利用CD63-GFP报告小鼠模型在体内和体外对脂肪细胞来源的胞外囊泡分泌进行表征

摘要

该方案使用脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠系，观察并量化脂肪细胞来源的细胞外囊泡（EV）分泌过程，并展示其被前体细胞吸收，揭示了脂肪组织中的旁分泌通路。

摘要

脂肪细胞越来越被认可为活跃的内分泌细胞，分泌大量富含蛋白质、脂质和核酸的EVs。然而，控制EV分泌的机制以及EV在不同生物学环境中释放的动力学尚未完全明了。为弥补这一空白，我们建立了一种新型脂肪细胞特异性CD63-GFP报告小鼠系，其中GFP标记CD63的表达由Adiponectin启动子驱动，从而实现了AdEVs的选择性标记和体内 追踪。利用该报告模型，我们研究了AdEV的分泌及其在脂肪组织中向APC的传递情况。共焦成像和流式细胞术显示，AdEVs被APC主动吸收，凸显了此前被低估的脂肪微环境中副分泌通信机制。

为补充 体内 研究，建立了体 外 系统，可直接监测分化脂肪细胞的EV分泌。从报告鼠皮下白色脂肪组织中分离APCs，并诱导分化为成熟脂肪细胞。在这些细胞中，CD63-GFP信号被观察到为离散的圆点，当EV分泌被抑制时，CD63-GFP信号在质膜处得到浓集，这与囊泡在阻断释放后积累的现象一致。在正常生长条件下，分泌到培养基中的EV被浓缩，随后通过排斥色谱纯化，从而实现下游功能性和生化分析。

该平台可应用于来自其他脂肪储存库的APC，如附睾白色和棕色脂肪组织，或通过将其分化为特定脂肪细胞，从而实现不同脂肪细胞类型间EV分泌的比较。

这些方法共同引入了强大的遗传工具和互补的 体外 系统，以剖析AdEV的分泌与靶向动态。这些进展揭示了脂肪内部细胞通讯，并为理解AdEVs在健康和疾病中更广泛代谢影响奠定了基础。

引言

脂肪组织越来越被认可为动态内分泌器官，在全身能量稳态中扮演关键角色，具体为^1,2,3,4,5。除了作为脂质储存库的经典功能外，脂肪细胞还调节全身胰岛素敏感性，脂肪团的紊乱——无论是过多还是缺乏——都与胰岛素抵抗和代谢疾病相关 ^6,7,8,9。一种被提出有助于调节能力的机制是通过分泌因子进行细胞间通讯。虽然脂肪因子作为脂肪组织10,11,12,13,14,15,16,17,18的重要内分泌信号已被确立，脂肪细胞还释放大量细胞外囊泡（EV），这些细胞是含有脂质、蛋白质、核酸和代谢物的膜结合颗粒。脂肪细胞分泌的电动汽车（AdEVs）是否也携带糖链，像其他类型的电动汽车一样，目前仍不清楚^。脂肪细胞已被证明是EVs的主要来源，因为在小鼠模型中，约80%的循环外泌体微小RNA源自脂肪细胞，这一点在基础条件下通过脂肪细胞特异性Dicer敲除小鼠得到了^验证。AdEVs在代谢、炎症、胰岛素敏感性和脂肪生成中的作用已被报道，但仍未完全理解 26,27,28,29。其他潜在功能，尤其是介导与其他细胞类型和器官的串扰，仍然大多未知。EVs的丰度²⁶表明它们可能在局部和系统信号传递中发挥重要作用，但AdEVs的生物学意义和作用机制尚未被充分探讨。这一知识空白凸显了建立稳健且专业化方法研究AdEV分泌和功能的必要性。

