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方法文章

用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

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DOI：

10.3791/69588

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2025年12月19日

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用同位素双联标记策略和ArgC酶解实现单细胞组蛋白翻译后修饰分析自动化的实验方案。该工作流程能够以单细胞分辨率对染色质异质性和表观遗传响应进行定量、可重复且高灵敏度的分析。

摘要

组蛋白翻译后修饰（hPTMs）是染色质结构和基因表达的核心调控因子。其失调与发育、癌症及衰老密切相关。尽管质谱法是研究组蛋白翻译后修饰的首选方法，但大多数现有方案均针对大量样本设计，无法解析细胞间的异质性。因此，将组蛋白PTM分析扩展到单细胞水平至关重要，但在技术上具有挑战性，因为组蛋白丰度低、富含赖氨酸且存在大量修饰。

本文介绍了一种利用纳米级液体处理技术实现组蛋白翻译后修饰（PTM）分析的自动化单细胞蛋白质组学工作流程。该系统可对单个细胞进行纳升级别的处理，操作步骤极少且具有高度可重复性。该工作流程采用ArgC Ultra蛋白酶进行消化，该酶特异性切割精氨酸残基，避免了组蛋白蛋白质组学中通常所需的赖氨酸封闭衍生化步骤。为了实现不同条件之间的定量比较，我们采用丙酸酐及其氘代类似物丙酸酐-d10进行双重标记策略。这种自动化样品制备、同位素多重标记与ArgC Ultra消化相结合的方法，建立了一种高效且灵敏的单细胞组蛋白PTM分析方案。

该方法可用于在单细胞分辨率下研究染色质异质性以及表观遗传扰动的影响。为演示实验流程，我们利用HepG2/C3A肝细胞癌细胞生成了球状体，并使用丁酸钠进行处理，后者是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可诱导组蛋白高乙酰化。

引言

组蛋白是核小体的蛋白质组分，而核小体是染色质的重复单位。其N端尾部富含赖氨酸和精氨酸残基，并受到乙酰化、甲基化和磷酸化等翻译后修饰（PTMs）的高度调控。这些修饰影响DNA的可及性，从而调控转录、复制和修复等过程。组蛋白PTM模式的异常与多种疾病状态密切相关，从癌症到神经退行性疾病及衰老1,2。因此，组蛋白PTM分析在表观遗传学和蛋白质组学研究中备受关注。质谱（MS）可实现位点特异性和定量的组蛋白修饰分析，但组蛋白在分析上具有独特的挑战性。其氨基酸组成、多个修饰位点以及复杂的组合修饰模式使其比典型蛋白质更难分析。现有方法依赖于在酶解前对赖氨酸残基进行化学衍生化以阻断其活性，从而提高肽段回收率和色谱性能3。尽管该方法在群体细胞分析中有效，但多步骤的衍生化流程可能导致样品损失，这对于单细胞样本而言尤为不利。由于生物系统本质上具有异质性，单细胞分析正变得越来越重要。群体细胞的组蛋白分析会对大量细胞的信号进行平均，因而无法捕捉这种异质性。细胞亚群在染色质状态上可能存在差异，而这些差异可能驱动发育、细胞重编程或药物应答4,5。

本文介绍了一种用于多重单细胞组蛋白翻译后修饰分析（sc-hPTM2）的自动化样品制备方法。该方法基于CellenONE系统，可实现单个细胞及纳升级试剂的精确分配，且操作过程自动化。本方法是对纳米蛋白质组样品制备（nPOP）方法的一种改进，后者首次提出了在玻片上进行液滴制备的技术6。nPOP平台推动了自动化单细胞蛋白质组学的发展，但其标准的胰蛋白酶消化方案由于组蛋白富含赖氨酸且修饰位点密集，因而并不适用于组蛋白分析。本文中，我们对CellenONE系统进行了优化，引入了以丙酸酐进行组蛋白衍生化的金标准方法，并结合同位素标记，实现了在单细胞分辨率下对组蛋白翻译后修饰进行准确而全面的定量分析。具体而言，我们采用ArgC Ultra蛋白酶进行蛋白质消化，简化了实验流程。与胰蛋白酶不同，ArgC仅在精氨酸位点切割，无需对赖氨酸进行封闭，从而避免了两步衍生化策略，使流程更加高效。此外，本方法采用丙酸酐与氘代丙酸酐（propionic anhydride-d10）进行双重同位素标记，可同时分析两个单细胞样品7,3。在完成消化和标记后，回收单细胞样品，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）/MS结合数据非依赖性采集（DIA）方式进行分析。在我们的实验中，与该方法的先前版本相比，本方法在组蛋白翻译后修饰的定量灵敏度和重复性方面均有显著提升8。

