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一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

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DOI：

10.3791/69868

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2026年6月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，可实现常染色质、异染色质和RNA聚合酶II（RNAP II）的可重复空间定位作图。该方案能够在致密的细胞核环境中实现高效的多色标记，包括染色质相关靶标，从而实现可靠的同步检测。

摘要

超分辨率显微镜显著提升了我们突破衍射极限研究生物结构的能力，使其在研究染色质、核纤层以及核仁等致密排列的核结构时不可或缺。染色质具有多尺度的组织结构——从纳米尺度的核小体到微米尺度的结构域——这要求成像技术同时具备高分辨率和分子特异性。单分子定位显微镜（SMLM），尤其是随机光学重建显微镜（STORM），能够精确绘制表观遗传标记的分布，为理解染色质的结构与功能提供关键信息。然而，在细胞核环境中进行多标记成像面临独特挑战，包括抗体可及性降低、非特异性结合增加以及荧光染料不稳定等问题。为解决这些问题，我们提出了一种针对高密度核环境优化的顺序免疫标记方案，可实现信号串扰最小、信号衰减较少的稳健三色SMLM成像。该方法包括优化的缓冲液配方、荧光染料选择以及抗体验证策略，以确保多个靶标间可重复且高保真的标记效果。尤为重要的是，我们将该实验方案与计算分析流程相结合，利用某一分子靶标的定位点作为空间锚点（种子点），量化不同靶标间的距离、局部密度以及多标记共定位亲和性。这使得在纳米尺度上对染色质组分进行精细的空间分析成为可能。本方案为致密亚细胞环境中的多组分成像与定量分析提供了可重复的技术框架，为研究染色质等复杂核结构的研究人员提供了一种强有力的工具。

引言

单分子定位显微镜（SMLM）的出现使得在纳米尺度上对生物结构进行前所未有的探索成为可能1,2,3,4,5。除了单靶标成像外，多色 SMLM 的发展进一步推动了该领域，能够同时可视化多种分子种类以及亚衍射极限结构之间的空间和时间关系6,7,8,9,10,11。然而，由于细胞核内 DNA 具有密集的聚合物特性以及抗体在此环境中有限的可及性，将多重 SMLM 应用于广泛分布的组蛋白修饰仍具有挑战性12,13,14,15,16,17,18。

染色质呈现出一种多层次、多尺度的结构组织，其尺度范围跨越多个数量级，从纳米级的核小体组装到微米级的细胞核架构。在最大尺度上，染色体占据各自独立的染色体区域，在此区域内，基因组进一步划分为A/B区室和拓扑关联结构域（TADs），后者通过环挤出等机制限制远距离调控相互作用。19,20,21,22在亚200 nm尺度上，染色质以无序聚合物形式组织，由异质性包装结构域（PDs）构成，而非离散的常染色质和异染色质区块，其中转录活跃区域优先定位于PD边界处23,24,25,26,27,28,29在最小尺度上（5–20 nm），染色质由不规则的核小体组装体和核小体簇构成，表明不存在统一的高阶折叠模式，凸显了基因组结构具有随尺度变化的涌现特性。24,26,30随着基于测序的方法（如染色质免疫沉淀测序和高通量染色质构象捕获）的迅速发展19,30,31,32,33，已鉴定出染色质中观组织结构的多种特征31,32然而，与成像技术不同，这些方法无法捕捉到只有在解析这些结构后才能观察到的空间几何特征。电子显微镜技术，如染色质电子显微镜（ChromEM）24）以及染色质扫描透射电子显微镜（ChromSTEM）25) 揭示染色质具有异质性，并在50–200 nm的尺度上组织成致密结构域25,28,29尽管这些技术能够实现高分辨率以识别染色质压缩结构域，但它们无法提供SMLM所能实现的分子特异性定位。DNA点累积纳米拓扑成像技术（DNA-PAINT）22以及多重荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）19实现高重数检测；然而，DNA-PAINT 受到寡核苷酸富集的细胞核环境中随机结合事件引起的背景噪声显著影响12,34，而传统的基于热变性的FISH方法会破坏染色质原有的折叠结构。先前的研究已应用超分辨率成像技术在此尺度上探究染色质结构，并发现其具有混合型的包装结构域，与此前的相分离模型相悖12,23,34,35该方案源自先前发表的一篇论文，该论文探讨了这些发现的生物学意义34因此，鉴于其高分辨率和多重检测能力，基于免疫染色的dSTORM仍然是在接近天然条件下进行多色染色质成像的最可行策略。

