建立大鼠种植体周围炎模型 通过 上颌钛种植体植入与牙龈卟啉单胞菌-结扎诱导

摘要

本研究通过上颌钛种植体建立了大鼠种植体周围炎模型，包括拔牙、外科植入钛种植体，并在愈合后于种植体颈部周围放置经牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）浸润的结扎线，以诱导炎症性骨吸收。

摘要

种植体周围炎（PI）是导致牙种植体失败的主要原因，其特征为炎性软组织病变及进行性骨吸收，因而需要可靠的动物模型以开展机制与治疗研究。本研究建立了一种新型大鼠模型，通过机械刺激与细菌感染的协同作用，更真实地模拟人类PI的发病过程。选取12只4周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，拔除上颌第一磨牙并经过8周愈合期后，植入钛种植体。在经历4周骨整合后，PI组（n = 6）接受经细菌悬液浸泡的结扎丝处理 牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis） 种植体颈部周围，而阴性对照组（NC组，n = 6）未进行结扎处理。诱导后两周，进行分析 通过 微型计算机断层扫描（micro-CT）和组织学结果显示，与对照组（NC组）相比，牙周炎（PI）组表现出显著的牙槽骨丧失和严重的软组织炎症，包括明显的炎性细胞浸润和组织破坏。该模型有效再现了临床牙周炎的关键特征。其局限性包括采用简化的单一致病菌攻击以及相较于人类牙周炎病程加快。尽管如此，该模型仍为牙周炎的机制研究和治疗探索提供了可靠且具有临床相关性的研究工具。

引言

随着修复牙科的进步，牙种植体的临床应用不断扩展¹。然而，种植体周围炎（PI）作为最常见的并发症，显著影响牙种植体的长期存留，并对患者的口腔健康造成持续性的不良影响²。PI 是一种累及种植体周围组织的病理性炎症状态，主要由菌斑生物膜微生物组的生态失衡所驱动，其特征为种植体周围软组织进行性炎症以及继发的支撑骨丧失^3,4。据估计，PI 在患者层面和种植体层面的患病率分别为 19.53% 和 12.53%⁵，加之其治疗过程复杂且费用高昂，PI 构成了重大的临床挑战和公共卫生负担⁶。

PI 复杂发病机制的阐明以及有效疗法的开发在根本上依赖于能够真实模拟人类疾病的可靠动物模型^7,8。尽管狗和小型猪等大型动物模型具有解剖学上的相似性，但其在深入机制研究中的应用受到高昂成本、伦理与饲养问题以及缺乏物种特异性分子工具的限制⁹。相比之下，啮齿类动物模型具有成本低、易于操作以及丰富的遗传可操作性等优势，有利于对分子通路进行深入研究¹⁰。然而，小鼠模型常受限于体型较小以及手术操作的技术难题¹¹。此外，现有方法中的操作问题进一步加剧了这些局限性，例如小鼠牙周炎模型中常见的局部性病变和结扎线过早脱落¹²。大鼠则成为一种务实的折中选择，其具有更大的手术视野、在骨愈合研究中已确立的应用价值，以及可用于探究特定遗传因素的转基因品系¹³，因而成为构建 PI 模型的高度适宜候选者。尽管如此，大鼠 PI 模型的应用仍受限于手术操作中的技术复杂性，包括可靠的牙齿拔除和稳定的植入物放置。