为弥补这一空白，我们通过将脂质素-Cre小鼠与Stop^fl/fl/CD63-GFP小鼠（株#：036865，JAX）杂交，生成了脂肪细胞特异性CD63-GFP小鼠（AdipCD63-GFP）。使用停止^fl/fl/CD63-GFP同窝兄弟，这些子胎在缺乏Cre的情况下未表达CD63-GFP，作为对照。CD63-GFP报告株已成功用于体内追踪细胞类型特异性EVs，包括内皮和神经元来源的^EV30,31。由于脂肪素仅在成熟脂肪细胞中表达，而不在脂肪细胞前体细胞（APCs）^{中表达32,33，}且CD63是^EVs34的标志物，因此在循环和组织中检测到的GFP⁺EVs可以被特异性地识别为AdEV。因此，本研究将APC中检测到的GFP⁺EV解释为这些祖细胞吸收的AdEV。该报告系统允许在体内和体外直接监测囊泡释放及潜在靶点相互作用，从而支持研究其他类型脂肪组织中的AdEV。值得注意的是，AdEV与其他细胞类型的EV相比脂质含量特别高，使其更具浮力、脆弱，且在传统超速离心法下回收更为困难 35,36,37。高离心力可能损坏这些囊泡，或导致显著的样品损失和污染，从而使下游分析更加复杂。为克服这些限制，我们优化了结合多重低速离心步骤与尺寸排除色谱的工作流程，以最大限度减少剪应力，保持囊泡完整性，提高纯度和产率，从而实现准确的定量和功能研究。CD63-GFP系统与这一优化分离管线共同提供了一种可访问且可重复的方法，用于研究AdEV在脂肪组织串联及全身代谢调控中的分泌与功能。

方案

根据爱因斯坦医学院的动物护理与使用指南，雄性小鼠被群体饲养在22°C、相对湿度30-70%的环境中，采用12小时光照/12小时黑暗循环，提供 自由 取食和饮水，并保持在C57BL/6J的环境下。