该方案并非首个实现对两个以上细胞核靶标的标记，此前已有研究对单个蛋白质复合物或基因进行了标记12,36。尽管已成功标记核小体上的组蛋白翻译后修饰，染色质的多色单分子定位显微镜（SMLM）标记、成像与分析仍面临重大挑战。首先，在致密的染色质环境中进行免疫染色时，需优化抗体浓度、孵育顺序和缓冲液组成，以确保充分的渗透与结合，同时避免背景信号过高。其次，必须进行全面的多标记分析，因为常染色质、异染色质以及RNA聚合酶等酶之间的相互作用可能远超简单的二元排斥关系。迄今为止，在染色质dSTORM成像中实现的最多荧光颜色数仍为两种18,37,38,39。

本文介绍了一种用于三色染色质单分子定位显微成像（SMLM）的稳健实验方案及分析方法。我们的染色流程优化了抗体孵育时间，并采用改进的成像缓冲液40，以支持多标记样本的长时间成像。我们进一步描述了用于双色距离分析和三色联合密度分析的计算流程，从而实现对异染色质、常染色质与转录机制之间关系的定量表征。与早期提示异染色质与常染色质相互分离的双色染色质SMLM研究不同，三色染色质成像揭示了基因组被组织为多个压缩结构域，其中常染色质和活跃转录区域定位于组成型异染色质核心的外围34。

本方案为多色染色质单分子定位显微镜（SMLM）实验提供了可重复的操作框架，并建立了适用于多种功能标记的核靶标的分析策略。通过弥补方法学上的空白，该方案能够系统性地探索核小体以上层级的染色质结构域组织，既补充了测序和电子显微镜技术，又保留了细胞核的天然结构。本文是已发表论文34的扩展版实验方案。

方案

注意：后续的实验方案部分将分为以下所述的染色过程和采集过程。有关数据分析教程，请参阅相关出版物34 ，其中详细介绍了多标记组蛋白修饰的数据分析方法。

1. 染色过程：

注意：在整个实验方案中提及了 35 mm 培养皿或 8 孔腔室载玻片。这些是我们课题组用于细胞培养的容器，但也可采用更小且更高效的方法。若使用替代材料，需确保缓冲液和抗体的推荐浓度保持不变。由于本实验方案具有顺序性，抗体的选择对成功标记至关重要。我们采用常规原则，确保针对各靶标的宿主抗体来源不同，从而使二抗能够特异性识别不同物种的宿主，有效减少脱靶效应。标记顺序根据靶标在细胞核内的位置确定。由于我们研究的是染色质压缩结构域25,28,34,35 ，并了解该过程依赖扩散作用，因此我们始终优先标记异染色质靶标，随后标记常染色质，最后标记 RNA 聚合酶 II（RNAPII），以尽量减少致密异染色质区域的立体位阻效应。缓冲液的优化是在方案开发过程中通过实验经验确定的。我们发现，在完成第一个靶标标记后加入山羊血清，有助于降低后续步骤中的非特异性结合。