现有的大鼠模型诱导技术包括丝线结扎^14,15、局部病原体接种¹⁶以及脂多糖注射¹⁷。以往依赖口服细菌灌洗的感染模型常导致生物膜形成不稳定以及炎症反应不一致¹⁸。丝线结扎法常用于促进菌斑快速积聚，然而仅进行结扎所提供的是一种非生理性的机械刺激，且未能引入可控的致病性挑战，因而不足以充分模拟牙周炎（PI）的感染性病因¹⁹。另一方面，使用如牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）等病原体进行单一感染时，往往难以建立稳定的生物膜，且可能无法持续诱导显著的炎症反应²⁰。我们假设，结扎操作可提供双重刺激：丝线缝合材料既作为机械刺激物，又为复杂生物膜的形成提供支架；而引入的关键致病菌 P. gingivalis则启动并维持一种失调性的炎症反应²¹。为了直观地总结这种整合性的双重致病方法及其时间进程，本文提供了建立该联合P. gingivalis-结扎大鼠模型的实验流程与时间线示意图（图1）。本文详细描述了该联合P. gingivalis-结扎模型的建立与验证过程，旨在可靠地再现人类牙周炎的关键骨组织与软组织病理变化，从而提高该模型在临床前研究中的临床相关性与应用价值。

图1：通过细菌负载缝线结扎法建立大鼠种植体周围炎模型的实验流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

样本量是根据先前发表的啮齿类动物种植体周围炎（PI）模型中的常规做法以及可用资源的限制来确定的²²。本研究使用了12只4周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠（由西南医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（川）2024-0046），用于拔牙、种植体植入及诱导种植体周围炎。所有大鼠均饲养于标准的无特定病原体（SPF）屏障环境中，不同实验组的大鼠分别单独饲养。笼具在笼架中的位置每周随机调整一次。通过随机数字生成器将大鼠分配至阴性对照组（NC）或种植体周围炎组（PI组），每组6只。所有大鼠的手术操作顺序均随机安排。所有实验程序均经西南医科大学动物研究伦理委员会批准（批准号：20241111-012），并遵循动物福利指南。本研究严格按照伦理动物实验的3R原则（替代、减少、优化）进行。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 提取前准备

1. 使用高压灭菌法对所有手术器械（#5 牙科探针、持针器、眼科镊、医用棉签、组织镊等）进行灭菌。所有后续操作均须在 II 级生物安全柜内进行，以维持无菌条件。
2. 通过腹腔注射三溴乙醇（250 mg/kg）对大鼠进行麻醉²³（遵循机构批准的实验方案）。通过夹捏后肢足垫时无回缩反射来确认麻醉深度。
3. 使用眼用润滑剂，防止操作过程中角膜干燥。
4. 使用 75% 乙醇溶液彻底消毒所有工作台面。
5. 将大鼠仰卧位固定于稳定的手术平台上。使用橡皮筋向后牵拉上颌和下颌门齿，以实现并维持最大程度的张口状态。使用手术头灯照亮口腔。
6. 用组织镊轻轻夹住舌头并向一侧牵拉。确保牢固固定舌头，以获得清晰且无遮挡的上颌磨牙视野。

2. 拔牙手术步骤

1. 使用聚维酮碘对术区进行消毒。将#5牙科探针置于上颌第一磨牙的远中面（第一与第二磨牙之间的邻间隙），施加近远中方向的力以实现初步松动（图2A）。
2. 将探针重新置于第一磨牙的近中面，再次施加近远中方向的力，进一步松动牙齿（图2B）。
3. 将探针尖端插入腭侧牙龈沟内，结合轻柔的唇腭向旋转运动，并沿牙齿长轴持续施加咬合向压力。继续操作直至牙齿完全脱出牙槽窝（图2C，D）。
4. 在直视下仔细检查拔除的牙齿，确认所有牙根完整，无骨折存在。使用无菌注射器中的生理盐水轻柔冲洗空牙槽窝，以清除残留的血凝块或碎屑（图2E，F）。
5. 通过无菌棉签加压1分钟以实现止血。将舌头复位至解剖位置。将动物留在加热垫上，直至其从麻醉中完全恢复。
6. 术后一周内提供软质饮食及抗生素补充饮水（阿莫西林 250 mg/kg）。
   ​注意：拔牙松动过程中应施加可控且渐进的力，避免突然动作，以防牙根折断或牙槽骨损伤。

