极低的蛋白质输入、需要精确的样本处理,以及难以区分技术噪声与生物噪声5
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J.C. 是 SCIENION 美国公司的员工。
我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院分子细胞遗传学核心的伯尼斯·莫罗博士和山智东博士维护了CellenONE仪器。
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 1.5毫升微离心管 | 生物辐射 | 2239480 | |
| 1000 和微型;L宽管径移液头头 | 费舍尔科学 | 14222703 | |
| 200 和微型;L宽管径移液头头 | 费舍尔科学 | 14222730 | |
| 384孔PCR板Lo Bind | 埃彭多夫 | 30129547 | |
| 96孔真空歧管 | 米利波尔 | MAVM0960R | |
| 乙腈,Optima LC-MS/MS 级 | 费舍尔科学 | A955-1 | |
| 粘着性PCR板箔 | 赛莫飞舍尔 | AB0626 | |
| 无水乙腈 | 费舍尔科学 | AA42311AK | 标签:散装用的原装溶液 |
| Arg-C Ultra,质谱级 | 普罗梅加 | VA1831 | |
| 细胞培养级水 | 科宁 | 25-055-CV | |
| CellenVIALs(玻璃瓶) | 风景 | / | 目录号附带引言 |
| DMSO,无水 | 赛莫飞舍尔 | D12345 | 标签 库存溶液 |
| 数字地面电视 | 西格玛 | D0632-5G | |
| 杜尔贝科改良鹰中型(DMEM) | 费舍尔科学 | MT17205CV | |
| 胎牛血清 | 费舍尔科学 | MT35010CV | |
| 甲酸 | 热力学 | 28905 | |
| 甲酸98%–100%支持LC-MS LiChropur | 西格玛 | 5330020050 | |
| 汉克的平衡盐溶液(HBSS) | 费舍尔科学 | MT21022CV | |
| HEPES(超纯) | 赛莫飞舍尔 | 11344041 | |
| 高效液相色谱级乙腈 | 费舍尔科学 | A955-4 | |
| 高效液相色谱级水 | 费舍尔科学 | W5-4 | |
| 羟胺溶液在H2O中 | 西格玛 | 438227-50ML | |
| L-谷氨酰胺 | 费舍尔科学 | MT25015CI | |
| 正十二烷基-β麦芽苷(DDM)洗衣粉 | 费舍尔科学 | BN2005 | |
| 非必需氨基酸 | 费舍尔科学 | MT25025CI | |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | 赛莫飞舍尔 | BRE725539 | |
| 16%水溶液对甲醛电磁级 | 电子显微镜科学 | 15710-S | |
| PDC-CM(2型涂层) | 风景 | / | 目录号附带引言 |
| 青霉素-链霉素 | 费舍尔科学 | MT3002CI | |
| 磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),10x,pH值7.4,无RNase | 赛莫飞舍尔 | AM9625 | |
| Pierce二甲基亚砾(DMSO),LC-MS级 | 赛莫飞舍尔 | 85190 | |
| 移液枪 | 埃彭多夫 | Z666467(米利波尔西格玛) | |
| 丙酸酐 & ge;99% | 西格玛 | 240311-50G | |
| 丙酸酐-d10 ≥98 原子 % D, & ge;99%(同党) | 西格玛 | 615692-1G | |
| 冷藏离心机 | 热力学 | 75-217-420 | |
| SciCHIP H1涂层玻璃滑板 | 风景 | / | 目录号附带引言 |
| SpeedVac真空浓缩器(96孔板) | 热力学 | 15308325 | 天才SPD1010 |
| 无菌罩 | 热力学 | 1375 | |
| 无菌血清移液器 | 费舍尔科学 | 1367549 | |
| SYTOX 绿色死细胞染色法,用于流式细胞术 | 赛莫飞舍尔 | S34860 | |
| TrypLE表达酶(1X),无酚红 | 赛莫飞舍尔 | 12604013 | |
| 漩涡 | 西格玛 | Z258415 | |
| 水浴 | 费舍尔科学 | FSGPD10 |
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