  1. 缓冲液制备
    1. 缓冲液组分：
      注意：有关组分的更多信息，包括储存和制备时间，请参见材料表。建议用户在开始实验前准备好所有溶液，以避免实验误差。淬灭溶液应最后配制。
    2. 配制封闭缓冲液
    3. 称取牛血清白蛋白（BSA），使其在实验所需缓冲液体积中的终浓度为3%，并将BSA加入离心管中。将离心管倾斜至45˚角，使BSA晶体在管内铺开，然后加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）。此操作可防止形成无法溶解的晶体团块。
    4. 将离心管置于室温 ，直至所有晶体完全溶解。切勿振荡或涡旋离心管——这会导致气泡形成，使蛋白质吸附于液面，从而阻碍BSA完全溶解。
    5. 待BSA完全溶解后，加入Triton X-100，使其终浓度为0.2%（v/v），具体体积依据步骤1.3中所选体积确定。若晶体未完全溶解，可缓慢反复吹打数次以混匀溶液，避免产生气泡。
      注意：若配制改良型缓冲液，需在此过程中加入10%山羊血清。但改良型封闭缓冲液应现用现配，不宜长期储存，且确保其终浓度与材料表中所述一致——即3% BSA、0.2% Triton X-100。
    6. 配制洗涤缓冲液：
      重复步骤1.1.2中的操作，但使用材料表中列出的浓度，为方便起见，此处再次列出（0.2% BSA、0.1% Triton X-100溶于1X -DPBS；若为改良型缓冲液，则另含1%山羊血清）
    7. 配制固定液：
      1. 向离心管中加入PBS。
      2. 向离心管中加入适量16%多聚甲醛，使其终浓度为4%。
        注意：应现用现配，并在取出细胞前准备好。当前固定液通常不使用戊二醛，但可选择添加，因其固定效果更牢固且持续时间更长。dSTORM系统不具备检测戊二醛（GA）荧光寿命信号的能力，但具备该检测能力的用户可利用此特性区分戊二醛标记结构与荧光染料标记结构。
    8. 配制淬灭溶液：
      1. 在称量纸上称取硼氢化钠。
      2. 准备离心管。
      3. 将硼氢化钠加入离心管中。
      4. 向离心管中加入PBS。
        注意：加入PBS后溶液应产生气泡。
    9. 配制成像缓冲液：
      1. 将1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于无RNASE、DNASE的去离子水中，配制成13 mL、浓度为1 M的DABCO溶液。
      2. 逐滴加入12 M HCl（约240 µL），直至DABCO完全溶解且pH达到8.0。
      3. 通过将亚硫酸钠溶于10X PBS中配制1 M亚硫酸钠溶液。DTT无需额外配制。
      4. 最终配制时，使用上述储备液配制含65 mM DABCO、30 mM亚硫酸钠和30 mM DTT（1 M储备液）的去离子水溶液。
      5. 通过滴定HCl和NaOH调节pH至8.0。用Parafilm密封后于4˚C避光保存，保存时间不超过2个月。使用期间需定期监测pH。
  2. 第一轮标记染色过程细节：
    1. 固定：
      1. 从培养箱中取出活细胞，移除培养皿中的细胞培养基，并将其弃入生物危害废物容器中。
      2. 加入足量PBS覆盖细胞（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL）。
      3. 轻轻晃动培养皿，用PBS洗涤细胞，然后移除PBS，并将其弃入生物危害废物容器中。
      4. 加入足量固定液覆盖细胞（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），室温固定10分钟。
      5. 在细胞固定期间，称取用于淬灭溶液的硼氢化钠，并将其加入离心管中。
      6. 移除固定液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
    2. 淬灭
      1. 向培养皿中加入足量PBS覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上（任何标准摇床均可）轻摇5分钟，以洗涤细胞。
      2. 从摇床上取下培养皿，移除PBS，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      3. 向培养皿中加入足量淬灭溶液覆盖表面（8孔板加250 µL，35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上轻摇7分钟，以淬灭细胞中的自发荧光。
      4. 在细胞于摇床上孵育期间，将离心管中剩余的淬灭溶液弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      5. 从摇床上取下培养皿，移除淬灭溶液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      6. 向培养皿中加入足量PBS覆盖表面（8孔板加250 µL，35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上轻摇5分钟，以洗涤细胞。
      7. 从摇床上取下培养皿，移除PBS，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      8. 重复步骤1.2.2.6 和1.2.2.7 两次（共进行3次PBS洗涤）。
    3. 封闭