图 2：牙齿拔除操作流程。 将牙科探针插入大鼠上颌第一磨牙的远中和近中部位，以松解牙周韧带（A,B）。在腭侧施加旋转力和咬合向力以松动牙齿（C,D）。彻底检查牙槽窝是否存在残留的牙根碎片（E）。显示完整拔出的大鼠上颌第一磨牙（F）。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 植入物放置手术

1. 拔牙后八周，使用无菌12c刀片在无牙牙槽嵴上做一处5 mm的近远中向切口，切至骨面（图3A）。
2. 使用#5探针进行钝性分离，翻起全厚黏骨膜瓣，暴露手术区域（图3B）。
3. 将碳化钨钻头（直径1.5 mm）连接至手动螺丝刀适配器，通过顺时针手动旋转进行骨凿术，期间间断使用生理盐水冲洗以控制产热，在愈合后的拔牙窝内预备深度为4 mm的种植窝洞，同时持续保持触觉反馈，防止穿通皮质骨（图3C）。
4. 插入定制的钛种植体（直径1.8 mm，长度3.2 mm，机加工表面），通过顺时针旋转植入。使用探针检查无动度以确认种植体稳定性（图3D-F）。
5. 继续给予软食饮食及此前所述的抗生素方案，维持一周愈合期。
   ​注意：手术操作应轻柔，避免施加过大的轴向力，以防医源性穿通上颌窦底。

图3植入物放置手术步骤。 使用12号弯刃刀片进行近远中向切口A）。使用牙科探针将黏膜瓣翻起（B). 使用连接在手钻上的1.5 mm碳化钨钻头进行截骨术（C将植入物置入颌骨中 通过 定制的植入物载体（D）。植入后，使用探针检查其移动性（E，F）。定制钛合金种植体（光滑表面螺纹，直径 1.8 mm，长度 3.2 mm），配套种植体夹具（G，H）和微型手钻（I). 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）-配体化缝线的制备

1. 在37 °C下，将P. gingivalis于5 mL脑心浸液（BHI）肉汤中厌氧培养，直至达到10⁹ CFU/mL（OD₆₀₀ =1.0）。
2. 将菌液按1:20比例转接到10 mL新鲜BHI培养基中。
3. 将无菌3-0丝线完全浸入接种后的培养基中，在37 °C下厌氧培养48–72小时，以形成成熟的生物膜。

5. PI 诱导

1. 植入后四周，使用无菌持针器将浸有牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的缝线结扎于种植体颈部，并在邻近牙龈组织处打三重结固定（图4A-D）。
2. 维持结扎线位置2周，同时监测炎症进展。
3. 每日检查结扎线状况，若发生松动或脱落，需以无菌技术及时更换。
   注意：打结时应轻柔分离软组织，避免撕裂，并确保缝线结位于龈下位置。

图4：缝线诱导的种植体周围炎（PI）操作步骤：将预先浸有细菌的缝线（3-0）置于种植体远端的龈下位置（A）。首先打一个结，并用持针器固定以防止结滑脱（B）。随后，再打一个三重结以防止缝线松动（C,D）。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 安乐死与样本采集

1. 经过2周的诱导期后，处死动物 通过 在深度异氟烷麻醉下实施颈椎脱位（遵循机构批准的方案）。使用锐利器械完整剥离带有植入物的上颌骨。
2. 将样本立即浸入4%多聚甲醛中固定24小时。用PBS冲洗去除残留软组织，随后保存于70%乙醇中。
   注意：实验可在此阶段暂停，并将样本置于4 °C条件下用70%乙醇长期保存。