1 . 通过 APC摄取体内检测分泌的AdEV

1. 缓冲剂制备
   1. 消化缓冲液：将0.5毫升1M HEPES和0.5克缺乏脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）加入50毫升DMEM，制备HEPES缓冲DMEM。搅拌至溶解。
   2. 洗涤缓冲液：用2.5 mM乙烯二胺四乙酸（EDTA）和4%胎牛血清（FBS）制备PBS。
   3. 制备Liberase和DNase 1存活剂，剂量为5 mg/mL，剂量为5 KU/mL。保存温度为-20°C。 使用前立即解冻。
2. 腹股沟脂肪组织采集与消化
   注：四个月大的AdipCD63-GFP和CD63-GFP对照小鼠通过吸入二氧化碳安乐死。
   1. 使用无菌技术切除脂肪组织，将1克组织放入0.5毫升消化缓冲液中，用无菌剪刀将组织细碎，切成不超过1毫米的块。
   2. 将绞碎组织悬浮于10毫升消化缓冲液中，该缓冲液含有0.5 mg/mL Liberase和50 U/mL DNase 1。
   3. 在轨道振荡器（100转/分钟）下37°C孵育30-60分钟。在培养过程中，通过将管子倒转几次，轻轻混合组织。当溶液显得浑浊且无可见组织碎片时，消化过程即告完成。
3. 装甲运兵车的隔离
   1. 用两体积的消化缓冲液稀释悬浮液，轻轻倒置管子3-4次。
   2. 通过无菌的100微米过滤器去除任何未消化的组织。
   3. 将滤液以300× 克 离心，4°C离心5分钟。
   4. 丢弃上清液脂肪细胞部分，将沉淀标记为基质血管分数（SVF）。
   5. 准备新鲜的1×红细胞（RBC）溶解缓冲液，并用无菌水。通过在冰上培养5分钟，避免光线照射，溶解SVF中的红细胞。
   6. 加入两体积洗涤缓冲液，然后用离心机以400× 克 在4°C下过滤5分钟。
   7. 遵循脂肪组织前体分离试剂盒（小鼠）方案，将SVF重新悬浮在每克组织80微升缓冲液中（PBS，pH 7.2,0.5% BSA，2 mM EDTA）。
   8. 每克组织加入20微升非脂肪细胞前体耗竭鸡尾酒。
   9. 混合后在2-8°C的黑暗中孵育15分钟。
   10. 将样品通过LS柱，收集流动。
   11. 在300 × g 下，在4°C下离心流动（CD31、CD45、Ter119均为阴性），以获得研究所需的APC。
4. 通过共聚焦显微镜检测通过APC摄取分泌的AdEVs。
   1. 将250微升分离的APCs（1×10个⁴ 细胞/mL）从AdipCD63-GFP或CD63-GFP小鼠种子种子到胶原蛋白包覆的8孔腔腔载玻片上，让细胞附着约6小时。
   2. 用4%对甲醛固定细胞10分钟，以保留细胞和EV结构以便成像。
      注：在这些检测中，GFP信号标记AdEV，而在APC中通过共聚焦显微镜检测到的GFP信号表明这些祖细胞对AdEV的摄取。
   3. 用PBS洗洗载玻片三次，安装防衰落介质，并用配备63×油浸物镜的共聚焦显微镜捕捉GFP信号。以0.5微米步长的z系列栈形式获取图像，使用488纳米激光器进行GFP激发并检测500-550纳米发射。
5. 通过流式细胞术检测APC摄取分泌的AdEV
   1. 计数APCs并稀释活性染料（如僵尸色）1：1000,1X色素。将细胞悬浮^于100 微升×10 6个。冰上孵育20分钟，避免光照。
   2. 用洗涤缓冲液清洗一次电池。在300× 克 离心机，4°C下离心5分钟。
   3. 将细胞悬浮在明亮染色缓冲液中，浓度为每100微升1×10至¹⁰⁶ 个细胞。
   4. 用Fc受体阻断试剂（如抗CD16/CD32）1：100冰敷，阻断非特异性结合，持续10分钟。
   5. 在6000× 克 、4°C下预旋Sca-1抗体10分钟。 然后将1微升Sca-1抗体加入APC管，并在冰上培养20分钟，同时用锡纸覆盖管子。
   6. 用1毫升洗涤液冲洗两次，离心300×克，4°C离心5分钟。
   7. 将细胞悬浮在洗涤缓冲液中，温度约为每500微升1×10至⁶ 个细胞，进行流式细胞分选。在配备405纳米紫色激光（太平洋蓝为450/50纳米滤光片）和488纳米蓝光激光（GFP为530/30纳米滤光片）的光谱流式细胞仪上，获取^Sca1+ 和GFP⁺ 细胞的数据。使用仪器运行中的软件分析样本，Sca1⁺ 细胞被封闭，并分析该总体中的GFP⁺ 子集，如 图2所示。