为展示该方法，我们对源自HepG2/C3A肝细胞癌细胞的球状体中的单细胞组蛋白翻译后修饰（PTM）动态进行了分析。我们用丁酸钠处理这些球状体，丁酸钠是一种特征明确的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可增加组蛋白乙酰化水平，常用于探究染色质调控的基准试剂9,10。通过在单细胞分辨率下比较对照组与丁酸钠处理组的球状体，我们展示了代表性结果的原理验证，突显了该方法在染色质生物学和癌症表观遗传学中更广泛的应用潜力。值得注意的是，本实验方案参考了先前发表的研究，其中描述了三维球状体的培养与处理方法10、质谱中组蛋白肽段的获取11，以及使用EpiProfile软件进行数据分析的流程12。

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方案

1. 缓冲液与试剂

  1. 用于 HepG2/C3A 细胞的细胞培养基：配制含 10% 胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（1% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）和青霉素/链霉素（0.5% v/v）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）。培养基储存于 4 °C。
  2. 主混合液：在液相色谱-质谱级水中配制含 ArgC Ultra 60 ng/µL、HEPES 6 mM、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）0.03%、二硫苏糖醇（DTT）10 mM 的溶液。
  3. 羟胺（HA）溶液：在液相色谱-质谱级水中配制 1%（v/v）羟胺溶液。
  4. 洗涤液：配制 10 mL 含 0.1%（w/w）甲酸的乙腈/水（50:50，v/v）混合液（均为液相色谱-质谱级）。
  5. 流动相 A（MPA）— 0.1% 甲酸：将 1 mL 浓甲酸加入 999 mL 高效液相色谱级水中，充分混匀。
  6. 流动相 B（MPB）— 80% 高效液相色谱级乙腈 + 0.1% 甲酸：将 800 mL 高效液相色谱级乙腈加入 199 mL 高效液相色谱级水中，再加入 1 mL 浓甲酸，混匀。

2. 类球体的制备

  1. 关于类球体的制备，请参考 Stransky S 等人的研究11。
  2. 将 HepG2/C3A 肝细胞癌细胞在旋转式三维（3D）生物反应器中培养 5–7 天，以促进形成均一的类球体，直至直径达到约 400–600 µm。使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和 0.5% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。在处理前，将类球体维持于 37 °C 和 5% CO2 条件下。
    注：图 1A 展示了参考文献中用于制备类球体的设备。

3. 细胞培养与处理

  1. 将约10个类球体放入含有2 mL培养基的组织培养6孔板中。
  2. 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育细胞。
  3. 用5 mM丁酸钠处理类球体24小时，对照组加入等体积的水（图1B）。

4. 细胞分离与单细胞悬液制备

  1. 处理24小时后，在37 °C下用1 mL trypLE孵育细胞3-5分钟。
  2. 轻轻吹打至类球体完全解离，获得单个细胞。
  3. 将细胞收集至15 mL离心管中，用预冷的1×PBS稀释至10 mL，于4 °C以500 g离心5分钟，吸除上清液。
  4. 用1 mL预冷的1×PBS重悬细胞，并加入Sytox Green死细胞染料，终浓度为1 µM。
  5. 在冰上避光环境中孵育细胞20分钟。
  6. 用10 mL预冷的1×PBS洗涤细胞，于4 °C以500 g离心5分钟，吸除上清液。
  7. 用1 mL预冷的1×PBS重悬细胞，并加入多聚甲醛（PFA），终浓度为0.5%。
  8. 在冰上孵育细胞15分钟。
    注：尽管Sytox Green通常因细胞膜通透化而不适用于固定步骤，但在我们测试的细胞中，固定后8小时内Sytox Green阳性细胞的比例保持稳定，且未见组蛋白泄漏现象。
  9. 用10 mL预冷的1×PBS洗涤细胞，于4 °C以500 g离心5分钟，吸除上清液。
  10. 将细胞重悬至终浓度为200–500个细胞/μL。
    注：对于不易沉降的小细胞，建议使用500个细胞/µL的浓度；对于易沉降的大细胞，建议使用200个细胞/µL的浓度。若细胞悬液易发生聚集，上样前应通过40 μm滤网过滤，以防喷嘴堵塞。若关注的细胞大于40 μm且可能存在于样本中，可改用70 μm滤网以去除过大的聚集体。
  11. 将细胞置于冰上保存，直至上机进行分选。