7. 微型计算机断层扫描（micro-CT）分析

1. 根据既定方法使用显微计算机断层扫描技术对样本进行扫描²⁴。
2. 开启扫描仪和计算机电源，启动采集软件。点击辐射安全图标，并等待15分钟预热。
3. 打开扫描室，将样本置于15 mL锥形管中，并用低密度泡沫固定，随后将锥形管固定在旋转台上并置于扫描室内。
4. 启动X射线源（90 kV，80 µA）。点击预览图标以确认最佳位置。设置参数：12 µm分辨率，20 Hz曝光频率，4000总帧数。
5. 使用Recon 1.7.4.0软件重建图像。
6. 在Avatar 1.7.4.0软件中，通过在上颌第一磨牙区域划定感兴趣区域（ROI），分析以下骨参数：骨体积分数（BV/TV）、骨表面积与骨体积比（BS/BV）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁数量（Tb.N）。

8. 组织学处理

1. 将固定后的标本置于10% EDTA（pH 7.4）中脱钙，每72小时更换一次溶液，持续4周。通过针刺试验验证脱钙是否完成。
2. 通过梯度乙醇系列对标本进行脱水：75%乙醇中4小时，85%乙醇中2小时，90%乙醇中2小时，95%乙醇中1小时，以及两次100%乙醇，每次30分钟。
3. 用二甲苯透明处理标本，每次10分钟，更换两次。使用石蜡浸润，每次1小时，更换三次。
4. 将组织包埋于熔融石蜡中，并在-20 °C冷冻台上冷却。修整蜡块后，于4 °C保存10小时，再进行切片。
5. 将石蜡块切成5 µm厚度的切片，在45 °C水浴中展片，然后贴附于载玻片上。于37 °C烘干1小时。
6. 用二甲苯脱蜡，每次5分钟，更换两次。通过梯度乙醇系列再水化：100%乙醇5分钟，90%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟。
7. 用蒸馏水冲洗切片1分钟。用苏木精染色8分钟，然后用流水冲洗。
8. 在1%酸性乙醇中分化3秒，再用流水冲洗以促蓝。用伊红复染5分钟。
9. 通过梯度乙醇系列脱水：70%乙醇10秒，80%乙醇10秒，90%乙醇10秒，100%乙醇10秒。用二甲苯透明处理，每次5分钟，更换两次。
10. 用中性树胶封片，并在光学显微镜下观察。
    注意：二甲苯具有危害性，应在通风橱内操作并佩戴适当的个人防护装备（PPE）。

结果

纳入研究的12只4周龄Sprague-Dawley大鼠均成功完成所有手术操作，并在结扎前表现出稳定的骨整合，符合“术后恢复无并发症”这一预先定义的纳入标准。所有动物均未被排除在分析之外。通过随机数生成器将大鼠随机分配至NC组或PI组（每组n = 6）。在进行micro-CT定量分析和组织病理学评估时，研究人员对分组情况保持盲法，直至结果评估和数据分析结束。所有种植体在为期4周的骨整合阶段及随后2周的结扎阶段均保持稳定，未观察到种植体丢失。

临床表现
NC组与PI组之间的比较分析显示，PI组出现明显的临床表现，包括种植体周围黏膜红斑样改变、明显的牙周袋形成，以及较NC组显著加重的软组织水肿（图5）。

讨论

本研究证明了使用浸有牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的缝线在大鼠模型中诱导种植体周围炎（PI）的可行性，并详细记录了相关的手术操作步骤。啮齿类动物模型，尤其是大鼠模型，在牙科研究中已被广泛用于牙周炎和种植体周围炎的研究，这得益于其易获得性、低廉的饲养成本以及高效的繁殖能力，已有文献对此提供了支持^15,25。尽管大多数大鼠手术可在直视下完成，无需使用手术显微镜²⁶，但由于其口腔空间有限，在手术过程中维持稳定的张口状态仍具挑战性，这是需要特别注意的关键技术环节。

使用#5牙科探针拔除第一磨牙时，需充分松解牙周膜并减少骨阻力，以避免牙根折断。此外，大鼠上颌窦结构精细，进行骨切开时必须格外小心。采用轻柔的旋转钻孔技术并施加最小的垂直压力，可防止上颌窦底穿孔²⁷。

