Eupatorium lindleyanum DC. 中分离的倍半萜内酯在啮齿类动物模型中的抗炎作用

摘要

本研究表明，从石胡荽（Eupatorium lindleyanum DC.）中提取的倍半萜内酯（SLEL）在二甲苯诱导的小鼠耳肿胀和角叉菜胶诱导的大鼠足跖肿胀模型中均表现出显著的抗炎作用，其机制包括减轻组织病理学损伤、减少细胞因子释放以及抑制NF-κB信号通路的活化。

摘要

急性炎症是多种免疫相关疾病中的一种基本病理过程。Eupatorium lindleyanum DC. 是一种传统药用草本植物，富含倍半萜内酯（SLEL），已有研究报道其具有药理活性；然而，其抗炎作用及相关分子机制尚未完全阐明。本研究采用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型和角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀模型来诱导急性炎症反应。通过苏木精-伊红染色评估组织损伤和炎症细胞浸润情况。采用ELISA法检测血清中促炎细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的水平，并通过定量PCR（qPCR）分析其在炎症组织中的转录表达。通过蛋白质印迹法（western blotting）检测NF-κB通路相关蛋白（包括磷酸化的IκBα和p65）的变化。SLEL处理可减轻耳部和足部肿胀，并改善急性炎症的组织病理学特征，包括组织水肿、炎症细胞浸润和血管充血。同时，SLEL给药与血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平降低以及炎症组织中Tnf-α、Il-6和Il-1β的mRNA表达下调相关。蛋白质印迹分析显示，SLEL处理后炎症组织中IκBα和p65的磷酸化水平降低，提示NF-κB相关信号事件受到调控。综上所述，本研究建立了一种用于评估SLEL在急性炎症模型中抗炎活性的实验流程，并表明其作用机制与促炎细胞因子表达减少及NF-κB通路相关信号改变有关。

引言

炎症是由病原体入侵或组织损伤引发的一种复杂防御反应，在限制感染、清除有害刺激以及促进组织修复中发挥关键作用¹。虽然受控的炎症反应对维持组织稳态至关重要，但过度或持续的炎症可导致组织损伤、器官功能障碍以及慢性疾病的进展。临床上，炎症表现为红、肿、热、痛，严重时可引发全身性病理反应。越来越多的证据表明，炎症调控失常与癌症、心血管疾病及自身免疫性疾病的发生发展密切相关²˒³。

目前，非甾体抗炎药（NSAIDs）是用于控制炎症最广泛使用的药物。尽管NSAIDs在缓解症状方面具有疗效，但长期使用常伴随不良反应，包括胃肠道刺激、超敏反应和肝毒性⁴，这限制了其临床应用。因此，人们越来越关注寻找具有更好安全性的替代性抗炎剂。天然产物，包括传统草药，已被探索作为具有免疫调节特性的生物活性化合物的潜在来源。然而，对于有关低毒性或系统性调节功能的泛化性说法应谨慎对待，并需在明确的疾病模型中通过实验加以验证⁵。

Eupatorium lindleyanum DC. 是一种传统药用植物，其特征性植物化学成分包括倍半萜内酯，主要为吉马烷型（guaianolide）和桉烷型（eudesmanolide）化合物，此外还有大根香叶烷型（germacranolide）和黄樟烷型（xanthanolide）化合物⁶。已有研究表明，Eupatorium lindleyanum DC. 的提取物在多种实验条件下表现出降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤和抗炎活性⁶。特别是，Eupatorium lindleyanum DC. 的乙醇提取物在脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤模型中显示出保护作用⁷。然而，SLEL 的抗炎活性及其在经典急性炎症模型中的作用仍缺乏充分表征。

为弥补这一空白，我们采用了两种互补的急性炎症模型：小鼠巴豆油诱导耳水肿模型，可捕捉快速的神经源性和血管性炎症反应；以及大鼠角叉菜胶诱导足跖水肿模型，该模型已得到广泛验证，能够反映涉及细胞因子产生和细胞浸润的时间依赖性急性炎症过程。其他模型（如脂多糖诱导的全身性炎症）未被选用，因其更侧重于全身免疫激活，而非局部组织水肿，且在进行配对的组织水平组织学与分子分析方面适用性有限⁸。