5. 软件连接与系统初始化

  1. 打开 cellenONE 系统（图 2A），启动控制计算机，运行软件，并打开 v2.0-nPOP2 用户工作区；nPOP 所需的所有场文件和运行模板均已预加载于此。
  2. 确保仪器的冷却器已开启，然后根据仪器当前报告的内部温度设定露点追踪值。
  3. 按照屏幕提示，使用已安装在 1 号和 3 号插槽中的 PDC-70、2 型涂层分配喷嘴（图 2B）对系统进行预润。
  4. 将每个喷嘴的脉冲宽度和驱动电压设置为制造商包装上指定的数值。
    注意：使用两个独立的喷嘴可保持分配的一致性：一个用于递送细胞悬液，另一个用于递送试剂，因此任何附着在喷嘴上的碎片都不会影响后续液滴。在最终收集步骤中同时使用两个喷嘴也可加快样品回收速度。
    1. （关键步骤）为实现最大拾取效率，两个喷嘴之间的 z 偏移应小于 <50 µm。可通过在“喷嘴设置”选项卡中定义每个喷嘴的最佳接触位置并比较 Z 高度读数来确定该值。
  5. 向加湿器储水罐中加入去离子水，直至达到标示的水位线。

6. 液体处理设备的预运行设置

  1. 选择待制备的玻片数量（图2C），该选择将直接确定计划分析的细胞总数。
  2. 对于两重多重分析方案（图3A），在单个玻片上加载320个细胞。

7. 在载玻片边缘周围 dispensing 二甲基亚砜（DMSO）“护城河”

注意：图3B 展示了从DMSO护城河开始，在cellenONE中进行样品制备的步骤。为了进一步防止液滴蒸发，将DMSO分配至载玻片边缘。

  1. 在主选项卡中，选择运行 0_Dispense_DMSO_Moat。
  2. 转到 目标设置 选项卡，从相应的方案文件夹中加载 DMSO_Moat.fld 文件，并将 区域数量 设置为 Y，与计划处理的载玻片数量一致。
  3. 将 150 µL 色谱-质谱级 DMSO 分装至新的 PCR 管中，并将其放置于 CellenWASH 仪器的 2 号位置，管盖朝向仪器门方向。
  4. 打开 运行 选项卡并点击 开始运行。系统将吸取 10 µL DMSO 并暂停，等待用户确认液滴稳定性。发射三个自动液滴测试液滴（图 4A）；若三个液滴均形态完整，点击 继续运行。
  5. 完成点样后，喷嘴将自动冲洗，仪器会对所有载玻片进行成像以用于质量控制。请检查图像，确认每张载玻片上的 DMSO 液滴分布均匀，并排查是否存在缺失或偏离目标位置的液滴（图 4B）。

8. DMSO 分配

  1. 在主选项卡中，选择运行任务1_Dispense_DMSO。
  2. 打开目标设置选项卡，从相应的方案目录中导入场文件 DMSO.fld（图 4C），并将场数设置为Y，以匹配您计划处理的载玻片数量。
  3. 取 150 µL 液相色谱-质谱级 DMSO 分装至新的 PCR 管中，并将其放置于 CellenWASH 装置的 2 号位置，管盖朝向仪器门方向。
  4. 打开运行选项卡，点击开始运行。系统将吸取 10 µL DMSO，并暂停以等待用户确认液滴稳定性。发射三个自动液滴测试液滴；若三个液滴均形态完整，请点击继续运行。
  5. 当点样完成后，软件将自动冲洗喷嘴，并对每张载玻片进行成像以确保质量。请检查图像，确认每张载玻片上的 DMSO 液滴分布均匀，并排查是否存在缺失或偏离目标位置的液滴。