结扎诱导的炎症是动物研究中广泛采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5 牙科探针	Zhengzhou Kangdetai Medical Co., Ltd., Zhengzhou,CN	6970327120856	牙齿松动与拔除
1% 酸性乙醇	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, CN	10000018 (Ethanol) & 10000118 (Hcl)	苏木精分化
10% EDTA (pH 7.4)	Servicebio Technology Co., Ltd, Wuhan, CN	G1105	骨组织脱钙
100% 乙醇溶液	Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	E708068	完全脱水与溶剂配制
12c 刀片与手术刀	Tianda Medical Co., Ltd., Huaian, CN	6951933811154	黏骨膜瓣制备
3-0 丝线结扎线	Jinhuan Medical, Shanghai, CN	NC9201232	结扎
4% 多聚甲醛	Biosharp, Hefei, CN	BL539A	组织固定
70% 乙醇	实验室配制	-	样本保存
75% 乙醇溶液	Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	E885996	表面消毒与初步脱水
阿莫西林 50 μg/mL	North China Pharmaceutical Co., Ltd, Shijiazhuang, CN	H13020635	饮水中添加抗生素
Avatar 软件	Avatar Integrated Systems Inc, Munich, DE	-	骨参数分析
BHI 培养基	Crown Lab Supplies Inc, British Columbia, CA	110052	牙龈卟啉单胞菌培养
CT-Voxel	Bruker Corporation, Billerica, MA, USA	-	显微CT图像可视化
伊红	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, CN	G1100	胞质染色
乙醇梯度溶液（80%、90%、95%）	实验室配制		组织逐步脱水/复水
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA	Version 9.0.0	统计分析与图表生成
头灯	Shenzhen Supfire Lighting Co., Ltd, Shenzhen, CN	HL23-X	口腔内照明
苏木精	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Beijing, CN	H8070	细胞核染色
种植体手柄	Sichuan Weisida Medical Device Co., Ltd,Sichuan, CN	Unique product	手动种植体植入
异氟烷	RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, CN	R510-22-10	吸入麻醉维持
手动螺丝刀适配器	Diqin Decorative Materials Co., Ltd, Hangzhou, CN	DQ-80013	骨凿术
医用棉签	Kekang Pharmaceutical Co., Ltd, Suzhou, CN	HN-02	止血
显微CT扫描仪	Servicebio Technology Co., Ltd, Wuhan, CN	VNC-102	μCT扫描
持针器	Shanghai Medical Instruments Co., Ltd, Shanghai, CN	J32110	缝合结扎
中性树胶	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. Beijing, CN	G8590	组织切片封片
眼科镊	Solingmed Technology Co., Ltd, Shenzhen, CN	SS-5002	结扎线放置
石蜡	Amin Noori General Trading LLC, Dubai, AE	8012-95-1	组织包埋
PBS	Procell Life Science & Technology Co., Ltd, Wuhan, CN	PB180327	组织冲洗
牙龈卟啉单胞菌	等效品	-	炎症诱导
聚维酮碘	成都永安制药有限公司, 成都, CN	H51023539	消毒
Recon 软件	Recon Technology Ltd, Cayman Islands,GB	Version 1.7.4.0	显微CT图像重建
橡胶带	浙江跃亿橡胶制品有限公司, 台州, CN	VYR43*1.4	下颌牵引与固定
SD 大鼠	西南医科大学实验动物中心, 泸州, CN	SCXK(Chuan)2024-0046	手术操作
锐利手术剪	湖南柯福尔医疗科技有限公司, 长沙, CN	1.0806E+13	线材剪切
组织镊	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11000-12	舌部牵引与固定
钛种植体 (Ø1.8×3.2mm)	四川威斯达医疗器械有限公司, 四川, CN	Unique product	钛种植体
三溴乙醇（Avertin）	河南赛厚生物科技有限公司, 郑州, CN	-	腹腔麻醉
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司, 上海, CN	10023418	组织透明与脱蜡