2. 体外检测和分析分泌的AdEV

1. APCs向成熟脂肪细胞的分化
   注意：除特别说明外，所有培养液均保持在37°C，8%_CO2 。
   1. 第0天：将0.2%明胶裹在室温（RT）下30分钟，吸取并播种新鲜分离的APCs，剂量为DMEM/F12 + 1% 青霉素/链霉素（P/S） + 0.1% Primocin，达到100%浓度以实现分化前的浓度。
   2. 第1-8天：更换为MesenCult脂肪生成分化培养基（总共50毫升：45毫升碱基+5毫升补充剂+0.5毫升GlutaMAX+50微升Primocin），第4天更换为新鲜分化培养基。
   3. 第9天：用PBS清洗脂肪细胞两次，然后更换为成熟脂肪细胞培养基（DMEM +1% BSA + 0.2% Primocin），保持16小时。
2. AdEV的隔离与纯化
   1. 先通过40微米滤纸，再通过30微米滤纸，将上述产生的15毫升脂肪细胞培养液传递。
   2. 将过滤液用500×离心5分钟，然后用2000×克离心10分钟，以去除残留的细胞和杂质。
   3. 将滤液通过0.8微米滤纸，然后使用100千达截止超滤单元（样品体积15毫升），在4000× 克 离心15分钟，将介质从15毫升浓缩至0.5毫升。
   4. 将样品装入尺寸排除色谱（SEC）柱上，配备自动分组收集器，并收集F1-8分组。
   5. 使用100千达尔截止超滤装置（4毫升样品体积）浓缩收集的EV组分，随后通过西方墨迹、纳米粒子跟踪分析仪和透射电子显微镜（TEM）验证每个组分的EV含量。
3. AdEV的验证、定量及大小/形态评估
   1. EV标记物的Western blot分析
      1. 将每个组分从400微升浓缩至25微升，然后加入50微升放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。通过加入2×硫酸钠（SDS）加载缓冲液使样品变性，并在4-12%三甘氨酸凝胶上分离蛋白质。
   2. 利用纳米颗粒跟踪分析仪器对EV的尺寸、浓度和质量进行分析。
      1. 分析前，用无菌的0.1微米过滤PBS稀释EV样品，比例为1：1000，确保颗粒浓度落在最佳检测范围内（约10^{7-10 9} particle/mL）。轻轻混合稀释样品，避免形成气泡。
      2. 将样品装入配备高灵敏度科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机、532纳米绿色激光模块，以及10纳米（最高1000纳米）/106至109粒子/mL的检测阈值。
      3. 使用NS Xplorer软件套件进行成像和定量，该软件采用动态观测体积的集中算法。
   3. 透射电子显微镜（TEM）对EV形态的检查
      1. 将集中前收集的50微升电动车提交给核心设施进行电动车负染色。将电动车应用于仅碳的400网格铜网，这些电网已用等离子清洁剂进行等离子清洗。
      2. 短暂吸附后，用蒸馏水冲洗网格，用1%（w/v）醋酸铀酰进行负染色，然后用滤纸去除多余污渍，然后进行自然风干。然后，使用120 KV的透射电子显微镜对网格进行成像。

3. 安全与废弃物信息

1. 在排气柜内使用个人防护装备（PPE）处理对甲醛和醋酸铀酰，因为它们有毒。收集标有危险容器中的醋酸铀酰废物。
2. 将所有生物样本视为潜在感染性，并按照机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的机构生物安全政策和规程处置。

结果

利用共聚焦显微镜APC摄取检测AdEV的方案，我们从AdipCD63-GFP和Stop^fl/fl/CD63-GFP小鼠腹股沟脂肪组织中分离出APCs，并用DAPI染色以观察细胞核。通过共聚焦显微镜观察，Stop^fl/fl/CD63-GFP小鼠的APCs未检测到GFP点（见图1A）。相比之下，从AdipCD63-GFP小鼠分离的APCs在细胞质中表现出许多独特的GFP点（见图1B）。GFP信号显示AdEVs被APCs摄取，因为CD63-GFP标记由仅在成熟脂肪细胞中表达的脂联素启动子驱动，而非APCs中表达的^30,31。这些结果证实了该方法的特异性，并验证了该协议识别AdEV采纳事件的能力。

除了共聚焦显微镜外，体内分泌的AdEVs的APC摄取 也通过流 式细胞术定量。APCs从Stop<...

