利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

Sofia V. Krylova; Daniel Zamith-Miranda; Alus M. Xiaoli; Xiaofan Yu; Joshua D. Nosanchuk; Fajun Yang; Jeffrey E. Pessin; Daorong Feng

doi:10.3791/69670

需要JoVE订阅才能观看此内容。请登录或开始免费试用

方法文章

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌在体内和体外

111.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69670

⸱

2025年12月5日

Sofia V. Krylova¹^,²^,³ , Daniel Zamith-Miranda⁴^,⁵ , Alus M. Xiaoli¹^,²^,⁶ , Xiaofan Yu¹^,² , Joshua D. Nosanchuk⁴^,⁵ , Fajun Yang¹^,²^,⁶ , Jeffrey E. Pessin¹^,²^,³ , Daorong Feng¹^,²

¹Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, ²Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, ³Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, ⁴Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, ⁵Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, ⁶Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

本文内容

摘要

该方案利用脂肪细胞特异性的CD63-GFP报告小鼠品系，可视化并定量脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的分泌，并展示其被前体细胞摄取的过程，揭示了脂肪组织内的一种旁分泌通路。

摘要

脂肪细胞 increasingly 被认为是具有活性的内分泌细胞，能够分泌大量富含蛋白质、脂质和核酸的细胞外囊泡（EVs）。然而，调控EVs分泌的机制及其在不同生物学背景下的释放动态仍不完全清楚。为填补这一空白，我们构建了一种新型的脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠品系，其中GFP标记的CD63在脂联素（Adiponectin）启动子驱动下表达，从而实现对脂肪细胞来源EVs（AdEVs）的选择性标记与追踪体内利用该报告模型，我们检测了脂肪细胞外囊泡（AdEVs）的分泌及其向脂肪组织内抗原呈递细胞（APCs）的递送。共聚焦成像和流式细胞术结果显示，AdEVs可被APCs主动摄取，揭示了脂肪微环境中一种此前未受重视的旁分泌通讯机制。

以补充体内研究，一个体外建立了该系统，以直接监测分化脂肪细胞中细胞外囊泡（EV）的分泌。从报告基因小鼠的皮下白色脂肪组织中分离出脂肪前体细胞（APCs），并诱导其分化为成熟脂肪细胞。在这些细胞中，CD63-GFP信号表现为离散的点状结构；当EV分泌被抑制时，信号在质膜上富集，这与囊泡释放受阻后发生积聚的现象一致。在正常培养条件下，分泌到培养基中的EV通过尺寸排阻色谱法进行浓缩和纯化，从而可用于后续的功能和生物化学分析。

该平台可应用于来自其他脂肪库的抗原呈递细胞（APC），例如附睾白色和棕色脂肪组织，或通过将其分化为特定脂肪库的脂肪细胞，从而实现不同类型脂肪细胞间细胞外囊泡（EV）分泌的比较。

这些方法共同引入了一种强大的遗传学工具和一种互补的体外解析AdEV分泌与靶向动态的系统。这些进展揭示了脂肪组织内部的细胞间通讯机制，并为理解AdEVs在健康与疾病状态下的广泛代谢影响奠定了基础。

引言

脂肪组织 increasingly 被认为是一个动态的内分泌器官，在全身能量稳态中发挥关键作用¹^,²^,³^,⁴^,⁵。除了作为脂质储存库的经典功能外，脂肪细胞还调节全身胰岛素敏感性，而脂肪组织质量的异常——无论是过多还是不足——均与胰岛素抵抗和代谢性疾病相关⁶^,⁷^,⁸^,⁹。其中一种被提出参与该调控功能的机制是通过分泌因子介导的细胞间通讯。尽管脂肪因子已被确立为脂肪组织重要的内分泌信号分子¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

根据阿尔伯特·爱因斯坦医学院的动物护理与使用指南，雄性小鼠在22 °C、相对湿度30-70%的环境中以群养方式饲养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，并提供 随意摄取 可自由获取食物和水，并维持在C57BL/6J遗传背景上。

1. 体内通过抗原提呈细胞摄取检测分泌的腺相关病毒外泌体

缓冲液制备
1. 消化缓冲液：通过向50 mL DMEM中加入0.5 mL 1 M HEPES和0.5 g低脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）来制备HEPES缓冲DMEM。混合至完全溶解。
2. 洗涤缓冲液：制备含2.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和4%胎牛血清（FBS）的PBS。
3. 将Liberase和DNase 1储备液分别配制成5 mg/mL和5 KU/mL，于-20 °C保存。使用前立即解冻。
腹股沟脂肪组织采集与消化
注意：通过吸入二氧化碳处死4月龄AdipCD63-GFP和CD63-GFP对照小鼠。在分离脂肪组织祖细胞（APCs）前，将已处死的小鼠置于4 °C环境中24小时。
1. 采用无菌技术切除脂肪组织，取1 g组织置于0.5 mL消化缓冲液中，用无菌剪刀将组织精细剪碎至不超过1 mm的碎片。
2. 将剪碎的组织悬浮于含0.5 mg/mL ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过共聚焦显微镜检测抗原呈递细胞（APC）摄取脂肪组织来源的细胞外囊泡（AdEVs）的本实验方案，我们从AdipCD63-GFP小鼠和Stop^fl/fl/CD63-GFP小鼠的腹股沟脂肪组织中分离出APC，并用DAPI染色以显示细胞核。共聚焦显微镜观察显示，来自Stop^fl/fl/CD63-GFP小鼠的APC中未检测到明显的GFP点状信号（图1A）。相比之下，从AdipCD63-GFP小鼠分离的APC在细胞质中呈现出大量清晰可辨的GFP点状信号（图1B）。GFP信号表明APC摄取了AdEVs，因为CD63-GFP标记由仅在成熟脂肪细胞中表达而不在APC中表达的脂联素启动子驱动³⁰^,³¹。这些结果证实了该方法的特异性，并验证了本方案识别AdEV摄取事件的能力。

