用兰索拉唑治疗了胶原酶诱导的小鼠脑出血模型（ICH）。兰索拉唑不仅缓解了ICH引起的肠道损伤，降低了脂多糖（LPS）和IL-1β的水平，还抑制了脑部炎症。兰索拉唑增强了ICH小鼠的学习和记忆（长期神经功能）。
研究文章
用兰索拉唑治疗了胶原酶诱导的小鼠脑出血模型（ICH）。兰索拉唑不仅缓解了ICH引起的肠道损伤，降低了脂多糖（LPS）和IL-1β的水平，还抑制了脑部炎症。兰索拉唑增强了ICH小鼠的学习和记忆（长期神经功能）。
脑内出血（ICH）可能损害胃肠道并引发肠道损伤，导致临床预后较差。本研究探讨了兰索拉唑对ICH小鼠肠道损伤和神经功能的影响。小鼠被立体注射胶原酶以建立ICH模型。评估了神经功能、脑水含量、血脑屏障通透性、肠道损伤和肠道通透性。还检测了血液和大脑中LPS和IL-1β的水平。兰索拉唑治疗与缓解肠道损伤、降低血液和大脑中LPS和IL-1β水平、降低脑水分含量以及抑制ICH小鼠脑炎症相关。虽然兰索拉唑在Garcia、前肢定位和旋转测试（短期神经功能）中表现未显著提升，但显著提升了学习和记忆（长期神经功能）。这些发现表明，兰索拉唑治疗与ICH小鼠的长期神经系统结局改善和肠道损伤减少相关。
出血性中风的死亡率和残疾率都很高。近年来，中国中风的患病率有所上升，使其成为主要死因1。虽然较少见，但脑内出血（ICH）的致死率明显高于缺血性中风。研究报告称，ICH发生后一个月内死亡率为40%;此外，大约75%的幸存者一年后无法独立生活。
大脑通过多条通路与胃肠道沟通，包括迷走神经、肠神经系统和肠道微生物代谢。脑肠轴是一个广为人知且临床相关的调控系统3。肠道黏膜调节水分、电解质和营养物质的吸收，同时防止病原体和毒素进入血液。ICH可能破坏肠道屏障，诱发胃肠道损伤。屏障功能障碍反过来又会导致营养不良、免疫抑制和临床结局不良4.ICH引起的肠道通透性增加使有害内源性物质进入血液，引发系统性炎症反应和多器官功能障碍综合征。ICH后肠道黏膜受损甚至可能使肠道细菌转移到血液中，导致全身性感染5.许多患者会出现肠道运动障碍、微生物菌群失调、黏膜出血和败血症。一项先前的研究显示，ICH导致肠道病原体和毒素迁移到大脑6。
兰索拉唑是一种质子泵抑制剂（PPI），不可逆地抑制质子泵，从而减少胃酸分泌。它用于治疗胃和十二指肠溃疡、侵蚀性食管炎、胃食管反流病以及非甾体抗炎药相关胃溃疡7。一项先前研究表明，PPI预防对缺血性卒中8的患者预后产生负面影响。其他已发表的研究则表明PPI使用与认知下降之间存在关联。一项流行病学研究显示，服用PPI的患者患痴呆和阿尔茨海默病的风险增加9。一项前瞻性队列研究比较了长期PPI使用者与非使用者，发现PPI使用与痴呆风险增加相关，作者建议高风险患者不宜使用PPI，作为预防措施10。本研究旨在探讨兰索拉唑对ICH小鼠肠道损伤及短期和长期神经功能（特别是学习和记忆）的影响。我们假设兰索拉唑可能因其肠道屏障保护作用抑制LPS的渗透，缓解全身性和神经系统炎症，从而改善ICH小鼠的神经功能。
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这些实验按照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物编号8023,1978年修订）进行。该方案已获得烟台大学伦理委员会批准（批准号YTDX20240526）。危险物质的处置遵循机构化学废弃物规范。 图1 展示了实验设计的示意图。试剂和所用设备列于 材料表中。
1. 动物细节
雄性CD-1小鼠体重22-25克，被安置在一个12/12小时明暗循环的房间里。动物们可以自由获取食物和水。
2. ICH小鼠模型的制备
ICH的小鼠模型是根据之前的报告建立的11。简短地，小鼠先用赛拉嗪（10 mg/kg）和氯胺酮（90 mg/kg）麻醉，然后置入立体定向框架。在右冠状缝处钻了一个小毛刺孔（距中线外侧2.2毫米，距冠线后方0.2毫米）。微型注射器入右脑，深度为距颅骨表面3.5毫米。利用微型输注泵，以0.15微升/分钟速率注入细菌胶原酶（0.075 U，0.5微升磷酸缓冲盐水[PBS]）。针头在5分钟后被轻轻抽出。假组小鼠接受了等量的PBS而非胶原酶。用骨蜡封住了毛刺孔，头皮切口缝合。动物的体温保持在37°C，直到醒来。
3. 实验设计
雄性CD-1小鼠被随机分配到三组：假组、模型组和兰索拉唑组。ICH模式的建立如上所述。ICH诱导30分钟后，兰索拉唑组小鼠接受30 mg/kg剂量的兰索拉唑（根据之前报告12选择兰索拉唑剂量），连续三天每日一次。假组和模型组的小鼠接受了腹腔内PBS注射。ICH后3天，采用Garcia测试、前肢定位测试和旋转木试验评估短期神经功能。在ICH诱导后第29天，进行了新型物体识别和水迷宫测试，以评估长期神经功能。