讨论

该方案通过提供一个稳健且可重复的系统，填补了重要的方法学空白，用于分离和表征AdEV及其被APC吸收。与其他来源的电动车相比，AdEV脂质含量更高且浮力更强，这使得传统的基于超速离心的电动车^{隔离技术效率}较低。然而，大多数已发表的AdEV纯化方案仍依赖超速离心，这可能影响囊泡形态，导致EV聚集体，并导致蛋白质污染^37,44。我们的方案采用≤4,000 ×克的低速串行离心结合尺寸排斥色谱（SEC）纯化AdEV。类似的串联离心-SEC方法已在非脂肪细胞EV中得到验证，其产率和纯度均有所提升⁴⁵。此外，非脂肪细胞来源的EV在避免超速离心后，其生物物理特性的保存度也有所^提升。上述方案首次描述并验证了串联离心-SEC方法在纯化成熟脂肪细胞衍生的AdEV中的应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	费舍尔	AM9260G	500倍稀释
10倍PBS	费舍尔科学	70-013-032	加水稀释1000倍
1 M HEPES	吉布科	15630080	1000倍稀释
脂肪组织祖体分离套件，小鼠	Miltenyi 生物技术	30-106-639	准备使用。
Amicon 超速离心过滤器，100千达 MWCO	西格玛	UFC9100	15毫升样品体积
Amicon 超速离心过滤器，100千达 MWCO	西格玛	UFC9100	4 mL 样品体积
BSA	西格玛	A6003	准备使用。
钙核苷抗体	钙核素	AB22595	1000倍稀释
CD63抗体	ABCAM	AB217345	500倍稀释
CD81	细胞信号传导技术	10037	500倍稀释
康宁 BioCoat 胶原蛋白I培养幻灯片	西格玛	CLS354630	准备使用。
康宁 细胞过滤器	西格玛	CLS431750	40 & mu;孔径 m
康宁 细胞过滤器	西格玛	CLS431752	100 & mu;孔径 m
COX IV抗体	细胞信号传导技术	4844	1000倍稀释
DMEM	吉布科	11965092	准备使用。
DMEM/F-12，GlutaMAX补充剂	热水鱼	10565018	准备使用。
DNASE 1	西格玛	D4513	原装5 KU/mL，温度为-20 & deg;C
GlutaMAX补充剂	吉布科	35050061	100倍稀释
停靠贸易;蛋白酶和磷酸酶抑制剂组合（100X）	热水鱼	78444	准备使用。
HSP70抗体	ABCAM	AB181606	1000倍稀释
Invitrogen eBioscience 10X 红细胞溶解缓冲液（多物种）	费舍尔科学	50-112-9743	水中稀释度为10倍
Izon Science 美国有限公司 QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDP	费舍尔科学	NC2042225	准备使用。
徕卡 Stellaris 8 共焦显微镜	徕卡显微镜	无
Liberase TM 研究级	西格玛	LIBTM-RO	原装5 mg/mL，浓度为-20 & deg;C
Millex MCE 注射器过滤器	西格玛	SLAA025	0.8 & μ;孔径 m
纳米视线专业版	马尔文泛林	无
Novex三甘氨酸迷你蛋白凝胶，4–12%,	热水鱼	XP04120BOX	准备使用。
Novex三甘氨酸SDS样品缓冲液（2个）	热水鱼	LC2676	准备使用。
太平洋蓝抗小鼠Ly-6A/E（Sca-1）抗体	生物传说	108119	25倍稀释
对甲醛溶液（16%）	费舍尔科学	50-980-487	用PBS稀释至4%
多种Strainer S / 30 & micro;m（细胞过滤器）	费舍尔科学	NC0922459	30 & mu;孔径 m
庞索S解	西格玛	P7170-1L	准备使用。
普莫辛	生前者	NC9141851	500倍稀释
ProLong 金防褪入剂含 DAPI	细胞信号传导技术	8961S	准备使用。
纯化抗小鼠CD16/32抗体	生物传说	101301	100倍稀释
RIPA buffer	费舍尔科学	PI89900	水中稀释度为10倍
光谱流式细胞仪（Aurora 3）	Cytek生物科学	无
Syntaxin 4抗体	突触系统	110042	5000倍稀释
Tecnai 20（透射电子显微镜）	国际飞船	无
特格欧-EM	PIE科学有限责任公司	无
长针素抗体	ABCAM	AB18508	5000倍稀释