9. 细胞分配

  1. 在主选项卡中，选择运行至2_分配细胞。
  2. 在目标设置选项卡中，打开所选多重化方案目录下的细胞场文件子文件夹。
  3. 由于本实验包含两个条件，请选择与即将分选的样本相对应的场文件——即 CellType_A.fld 或 CellType_B.fld。
  4. 文件加载后，将场数设置为Y，使其等于本次运行的载玻片总数。
  5. 将步骤 4.11 中制备的细胞悬液置于冰上，用真空泵脱气 10 分钟。
  6. 将 150 µL 制备好的细胞悬液转移至一个洁净的 CellenVIAL 中，然后将该管置于 CellenWASH 转盘的 1 号槽位，管盖朝向仪器门方向。
  7. 进入喷嘴设置选项卡 > 执行任务，运行 Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 以从管中吸取样本。
  8. 仍在喷嘴设置选项卡中，启动细胞分配查看器（图 5A），并运行映射程序，根据大小和伸长程度定义喷射区域和门控对象。图 5A 所示的单细胞分离参数对应于从类球体解离的 HepG2/C3A 细胞分选时所使用的精确设置。
  9. 随后通过选择 T > F 启用荧光模式。将选择模式设为阴性。将大小和强度的分离参数范围从最小值调至最大值，以确保不分离死细胞。
  10. 确认映射参数无误后，切换至运行选项卡，点击开始运行，然后按照软件提示操作。当分配结束后，仪器将自动冲洗喷嘴，并捕获载玻片图像，用于评估液滴位置和分布均匀性。
    注意：在细胞分选过程中，系统会拍摄每次分离的单个细胞图像（图 5B）。
  11. 细胞分选完成后，关闭分配窗口。
  12. 将剩余的细胞悬液保存在冰上直至第 9 节结束；多余样本可用于后续的批量样本分析、经验性文库构建或额外的验证研究。

10. 消化主混合液的分配

  1. 在主选项卡中，选择运行至2_Dispense_Digest_10ulPickup。
  2. 打开目标设置选项卡，从相应的多重分析方案文件夹中加载Digest.fld文件，并将区域数量设置为Y，使其等于本次运行的载玻片数量。
  3. 配制新鲜的消化主混合液，并在冰上用真空泵脱气10分钟（主混合液成分：ArgC Ultra 60 ng/µL，HEPES 6 mM，DDM 0.03%，DTT 10 mM，溶剂为液相色谱-质谱级水）。
  4. 将20 µL主混合液移液至384孔板中，并将该板放入X1系统内。
  5. 在运行选项卡中，点击开始运行并按照提示操作。系统吸取试剂后，当提示时确认液滴稳定性。
  6. 当分配完成后，仪器将自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照；请检查图像，以确认每个液滴均均匀地接受了消化混合液。
  7. 将载玻片在指定湿度和露点条件下过夜孵育以完成消化。每个液滴含有约13.5 nL的消化混合液。孵育应在约75%相对湿度下过夜进行，同时将露点控制在比腔室温度低1–2 °C，以防止液滴蒸发。

11. 过夜孵育

  1. 在主选项卡中，选择运行至4_孵育_16h。
  2. 切换到运行选项卡，点击开始运行。
    注意：仪器将每30分钟拍摄一次载玻片图像，以监测液滴的状态。若在孵育过程中液滴干燥或膨胀，请根据需要调整露点设置。
  3. 当孵育完成后，将弹出提示消息，表明孵育已结束。
    注意：在较高的有效酶与底物比例条件下，可能实现快速消化（≤4小时）；但本研究未对此进行评估，因此已验证的条件仍为16小时。

12. 蒸发

注意：在进入标记步骤之前，建议检查液滴的状态，确保其未因吸水而过度膨胀，因为水分可能干扰标记效率。为此，建议进行蒸发步骤。

  1. 在 主要 标签，选择要运行的项目 5_蒸发.
  2. 前往 文件，冷却单元控制，以及在 露点控制设定为固定控制温度 在 23 °C.
  3. 切换到 运行 标签，点击 开始运行干燥将持续5分钟，仪器将在干燥后自动拍摄载玻片图像。
  4. 检查图片；如果液滴已充分干燥，则停止运行。否则，单击 继续 并再干燥5分钟（图 6A).
  5. 运行结束后，切换回之前的 露点控制.