通过这种联合模型策略，采用定量水肿测量、苏木精和伊红（H&E）染色的组织病理学评估、血清细胞因子谱分析、组织水平的转录分析以及NF-κB相关蛋白变化来评价炎症反应。该方案特别适用于急性炎症中抗炎活性的筛选，尤其关注水肿形成、细胞因子表达及通路相关分子指标的变化。然而，应认识到急性模型的局限性，包括向慢性炎症状态外推的限制，以及从组织水平信号变化推断因果关系时的解释局限。

总体而言，本研究强调了一种基于实验方案的方法，该方法将互补的急性炎症模型与配对的组织学和分子分析相结合，为评估植物来源化合物的抗炎潜力提供了一个可重复的框架。

方案

动物研究方案已获得重庆医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC-CQMU-2025-10073）的批准。

倍半萜内酯富集组分（SLEL）的制备

Eupatorium lindleyanum DC. 的干燥药材经粉碎后，用70%（v/v）乙醇在减压条件下回流提取两次，每次提取溶剂与药材的体积质量比为10:1（v/w），提取时间为2小时。合并提取液，过滤后在≤60 °C条件下减压浓缩，再经真空冷冻干燥，得到粗乙醇提取物粉末。

将干燥的提取物完全溶解于蒸馏水中（终浓度：100 mg/mL），依次经过聚酰胺树脂柱层析和D101大孔吸附树脂柱层析，以富集倍半萜内酯成分。待吸附平衡后，用蒸馏水洗涤D101树脂以去除极性杂质，随后用无水乙醇进行洗脱。乙醇洗脱后，收集的馏分在减压条件下浓缩，并经冷冻干燥得到SLEL组分，储存于−20 ℃备用。

采用超高效液相色谱平台进行分离，流动相系统为乙腈和含0.1%（v/v）甲酸的水溶液组成的二元体系。梯度程序包括：初始25分钟低有机相比例的等度洗脱，随后短暂线性梯度升至70%乙腈，接着在90%乙腈的高有机相条件下进行洗脱，最后重新平衡至初始条件。系统流速为0.25 mL·min⁻¹，柱温为35 °C，进样体积为0.1 µL（补充图S1）。

动物

本研究共使用36只雄性Sprague-Dawley大鼠（200 ± 20 g）和36只雄性BALB/c小鼠（20 ± 2 g）。动物饲养于标准条件下（22 ± 2 ℃，55 ± 5%湿度，12小时光照/黑暗循环），可自由摄食和饮水。实验前动物适应环境7天，并每日监测其总体健康状况。所有操作均在尽量减少动物痛苦的前提下进行，采血和组织采集前均给予麻醉处理。

小鼠二甲苯诱导性耳水肿

小鼠耳肿胀模型的建立方法如前所述⁹。小鼠适应环境后，被随机分为六组（每组 n = 6）：对照组（CG）、模型组（MG）、地塞米松组（DEX，10 mg/kg）、SLEL低剂量组（75 mg/kg）、中剂量组（150 mg/kg）和高剂量组（300 mg/kg）。所有处理均通过口服灌胃给药，每日一次，连续7天（最终给药体积为10 mL/kg）。末次给药1.5小时后，除对照组外，其余各组在右耳两面均匀涂抹30 µL二甲苯以诱导炎症反应。30分钟后，小鼠被麻醉，采集血液样本，并从双耳相同解剖位置打取直径8 mm的圆形耳片。

大鼠中由角叉菜胶诱导的足爪水肿

采用卡拉胶建立大鼠足跖水肿模型，方法如前所述¹⁰。将大鼠随机分为六组（每组 n = 6）：对照组（CG）、模型组（MG）、地塞米松组（DEX，5 mg/kg）以及 SLEL 低剂量组（50 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）和高剂量组（200 mg/kg）。各组药物均通过口服给药，每日一次，连续7天（10 mL/kg）。在末次给药前测定足跖基础体积。末次给药后30分钟，将0.1 mL 1%（w/v）卡拉胶溶液皮下注射至右后足跖部。使用体积描记仪在注射后1、2、3和4小时测定足跖体积。足跖水肿程度按以下公式计算：

足跖水肿率（%）=（Vt − V0）/ V0 × 100%

组织学检查

功能评估后立即采集耳部和足部组织。组织在室温下用10%中性缓冲甲醛固定72小时，经石蜡包埋，切片（5 µm），并根据标准方案进行H&E染色¹¹。

酶联免疫吸附测定（ELISA）

血清样本在 4 ℃ 条件下以 3,000 × g 离心 10 分钟获得。根据标准操作规程，使用市售的 ELISA 试剂盒对 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平进行定量检测。

