长链非编码RNA IRAIN通过IGF1R-JAK-STAT-BIRC5轴驱动胶质瘤的免疫代谢重编程

摘要

通过在多个队列中整合机器学习方法，我们构建了一个稳健的胶质瘤IMRG预后标志物。IRAIN显著下调，其表达水平与肿瘤分级呈负相关，并与患者生存期呈正相关，同时IRAIN可抑制IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5信号通路，从而抑制肿瘤增殖、迁移和血管生成。研究结果提示IRAIN及IMRG可作为潜在的生物标志物和治疗靶点。

摘要

胶质瘤是一种侵袭性强、治疗选择有限且预后较差的恶性肿瘤。其进展与代谢重编程和免疫逃逸密切相关，凸显了识别整合这些过程的分子调控因子的重要性。本研究建立了一个稳健的免疫代谢相关基因（IMRG）预后标志物，并阐明了长链非编码RNA IRAIN通过IGF1R-JAK-STAT-BIRC5轴调控胶质瘤免疫代谢的作用机制。我们分析了来自TCGA、CGGA（693/325）和GEO（GSE43378）队列的转录组和临床数据。通过差异表达分析和加权基因共表达网络分析（β = 8）确保无标度拓扑结构，并采用结合十种机器学习算法的留一交叉验证框架构建了101个预后模型。最终确定的17个基因IMRG标志物在所有队列中均得到验证，且可独立预测总体生存率。功能实验证实，IRAIN过表达可抑制IGF1R，降低JAK2/STAT3磷酸化水平，并下调BIRC5表达，从而促进细胞凋亡并减少血管生成。IRAIN低表达与免疫抑制性Treg细胞和M2型巨噬细胞增多以及肿瘤微环境评分升高相关，提示其具有免疫逃逸表型。这些发现确立了IRAIN在胶质瘤免疫代谢重编程中的关键调控作用，并验证了IMRG标志物作为可靠预后工具的价值，揭示了IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5通路是连接胶质瘤免疫与代谢失调的机制桥梁，为精准治疗提供了潜在靶点。

引言

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，尽管神经外科手术、放射治疗和化学治疗已取得进展，但它仍然是人类最致命的癌症之一。高级别胶质瘤，尤其是多形性胶质母细胞瘤（GBM），具有快速增殖、弥漫性浸润和不可避免复发的特点^1,2。近年来，一系列有效的治疗策略相继出现，如外科干预、免疫治疗和化疗³。即使接受最大程度的治疗，患者的中位生存期仍仅为约14-18个月，这凸显了开发新型治疗策略和预后生物标志物的迫切需求⁴。

肿瘤微环境（TME）与癌细胞之间的相互作用是驱动胶质瘤侵袭性生长和分子异质性的关键因素。多种免疫组分，包括小胶质细胞、神经前体细胞、血管细胞和适应性免疫细胞，均深度参与了TME的形成^5,6,7。近年来，免疫治疗取得了显著进展，推动肿瘤学进入一个变革性时代。然而，免疫检查点阻断（ICB）及其他免疫治疗策略在胶质瘤中的疗效仍十分有限⁸。此类治疗在胶质瘤中失败的原因源于其微环境的若干内在特征，即肿瘤突变负荷低、瘤内异质性显著、血脑屏障....

方案

所有涉及人体组织的操作均遵守机构指南和《赫尔辛基宣言》，并已获得福建医科大学伦理审查委员会的批准（批准号：2021KYB089）。在获取组织样本前，已从所有参与者处获得书面知情同意书。

基因表达与生存分析
从多个公共数据库获取了RNA测序数据及相应的临床信息。1）TCGA队列：从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov/）下载了175例多形性胶质母细胞瘤（GBM）和534例低级别胶质瘤（LGG）样本的RNA-seq（FPKM）数据；2）正常对照：从UCSC Xena数据库（https://xenabrowser.net/datapages/）下载了211例正常脑组织和662例胶质瘤组织的表达谱；3）外部验证：从中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，http://www.cgga.org.cn）获取了CGGA693和CGGA325队列的数据；4）GEO数据集：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载了包含50例胶质瘤样本表达和临床数据的GSE43378数据集。所有原始计数数据均转换为每百万转录本数（TPM），并进行log₂转换。对于已标准化的数据集，检查其表达矩阵以确保分布具有可比性。排除在超过....