13. 标签分配

  1. 在主选项卡中，选择运行至6_Dispense_PA_Labels。
  2. 转到目标设置选项卡，从相应方案文件夹中加载Labels.fld文件，并将区域数量设置为Y，与计划处理的载玻片数量一致。
  3. 将150 µL LC-MS级DMSO分装至CellenWASH工作站的2号槽位。
  4. 配制用于多重组蛋白衍生化的两种标记试剂储备液：25% (v/v) 丙酸酐的DMSO溶液和25% (v/v) 丙酸酐-d10的DMSO溶液。
    注意：在将两种溶液转移至微孔板前应进行脱气处理，以尽量减少气泡形成。
  5. 将每种标记试剂各20 µL分别分配至384孔板的指定孔中，并将该板放入X1系统内。每个液滴将接收约10 nL的标记试剂（25%丙酸酐或25%丙酸酐-d10的DMSO溶液）。
  6. 切换至运行选项卡，点击开始运行，并按照提示操作。
  7. 使标记试剂在载玻片上反应1小时。
  8. 分配完成后，仪器将自动冲洗喷嘴并对每张载玻片拍照。请检查图像，确认所有载玻片上的试剂分布均匀且液滴位置正确。

14. HA 分配

  1. 使用前配制并脱气 HA 溶液。
  2. 装载样品瓶。用移液器将 150 µL HA 溶液加入一支洁净的 PCR 管中，将其放入 CellenWASH 的 2 号槽位，并使管盖朝向仪器门方向。
  3. 选择运行程序。在 主 选项卡中，选择 7_分配_淬灭。
  4. 配置场文件。打开 目标设置 选项卡，从相应的多重分析方案文件夹中加载 HA.fld 文件，并将 场数 设置为 Y，使其等于总玻片数量。
  5. 开始运行。进入 运行 界面，点击 开始运行，并按照屏幕提示操作。
  6. 孵育。让 HA 在玻片上反应 30 分钟。
  7. 验证分配效果。运行完成后，系统将冲洗喷嘴并对每张玻片成像——请检查这些图像，以确认液滴分布均匀且体积一致。

15. 样本拾取

  1. 在 WashTray XL 中配制洗涤液。
  2. 准备收集板。将 2 µL 含 0.01% (w/w) DDM 的液相色谱-质谱级水加入新的 384 孔板的每个孔中，并将该板放入液体处理仪内。
  3. 选择拾取程序。在 Main 选项卡中，选择 8_Pickup_2plex 配置文件。
  4. 加载场文件。打开 Target Setup 选项卡，从正确的多重分析方案目录中导入 Pick-up.fld 文件，并将 Number of Fields 设置为 Y，以匹配载玻片数量。
  5. 执行运行。切换到 Run 选项卡，点击 Start Run，并按照提示操作。仪器将收集每个液滴，冲洗喷嘴，并对载玻片成像以供审查，确认所有样本均已成功获取。

16. 拾取后处理

  1. 用粘性封板膜密封384孔板，并短暂离心，使液滴沉降至各孔底部。
  2. 移除封板膜，在真空浓缩仪中低温干燥样品。
  3. 用粘性封板膜重新密封孔板，并将干燥后的孔板在-80 °C下保存，直至进行LC-MS/MS分析。

17. 大量样品制备

  1. 使用第9步剩余的悬液，离心沉淀细胞后重悬于1×PBS中，调整细胞浓度至2,000个细胞/μL。µL. 此步骤应在完成第10节后进行。
  2. 热裂解：将剩余悬液在 -80 ℃ 快速冷冻 °C，10 分钟，然后在 90 °C 进行热激 °10 分钟，4 °C
  3. 让试管冷却至室温。
  4. 转移 25 µ将 L 的裂解液转移至 PCR 管中，并加入 5 µ之前制备的消化混合液的L。
  5. 孵育过夜（≈ 16 小时）于 37 °在热循环仪中进行。
  6. 轻标记衍生化：加入5 µL 新鲜的25%（v/v）轻标记物乙腈溶液，孵育1小时。
  7. 反应终止：加入5 µ1% (w/w) 盐酸羟胺（HA）溶液，孵育 30 分钟。
  8. 在低温下用真空浓缩仪干燥样品，然后于 -80 ℃ 保存 °C，待进行 LC-MS/MS 前保存于此温度。