      1. 向培养皿中加入足量封闭缓冲液覆盖表面（8孔板加250 µL，35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL）。
      2. 将培养皿置于摇床上至少1小时，以通透细胞膜并封闭非特异性结合位点（占据非特异性位点，防止其干扰目标位点的结合）。（尽管我们已测试多种时间，确定最短有效封闭时间为20分钟，但仍强烈建议封闭至少1小时，或延长至过夜。具体时间可能需根据靶标和细胞系进行优化。）
      3. 在细胞于摇床上孵育期间，配制一抗染色溶液（参见供应商网站推荐浓度或材料表中的浓度参考）。
      4. 为确定所需染色溶液总体积，应在覆盖细胞所需体积基础上增加0.5 mL（例如，一个35 mm培养皿需配制1.5 mL溶液）。
      5. 从封闭缓冲液储备液中取出步骤1.2.3.1中确定的体积，加入新离心管中以配制染色溶液。
      6. 向封闭缓冲液中加入适量一抗储备液，以达到正确的终浓度。几种常用一抗的储备液体积可参见材料表。
      7. 从摇床上取下培养皿，移除封闭缓冲液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
    4. 一抗染色：
      1. 向培养皿中加入足量一抗染色溶液覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上至少1-2小时，或延长至过夜，以标记细胞靶标。
      2. 从摇床上取下培养皿，移除一抗染色溶液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      3. 向培养皿中加入足量洗涤缓冲液覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上轻摇5分钟，以洗涤细胞。
      4. 从摇床上取下培养皿，移除洗涤缓冲液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      5. 重复步骤1.2.4.3和1.2.4.4两次（共进行3次洗涤缓冲液洗涤）。
      6. 在最后一次洗涤期间，配制二抗染色溶液（参见供应商网站推荐浓度或参考以往实验）。
      7. 为确定所需染色溶液总体积，应在覆盖细胞所需体积基础上增加0.5 mL（例如，一个35 mm培养皿需配制1.5 mL溶液）。
      8. 从封闭缓冲液中取出步骤1.2.4.7中确定的体积，加入新离心管中以配制染色溶液。
      9. 向封闭缓冲液中加入适量二抗储备液，以达到正确的终浓度。几种常用二抗的储备液体积可参见材料表。
      10. 用铝箔包裹含二抗染色溶液的离心管，直至准备将其加入培养皿中的细胞。
    5. 二抗染色：
      1. 向培养皿中加入足量二抗染色溶液覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上至少40分钟，以将荧光染料标记至细胞靶标。
      2. 确保培养皿用铝箔包裹，以防止荧光染料漂白。
      3. 从摇床上取下培养皿，移除二抗染色溶液，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      4. 向培养皿中加入足量PBS覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL），将培养皿置于摇床上轻摇5分钟，以洗涤细胞。
      5. 从摇床上取下培养皿，移除PBS，并将其弃入适当标记的液体化学废物容器中。
      6. 重复步骤1.2.5.4和1.2.5.5一次（共进行2次PBS洗涤）。
      7. 此时细胞可直接成像，或储存后成像。若立即成像，请参见“采集”部分步骤。若需储存后成像，请继续执行以下步骤。
      8. 储存前，向培养皿中加入足量PBS覆盖表面（35 mm培养皿加1 mL，腔室玻片加500 µL）。
      9. 先用Parafilm密封培养皿，再用铝箔包裹，以防止液体蒸发和荧光染料漂白。
      10. 将包裹好的培养皿于4°C储存，直至准备成像。
        ​注意：本方案所用标记物在2-3天内储存不会显著影响图像质量；但不同抗体稳定性各异，适当储存条件下可在实验完成后保持一定时间的稳定性。不建议储存超过一周，因固定液浓度不足以维持长期稳定性。
  3. 后续标记染色过程：
    1. 封闭：
      1. 参照步骤1.2.3.1 - 1.2.3.2，但使用含山羊血清的封闭缓冲液。封闭孵育时间可短至1小时，但为减少非特异性结合，建议后续标记的封闭时间更长，最长可至过夜（18-24小时）。请参考以往实验条件。
      2. 同时，用含山羊血清的封闭缓冲液配制一抗溶液，而非使用普通封闭缓冲液。
    2. 一抗染色：
      1. 按照缓冲液配制部分所述，配制含山羊血清的改良型封闭缓冲液和洗涤缓冲液。
      2. 参照步骤1.2.3-1.2.4（封闭和一抗染色），使用改良型封闭缓冲液和洗涤缓冲液：
        注意：一抗孵育时间可短至1小时，最长可至过夜（8-24小时）。尽管较长孵育时间（尤其是多标记实验）通常可获得更佳标记效果，但本方案中的数据均采用过夜孵育步骤。
      3. 在孵育结束前短时间内，用改良型封闭缓冲液1.1.3配制二抗溶液。
    3. 二抗染色：
      1. 参照步骤1.2.5（二抗染色），但使用含山羊血清的封闭缓冲液。
        ​注意：孵育时间可短至1小时，但我们测试过更长时间（2-4小时）并获得相似效果。对于后续标记，请重复步骤1.3。