结果

IRAIN 在胶质瘤中表达下调，并与不良的临床病理特征相关
分析流程如图1所示。首先通过qRT-PCR检测了原代星形胶质细胞、胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中IRAIN的表达水平。与正常星形胶质细胞相比，低级别和高级别胶质瘤组织以及四种胶质瘤细胞系（SHG44、A172、U251和T98G）中的IRAIN水平均显著降低（图2A）。与上述结果一致，对TCGA和CGGA队列RNA-seq数据的分析显示，胶质瘤样本中IRAIN的表达显著低于正常脑组织（图2B）。当根据IRAIN表达水平对患者进行分组时，低IRAIN表达组患者的总生存期和无进展生存期均显著短于高IRAIN表达组患者（两者P < 0.001；图2C）。亚组分析进一步显示，在1p/19q非共缺失、IDH野生型、MGMT未甲基化以及胶质母细胞瘤（GBM）病例中，IRAIN表达均降低，老年患者（>65岁.......

讨论

胶质瘤仍然是中枢神经系统最具致死性的恶性肿瘤之一，其特征是显著的瘤内异质性和对常规治疗的耐药性。尽管采用手术切除联合放化疗，复发率和死亡率仍然很高，尤其是胶质母细胞瘤患者的中位生存期在过去几十年中改善有限^4,24。越来越多的证据表明，肿瘤微环境（TME）中的代谢重编程和免疫抑制是决定胶质瘤侵袭性的关键因素^15,25。然而，具有相似临床特征的患者往往表现出显著的分子和代谢异质性，这凸显了开发能够同时反映胶质瘤生物学中免疫和代谢维度的整合型生物标志物的必要性。