18. 液相色谱/质谱设置与数据采集

注意：为采集本文手稿的数据，LC-MS\MS 系统配置了内径 75 µm、长度 25 cm、粒径 1.7 µm 的 Ion Optics 分析柱。

  1. 准备用于高效液相色谱的流动相：
    流动相 A (MPA)：含 0.1% 甲酸的 HPLC 级水
    ​流动相 B (MPB)：含 0.1% 甲酸的 HPLC 级乙腈
  2. 设置高效液相色谱方法，进行 30 分钟的主动梯度洗脱程序：在 25.7 分钟内，流动相 B 从 5% 升至 23%；在 2.6 分钟内，从 23% 升至 35%；在 1.7 分钟内，从 35% 升至 45%，流速为 200 nL/min。设置自动进样器程序，使样品在 0.1% 甲酸 + 0.01% 十二烷基麦芽糖苷（DDM）中重悬，用于“干法”吸取。
  3. 设置质谱采集方法，进行数据非依赖性采集（DIA）：
    注意：以下参数专为配备 FAIMS Pro Duo 的 Thermo Exploris 480 质谱仪设定，不同仪器参数可能有所差异。建议采用与下述 m/z 范围相似的单细胞蛋白质组学 DIA 常用设置。
    1. 设置一级质谱（MS）为全扫描模式，m/z 范围 300–1100，分辨率 120,000，AGC 目标值 300%，最大注入时间 246 ms，FAIMS 补偿电压（CV）为 -50 V。
    2. 设置二级质谱（MS/MS）为 DIA 扫描模式，m/z 范围 300–1100，分辨率 60,000，隔离窗口 50 m/z，HCD 碰撞能量 27%，起始质量 120 m/z，AGC 目标值 1000%，最大注入时间 118 ms，FAIMS 补偿电压（CV）为 -50 V。
  4. 移除含有单个细胞的 384 孔板上的铝箔封膜。将批量样品用 0.1% 甲酸 + 0.01% 十二烷基麦芽糖苷（DDM）重悬至 100 个细胞/µL，并将 10 µL 转移至一个空孔中（例如 P24 孔）。然后，用可穿刺橡胶垫密封该板，并将其装入自动进样器中。
  5. 排列运行序列：先运行批量样品，再依次运行各组单细胞样品。

19. 数据分析

  1. 使用 EpiProfile2.1 运行原始数据，以获得用丙酸酐标记的细胞的肽段变体丰度结果。
    注意：必须在赛默飞世尔（Thermo）仪器上采集样品，才能使用 EpiProfile 2.1 进行数据处理。该软件的标准版本可提取约 250 种肽段变体，但可根据生物体、额外关注的修饰、突变等情况进行自定义调整。12
  2. 使用 EpiProfile2.1_D5 运行原始数据，以获得用氘代丙酸酐（propionic anhydride-d10）标记的细胞的肽段变体丰度结果。
  3. 使用 quantQC 程序将元数据与 Epiprofile 输出结果进行匹配关联。
  4. 通过与空白对照样本比较，过滤掉失败的样本。
  5. 过滤掉在少于 50% 样本中出现的肽段变体。
  6. 过滤掉单细胞信号强度未超过空白对照信号强度 150% 的肽段变体。
  7. 获得结果表格（图 7A），并根据需要进一步处理数据。

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结果

为了展示我们利用该系统进行单细胞组蛋白蛋白质组学工作流程的应用，我们分析了经5 mM丁酸钠处理24小时的HepG2/C3A细胞球状体。在完成LC-MS/MS采集后，使用EpiProfile对轻标（丙酸酐）和重标（丙酸酐-d10）数据进行处理，获得归一化后的数据，以表示肽段和组蛋白修饰的丰度。随后使用QuantQC R软件包将液体处理仪的采集元数据与EpiProfile输出结果进行匹配，从而获取每个单细胞中肽段组成及其丰度信息；接着过滤掉在少于50%单细胞中未被稳定检测到的肽段变体，并剔除单细胞信号强度未超过空白样本信号150%的肽段变体。随后对数据进行log(1+x)转换归一化处理，生成用于下游分析的结果表格，该表格包含一列表示各种肽段变体，以及对应每个单细胞的多列，用以展示各鉴定出的肽段变体的丰度值。

图7A 展示了定量的前20种组蛋白H3肽段变体结果表的代表性子集。数值以对照组和丁酸钠处理组条件下的相对丰度表示。该概览突显了该工作流程能够在单细胞分辨率下检测多种翻译后修饰状态，包括甲基化、乙酰化以及组合修饰标记。例如，...