除了共聚焦显微镜外，APC对分泌型AdEVs的.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案通过提供一种稳健且可重复的系统来分离和表征AdEVs及其被APC摄取的过程，填补了重要的方法学空白。与其他来源的EVs相比，AdEVs富含脂质且浮力较大，使得基于超速离心的经典EV分离技术效率较低³⁵。然而，目前大多数已发表的AdEV纯化方案仍依赖超速离心，而该方法可能影响囊泡形态，导致EV聚集，并引起蛋白质污染³⁷^,⁴⁴。我们的方案则采用连续低速离心（≤ 4,000 × g）结合尺寸排阻色谱法（SEC）来纯化AdEVs。类似的连续离心-SEC方法已在非脂肪细胞来源的EVs中得到验证，具有更高的得率和纯度⁴⁵。此外，避免使用超速离心可更好地保持非脂肪细胞来源EVs的生物物理特性⁴⁶。上述方案首次描述并验证了将连续离心-SEC方法用于从成熟脂肪细胞中分离纯化AdEVs。

为确保本方案的可靠性和可重复性，.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无经济利益冲突。

致谢

感谢爱因斯坦医学院流式细胞术核心实验室提供的FACS技术支持，以及分析成像中心提供的所有图像分析帮助。本研究部分得到了美国国立卫生研究院基金DK128839和NCI癌症中心支持基金P30CA013330的资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Fisher	AM9260G	500倍稀释
10x PBS	Fisher Scientific	70-013-032	用水稀释1000倍
1 M HEPES	Gibco	15630080	1000倍稀释
小鼠脂肪组织前体细胞分离试剂盒	Miltenyi biotec	30-106-639	即用型
Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa MWCO	Sigma	UFC9100	15 mL 样品体积
Amicon Ultra 离心滤膜，100 kDa MWCO	Sigma	UFC9100	4 mL 样品体积
BSA	Sigma	A6003	即用型
Calnexin 抗体	calnexin	ab22595	1000倍稀释
CD63 抗体	abcam	ab217345	500倍稀释
CD81	Cell Signaling Technology	10037s	500倍稀释
Corning BioCoat Collagen I 培养载片	Sigma	CLS354630	即用型
Corning 细胞筛	Sigma	CLS431750	40 μm 孔径
Corning 细胞筛	Sigma	CLS431752	100 μm 孔径
COX IV 抗体	Cell Signaling Technology	4844	1000倍稀释
DMEM	Gibco	11965092	即用型
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂	Thermofisher	10565018	即用型
Dnase 1	Sigma	D4513	储存液 5 KU/mL，-20 °C 保存
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061	100倍稀释
Halt™ 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X）	Thermofisher	78444	即用型
HSP70 抗体	abcam	ab181606	1000倍稀释
Invitrogen eBioscience 10X RBC 裂解缓冲液（多物种）	Fisher Scientific	50-112-9743	用水稀释10倍
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP	Fisher Scientific	NC2042225	即用型
LEICA STELLARIS 8 共聚焦显微镜	Leica Microscopes	N/A
Liberase TM 研究级酶	Sigma	LIBTM-RO	储存液 5 mg/mL，-20 °C 保存
Millex MCE 注射器滤器	Sigma	SLAA025	0.8 μm 孔径
NanoSight Pro	Malvern Panalytical	N/A
Novex Tris-Glycine Mini 蛋白凝胶，4–12%	Thermofisher	XP04120BOX	即用型
Novex Tris-Glycine SDS 样品缓冲液（2x）	Thermofisher	LC2676	即用型
Pacific Blue 标记抗小鼠 Ly-6A/E（Sca-1）抗体	BioLegend	108119	25倍稀释
多聚甲醛溶液（16%）	Fisher Scientific	50-980-487	用 PBS 稀释至 4%
pluriStrainer S / 30 µm（细胞筛）	Fisher Scientific	NC0922459	30 μm 孔径
Ponceau S 溶液	Sigma	P7170-1L	即用型
Primocin	Invivogen	NC9141851	500倍稀释
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Cell Signaling Technology	8961S	即用型
纯化抗小鼠 CD16/32 抗体	BioLegend	101301	100倍稀释
RIPA 缓冲液	Fisher Scientific	PI89900	用水稀释10倍
光谱流式细胞仪（Aurora 3）	Cytek Biosciences	N/A
Syntaxin 4 抗体	Synaptic Systems	110042	5000倍稀释
Tecnai 20（透射电子显微镜）	FEI	N/A
Tergeo-EM	PIE Scientific LLC	N/A
Vinculin 抗体	abcam	ab18508	5000倍稀释

参考文献

Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
Luo, L....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌 在体 内 和 体外

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

探索更多文章

利用CD63-GFP报告小鼠模型表征脂肪细胞来源的细胞外囊泡分泌在体内和体外