4. 加西亚测试
两名研究人员在对该团队进行盲处理的情况下，按照此前报道的第13号方案进行了加西亚测试。神经功能采用0至21分的评分系统进行评估。评估包含七个子测试，每个子测试得分范围为0到3（0=最差，3=最佳）。
5. 前肢定位测试
加西亚测试后，前肢定位测试按照之前描述的方法14进行。小鼠被垂直放置，平行于桌面，让它们的振动触动沿着桌面摩擦。前肢定位在连续10次试验中均有观察。左前肢位置的百分比计算为：左前肢位置 / （左前肢位置 + 右前肢位置）×100%。
6. 旋转棒测试
前肢放置测试后，小鼠被放置在一根旋转杆上，每分钟5分钟进行训练。杆子从5转/分加速到30转/分，耗时4分钟。每只老鼠在棒上停留的时间记录在5分钟内，逃脱潜伏期记录为15。
7. 肠道通透性与脑水肿测定
旋转测试后，每组随机抽取六只小鼠。根据之前的方法16，FITC右旋糖酐以300 mg/kg的胃内给药。三小时后，小鼠被异氟醚麻醉，并从眼眶后静脉丛采集血液，在4°C和11,000 克 ×离心5分钟。FITC右旋糖酐含量通过荧光板读机在485纳米激发和528纳米发射波长下测定。随后动物被斩首，右脑半球被收集并称重以获得湿重。组织在100°C下干燥24小时以确定干重。脑水分含量（%）计算公式为：[（湿重 − 干重）/ 湿重] × 100%。
8. 血液-脑屏障（BBB）通透性评估
轮子试验后，每组随机选出六只小鼠评估BBB渗透率。腹腔内注射2%埃文斯蓝溶液，剂量为4 mL/kg。三小时后，小鼠接受异氟醚麻醉，并使用PBS进行心腔灌注。大脑右半球被均匀化在50%三氯乙酸中，比例为3：1（脑组织：三氯乙酸）。均质液在15,000× 克 、4摄氏度下离心20分钟。然后，500微升上清液与500微升70%乙醇混合，在4°C黑暗中过夜孵育。埃文斯蓝浓度在610纳米处测量，并用标准曲线进行定量。数据以每毫克脑组织的μg埃文斯蓝表示。
9. 肠道和大脑的组织病理学检查
旋转测试后，每组随机抽取三只小鼠。小鼠们用异氟醚麻醉。空肠、回肠和大脑被采集并用10%甲醛固定。组织切片厚度为5微米，并进行了血液素-伊斯红（HE）染色。两名实验者使用显微镜进行了肠道和大脑的组织病理学检查，他们对小组作业进行了盲法。在代表性切片中统计了包围血肿的小胶质细胞数量。细胞计数在每只动物的三个区域中，在五个任意视野中进行。
10. LPS和IL-1β的测量
旋转测试后，每组随机抽取六只小鼠。小鼠们用异氟醚麻醉，并采集血液。血液样本在5000× 克 、4摄氏度离心10分钟，并采集血清。右脑半球被采集，并以1：3（脑重量克对PBS体积毫升）的比例制备了脑同质体。均质液在12,000× 克 、4摄氏度下离心10分钟。使用BCA试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。按照制造商说明，使用ELISA套件测量血清和脑均质液中的LPS和IL-1β水平。
11. 透射电子显微镜
在电子显微镜检查中，旋转木试验后每组随机选出三只动物。小鼠接受异氟醚麻醉，并接受经心灌注，含2%谷醛和2.5%对甲醛，剂量为0.1 M PBS（遵循机构批准的方案）。随后采集大脑、空肠和回肠，置于2%戊醛中，置于0.1 M cacodylate buffer（pH 7.4）中，4°C夜间。随后，样品被转移到室温下1%四氧化锇中浸泡1小时。组织被切成超薄切片（50纳米）。脱水后，切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，用于透射电子显微镜观察。所有切片均以盲测方式评估，并用透射电子显微镜拍摄。
12. 新颖物体识别
在ICH建模29天后，进行了新型物体识别测试，以评估小鼠的学习和记忆功能。第一天，装置中未放置任何物品（长：40厘米，宽：40厘米，高度：40厘米），使小鼠能够自由探索5分钟。第二天，将两个相同的物体放入装置中，允许小鼠探索5分钟。二十四小时后，其中一个物体被一个新颖物体替换。老鼠们又探索了这两件物体5分钟。当小鼠的鼻子接触到物体，或其头部朝向该物体1厘米范围内时，会记录探索时间。探索这件新奇物体所花费的时间被测量和计算。对新对象探索时间越长，说明学习和记忆能力更好。
13. 莫里斯水迷宫