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讨论

在单细胞水平上检测组蛋白翻译后修饰的能力，是深入理解染色质调控真实异质性的关键一步。传统的群体检测方法虽然为组织中组蛋白翻译后修饰（hPTMs）的平均分布提供了宝贵见解，但却掩盖了日益被认识到具有生物学意义的细胞间变异5。当前的单细胞蛋白质组学方法使我们能够解析这一隐藏的复杂性层次，揭示可能介导差异性基因调控、细胞可塑性及疾病易感性的不同染色质状态4。组蛋白修饰特别适合于单细胞层面的研究，因其编码了指导转录结果的组合性信息13。例如，H3K9ac 与 H3K14ac 修饰的共存，比单一修饰更能有效指示转录激活状态10。在单细胞分辨率下捕捉此类共现模式，为表征染色质景观及其动态变化提供了全新的视角。

尽管具有上述优势，单细胞组蛋白翻译后修饰（PTM）分析在技术上仍然具有挑战性。其局限性包括蛋白投入量极低、需要精确的样品操作，以及难以区分技术性噪声与生物学噪声5...

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披露

J.C. 是 SCIENION US Inc. 的员工。

致谢

我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院分子细胞遗传学核心实验室的 Bernice Morrow 博士和 Jidong Shan 博士在维护 cellenONE 仪器方面所做的工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Bio-Rad2239480
1000 µL 宽口移液器吸头Fisher Scientific14222703
200 µL 宽口移液器吸头Fisher Scientific14222730
384 孔低吸附 PCR 板 Eppendorf30129547
96 孔真空过滤装置MilliporeMAVM0960R
乙腈，Optima LC-MS/MS 级Fisher ScientificA955-1
PCR 板压敏封膜Thermo FisherAB0626
无水乙腈Fisher ScientificAA42311AK用于标记母液（大量）
Arg-C Ultra，质谱级PromegaVA1831
细胞培养级水Corning25-055-CV
CellenVIALsSCIENION/货号需报价获取
DMSO，无水Thermo FisherD12345用于标记母液
DTTSigmaD0632-5G
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Fisher ScientificMT17205CV
胎牛血清Fisher ScientificMT35010CV
甲酸Thermo28905
甲酸 98%–100%，用于 LC-MS，LiChropur 级Sigma5330020050
汉克平衡盐溶液（HBSS）Fisher ScientificMT21022CV
HEPES（超纯）Thermo Fisher11344041
HPLC 级乙腈Fisher ScientificA955-4
HPLC 级水Fisher ScientificW5-4
羟胺溶液，50 wt. % 溶于 H2OSigma438227-50ML
L-谷氨酰胺Fisher ScientificMT25015CI
n-十二烷基-β-麦芽糖苷（DDM）去垢剂Fisher ScientificBN2005
非必需氨基酸Fisher ScientificMT25025CI
Orbitrap Exploris 480 质谱仪Thermo FisherBRE725539
16% 甲醛水溶液，电镜级Electron Microscopy Sciences15710-S
PDC-CM（2 型涂层）SCIENION/货号需报价获取
青霉素-链霉素Fisher ScientificMT3002CI
磷酸盐缓冲液（PBS），10×，pH 7.4，无 RNaseThermo FisherAM9625
Pierce 二甲基亚砜（DMSO），LC-MS 级Thermo Fisher85190
移液枪EppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
丙酸酐 ≥99%Sigma240311-50G
丙酸酐-d10 ≥98 原子% D，≥99% (CP)Sigma615692-1G
冷冻离心机Thermo75-217-420
SciCHIP H1 涂层玻片SCIENION/货号需报价获取
真空浓缩仪（适用于 96 孔板）Thermo15308325Savant SPD1010
无菌操作台Thermo1375
无菌移液管Fisher Scientific1367549
SYTOX Green 死细胞染料，用于流式细胞术Thermo FisherS34860
TrypLE Express 酶（1×），无酚红Thermo Fisher12604013
涡旋振荡器SigmaZ258415
水浴锅Fisher ScientificFSGPD10

参考文献

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