本研究中，我们鉴定并功能表征了与IRAIN失调相关的免疫代谢相关基因（IMRGs）。通过差异表达分析、WGCNA分析和Cox回归分析，结合十种机器学习算法及101种模型组合，采用集成的留一交叉验证框架，构建了一个包含17个基因的IMRG预后标志物。最优的随机生存森林-弹性网络模型（α = 0.3）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Annexin V-PI 凋亡检测试剂盒	Southern Biotechnology，美国阿拉巴马州伯明翰	NA	用于评估细胞凋亡
Annexin V-PI 凋亡检测试剂盒	Southern Biotechnology	10010-02	用于通过流式细胞术评估细胞凋亡。
抗IGF1，抗IGF1R，抗JAK2，抗STAT3，抗Survivin，抗β-肌动蛋白	Abcam	ab182408, ab108596, ab109085, ab76424, ab8227	用于信号通路 Western Blot 分析的抗体。
BiocManager	CRAN	1.30.25	在 R 中安装和管理 Bioconductor 软件包 ≥ 3.6.
伯乐Cfx96系统	Bioconductor	1.5.1	程序化访问 STRING 蛋白质–蛋白质相互作用。
Caret	CRAN	0.4	生存模型的时间依赖性ROC/AUC
中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）	NA	CGGA693 和 CGGA325	用于模型构建与验证
clusterprofiler	Bioconductor	2.18.0	解析MAF文件；计算肿瘤突变负荷（TMB）和突变图谱。
相关图	CRAN	3.5.0	常规绘图（箱线图、小提琴图、散点图、趋势线）。
Coxboost	CRAN	7.3-60	逐步Cox模型选择的stepAIC方法。
数据表	CRAN	readr 2.1.5	快速读取分隔符文件；强大的 UTF-8 处理能力。
剂量	Bioconductor	3.17.0	人类基因注释（Entrez、Ensembl、SYMBOL 映射）
动态树切割	CRAN	1.73	加权基因共表达网络分析；pickSoftThreshold，TOM，模块检测
埃德格	Bioconductor	3.56.2	差异表达分析（voom/线性模型）；Wilcoxon/经验贝叶斯方法；火山图/热图输入数据
Enrichplot	Bioconductor	3.26.2	疾病本体富集与GSEA辅助工具（与clusterProfiler联用）。
Flashclust	CRAN	1.63-1	WGCNA模块检测中的自适应分支剪切法
Gbm	CRAN	1.12	用于生存分析的有监督主成分方法
基因表达综合数据库（GEO）	NA	GSE43378	用于模型构建与验证
GEOquery	Bioconductor	NA	下载并解析 GEO 数据集。
ggplot2	CRAN	1.0.12	表达特征的出版级热图。
Glmnet	CRAN	3.3.1	用于右删失结果的随机生存森林。
辣根过氧化物酶标记的兔二抗	Abcam	ab6721	用于 Western Blot 检测的二抗。
人胶质母细胞瘤细胞系（SHG44、U251、A172、T98G）	美国组织培养收藏中心	NA	用于胶质瘤研究的人类胶母细胞瘤细胞系。细胞在 DMEM + 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺中培养。
Igraph	CRAN	10.0.1	访问 MSigDB 基因集（例如，代谢相关 MRG）；提供便捷的整洁数据框。
Image J 软件	美国媒体网络学公司	152	用于可视化
编码lncRNA-IRAIN的慢病毒载体	GeneChem，中国上海	NA	用于转染胶质瘤细胞和HEB细胞以建立稳定克隆的慢病毒载体。
Limma	Bioconductor	3.48.0	批次校正（ComBat）与替代变量分析。
Maftools	Bioconductor	1.52.0	Harrell’一致性指数（C指数）和生存比较工具。
质量	CRAN	4.1-8	惩罚性Cox模型：Lasso、Ridge和Elastic Net
Msigdbr	CRAN	0.0.5	生存数据的支持向量机方法
MTT	Sigma-Aldrich	M2128	用于细胞增殖检测。
正常胶质细胞（HEB）	美国组织培养收集中心	NA	用于对比研究的正常人胶质细胞系。培养于DMEM + 10% FBS培养基中。
Org.Hs.Eg.Db	Bioconductor	4.8.3	GO/KEGG 富集分析和 GSEA；支持多种 ID 类型。
Pheatmap	CRAN	2.0.0	数据科学语法；包括用于数据处理与绘图的 dplyr、tidyr、purrr、ggplot2。
Plsrcox	CRAN	1.5	基于似然的Cox模型提升方法
PVDF膜	Millipore	IPVH00010	用于SDS-PAGE后蛋白质转印的膜。
Randomforestsrc	CRAN	6.0-94	统一重采样（包括留一交叉验证）、调参网格和模型流程。
Readr	CRAN	NA	从 UCSC Xena 获取矩阵/表型数据（例如 TCGA/GTEx 数据中心）。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（12%）	伯乐（Bio-Rad）	185-5096	用于定量 PCR 的系统。
Stringdb	Bioconductor	1.20.3	富集结果的可视化（点图、cnet图、脊线图）。
Superpc	CRAN	1.7.7	适用于Cox模型的偏最小二乘回归。
Survcomp	Bioconductor	3.42.4	在需要时进行计数标准化和离散度估计（可选，用于补充 limma voom）。
存活率	CRAN	1.01-2	WGCNA 使用的快速层次聚类（可选）。
Survivalsvm	CRAN	2.2.2	广义提升回归建模（梯度提升）。
Survminer	CRAN	3.8-3	Cox 比例风险模型；Kaplan–生存曲线。
TCGAbiolinks	Bioconductor	T9039	程序化访问 TCGA 数据；下载并准备表达数据和临床数据。
癌症基因组图谱计划（TCGA）	NA	https://www.cancer.gov/tcga；175 例 GBM 和 534 例 LGG	用于模型构建与验证
Tidyverse	CRAN	1.17.6	大规模矩阵/表格的高性能数据处理
Timeroc	CRAN	0.5.0	KM可视化与风险表绘制。
TRIzol	Invitrogen	15596026	细胞RNA提取试剂
UCSC Xena	NA	https://xenabrowser.net/datapages/	用于模型构建与验证
Ucscxenatools	伯乐（Bio-Rad）	4561044	用于蛋白质印迹分析中的蛋白质分离。
Wgcna	CRAN	0.95	检查点基因与特征关系的关联矩阵