在ICH建模32天后，使用莫里斯水迷宫评估了学习和记忆功能。该装置由一个圆形水池（直径100厘米，高度40厘米）组成，水深25厘米，水温维持在22°C±1°C之间。 一个直径9厘米的逃生平台被淹没在水面下1厘米处。在导航测试中，小鼠每天接受四次试验。找到平台所花的时间被记录为逃逸延迟。未能在60秒内找到平台的小鼠会被轻柔引导到平台前方。第五天进行了60秒探测测试。通过记录逃逸延迟、平台穿越次数和在目标象限停留的时间来评估记忆功能。数据通过视频跟踪软件进行分析。
14. 统计分析
数据使用GraphPad Prism 7.0版软件进行分析。结果以均值±标准差形式呈现。使用Shapiro-Wilk检验评估各组数据是否遵循正态分布。组间差异通过单因子方差分析（ANOVA）分析，随后进行Tukey事后检验。对于非参数比较，采用了Kruskal-Wallis检验，随后采用Dunn检验。p值<0.05被视为统计学显著。
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兰索拉唑对ICH小鼠短期神经功能的影响
与假组相比，ICH组的小鼠在Garcia测试中得分显著较低（p < 0.01）。然而，兰索拉唑组的小鼠加西亚评分并未改善于ICH组（p > 0.05）（见图2A）。同样，ICH组左前肢放置率显著低于假组（p < 0.01）。与加西亚检查结果一致，兰索拉唑治疗未增加左前肢放置率（p > 0.05）（图2B）。在旋转木试验中，ICH组在棒上停留的时间明显减少（p < 0.01）。兰索拉唑治疗未改善该测试表现，因未观察到棒上时间显著增加（p > 0.05）（图2C）。...
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肠道损伤是ICH患者常见的并发症。ICH引起的肠道损伤可能导致营养不良、长期住院、不良预后甚至死亡17。利用ICH动物模型，本研究首次证明兰索拉唑能减轻ICH小鼠的肠道损伤。尽管兰索拉唑对短期神经功能无显著益处，但显著改善了长期神经系统结局。
中风，无论是缺血型还是出血性，都是全球主要的死因之一。中风后，身体会经历系统性应激反应，这可能引发大脑以外器官的病理性变化。肠道是这种系统性反应的主要靶点之一。临床上，中风引起的消化症状如黏膜损伤、腹部膨胀和便秘常见18,19。在缺血性卒中模型中，动物表现出肠道屏障功能障碍，可能导致肠道细菌转移到肺部等其他器官5。以往研究表明，ICH会诱发肠道屏障功能障碍、黏膜破坏、运动能力受损、炎症反应和氧化应激。这些病理过程最早可在ICH发病后2小时内开始，持续最长7天
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作者声明他们没有利益冲突。
我们感谢Liwen Bianji（Edanz）（www.liwenbianji.cn/ 年）的Angela Morben编辑了本手稿草稿的英文文本。本研究得到了山东省台山学者资助项目的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA套件 | 碧昂泰姆生物技术 | P0009 | |
| 胶原酶 | 西格玛-奥尔德里奇 | 128M4107v | |
| 埃文斯蓝色染料 | 西格玛-奥尔德里奇 | MKCG7507 | |
| FITC右旋糖酐 | 西格玛-奥尔德里奇 | 46944 | |
| GraphPad 棱镜 7.0 | GraphPad 统计软件，波士顿， MA，美国，www.graphpad.com | 棱镜7.0 | |
| 兰索拉唑 | 山东宇新制药有限公司 | 524093053 | |
| LPS ELISA套件 | 库萨比奥生物技术有限公司 | M25036407 | |
| 老鼠 | 济南蓬越实验动物育种有限公司 | SCXK20220006 | |
| 微输液泵 | 世界精密仪器 | 微型3 | |
| 微型注射器 | 汉密尔顿公司 | SYR 10 & mu;L | |
| 奥林巴斯显微镜 | 奥林巴斯有限公司 | IX-70 | |
| 轮差及nbsp; | 潘拉布有限公司 | LE8205 | |
| 立体定向框架 | Kopf 乐器 | 902-A型 | |
| TNF和α;ELISA套件 | 碧昂泰姆生物技术 | PI301 | |
| 透射电子显微镜 | JEOL 有限公司。 | JEM-100SX | |
| 视频追踪软件 | 潘拉布有限公司 | 智能3.0 |
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