Western印迹分析

使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从耳部和足部组织中制备总蛋白提取物。采用BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白（每样本30 µg）进行SDS-PAGE电泳分离，并转至PVDF膜上。膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1小时，随后在4 °C下与一抗孵育过夜，再在室温下与HRP标记的二抗孵育1小时。使用增强型化学发光法检测免疫反应条带，并用ImageJ软件进行定量分析。

定量实时 PCR（qRT-PCR）

使用材料表中列出的RNA提取试剂从耳组织和足组织中提取总RNA。取1 µg总RNA，按照试剂盒生产商的说明，使用商用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。采用SYBR Green法进行定量PCR检测，反应体系为10 µL，使用基因特异性引物（表1），并按照两步扩增程序进行。详细的反转录条件和PCR扩增循环参数见实验方案部分。相对转录水平采用2^⁻ΔΔCT法计算，以Gapdh作为内参基因。

数据与统计分析

数据以均值 ± 标准差表示。两组之间的统计学比较采用非配对的 Student t 检验，而涉及两组以上比较的分析则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。统计学显著性定义为 p < 0.05。显著性标记如下：# p < 0.05 和 ## p < 0.01 表示与对照组（CG）相比；* p < 0.05 和 ** p < 0.01 表示与模型组（MG）相比。

结果

通过UPLC-Q/TOF/MSn分析SLEL中的化学成分

采用UPLC-Q/TOF-MSn在正离子和负离子模式下分析了SLEL的化学成分。共鉴定出9种倍半萜内酯为主要成分（补充图S1）。分子式通过观察到的加合离子确定，正离子模式包括[M+H]⁺和[M+Na]⁺，负离子模式包括[M−H]⁻和[M+HCOO]⁻（补充表S1）。

SLEL在二甲苯诱导的耳肿胀试验中的作用

在模型组小鼠中，于诱导后30分钟按方案局部应用二甲苯后，耳片重量较对照组显著增加（补充图S2）。连续7天每日口服给予SLEL可剂量依赖性地降低耳片重量，其中SLEL-H组的减轻效果最为明显（补充图S2）。

...

讨论

本研究采用两种经典的急性炎症模型——小鼠耳廓二甲苯致炎水肿模型和大鼠足跖角叉菜胶致炎水肿模型，对菊科泽兰属植物Eupatorium lindleyanum DC.（SLEL）中的倍半萜内酯成分进行了评价。通过整合组织病理学评分、血清细胞因子检测、组织水平mRNA定量以及蛋白信号通路分析，该实验方案在一个完整的实验流程中实现了对局部和全身性炎症反应的多层次表征。

在预定的终点时间（二甲苯给药后30分钟及角叉菜胶给药后4小时），组织学评估显示，与模型对照组相比，SLEL处理组动物的水肿、炎性细胞浸润及组织结构破坏均有所减轻。半定量评分进一步支持了这些结果，使得观察结果的可重复性超越了单纯的定性判断。一致地，血清中促炎细胞因子水平以及组织中细胞因子mRNA表达均下降，同时IκBα和p65的磷酸化水平降低，提供了在这些急性诱导条件下炎症相关信号通路状态的分子层面证据。综上，这些多层次的检测结果支持本方案适用于关联急性炎症的宏观、组织学及分子指标。

需要注意的是，二甲苯和角叉菜胶模型表现出不同的炎症动力学特征和NF-κ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗GAPDH	ImmunoWay	YN5585
抗IκBα	Cell Signaling Technology	4812
抗P65	Abmart	TA5006
抗p-IκBα	Cell Signaling Technology	2859
抗p-P65	Abmart	TP70621
BCA	碧云天生物技术有限公司	P10010
IL-1β检测试剂盒	厦门慧嘉生物科技有限公司	EHJ-20537r
IL-6检测试剂盒	厦门慧嘉生物科技有限公司	EHJ-20746r
微量移液器	Eppendorf
酶标仪	基因有限公司	Odyssey Fc
PVDF膜	Millipore	IPVH00010
逆转录试剂盒	MedChemExpress	HY-K051A
RIPA裂解液	碧云天生物技术有限公司	P0013B
SYBR Green Mastermix	MedChemExpress	HY-K0522
TNF-α检测试剂盒	厦门慧嘉生物科技有限公司	EHJ-20039r
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018CN
超低温冰箱	SANYO