2. 采集过程

注意：进行数据采集时，请使用与所用显微镜兼容的尼康成像软件（NIS）Elements 软件。任何能够控制滤光片、光路和相机设置的软件均可适用于本实验方案。以下成像方案适用于全内反射荧光（TIRF）照明模式下的样品成像；然而，本标记方案可兼容多种成像方式。使用本标记方案也可进行非 TIRF 成像，适用于 STORM 及三维 STORM 应用。对于其他成像方法，请采用相应的标准操作流程。

  1. 后续标记染色过程：
    1. 打开所需的光学组件，并与相应的软件建立连接。在大多数情况下（例如使用 NIS 软件），除非计算机能够与显微镜、相机和载物台控制系统正常通信，否则软件无法完全初始化。
    2. 打开 NIS 软件（或同等软件）。
    3. 设置实时预览：开启实时预览 >切换 保持自动缩放 > 在相机设置中，将曝光时间设为 30 ms。
    4. 设置 acquisitions 的数据路径。
    5. 返回顶部面板 获取> 快速时间延时> 路径
    6. 为首次采集选择合适的文件名，并将帧数设置为 10,000。
      注意：这些步骤旨在限制样品在成像开始后暴露于光源的时间。
    7. 确保在采集前预先设定好TIRF的临界角和零角度。有关如何完成此操作，请参考在线教程资源。如前所述，若不使用TIRF照明，此步骤可跳过。
    8. 选择合适的光路至相机并切换 落射照明 在 NIS 或等效软件的“光源”选项中选择宽场照明模式，以确保镜组设置适用于非激光标准光源的宽场照明。
  2. 样品制备：
    1. 取出样品，并向样品中加入成像缓冲液（配方见第1.1节缓冲液制备）。（根据所使用的成像缓冲液不同，可能需要采取不同的预防措施。应避免样品暴露于光照下。）
    2. 添加镜油至物镜后，将样本置于载物台上并使用合适的夹持器固定，然后切换 完美聚焦 然后将焦点转移到样本上。
  3. 成像步骤：
    1. 找到激光光斑，并导航至培养皿/板上无细胞的区域。
    2. 切换 全内反射荧光显微镜 照明。
    3. 更换滤光片，以匹配适当的滤光片，使红光（或用于采集该特定样本数据的任何其他激光）通过。
      注意：使用材料表中所述的多波段滤光片。多波段滤光片并非必需，用户也可选择使用专为染色所用荧光染料设计的独立滤光立方体进行成像。
    4. 以最低激光功率（约 1 mW，具体取决于照明光源，此设置旨在防止意外漂白）开启激光，并将镜片角度调整至临界角。
    5. 如果附近没有细胞，增加激光功率直至在实时图像中清晰看到激光光斑。
    6. 使用 感兴趣区域（ROI）工具绘制、设定并保存激光光斑所在位置的感兴趣区域（ROI）。
      注意：对于多标记样品，请确保样品所需的所有光源激光光斑均已对齐。本方案中使用三种激光，并确保所有光斑均对齐。由于空间数据的共定位需要激光对齐，因此这一步骤至关重要。
    7. 返回到 落射式照明 以及明场滤光片。
    8. 使用 ROI 定义工具，导航寻找一个合适的健康细胞（例如，一个合适的 HCT116 细胞应具有贴壁生长、多边形或椭圆形的形态，并具有清晰的细胞边界）。
    9. 将 ROI 的中心对准细胞核并单击 OK 使用明场照明放大至 ROI 位置（由于无法直接从细胞核的宽场荧光图像判断细胞状态，因此需采用明场照明进行观察）。
    10. 使用与2.3.2节相同的方法恢复至TIRF照明。
    11. 选择适合最长波长标记靶标的滤光片（大多数情况下为远红光，即 Alexa Fluor 647 标记的靶标）。通常优先选择最长波长，以避免因次级抗体光谱重叠而使用较短波长照射导致样本发生光漂白。
    12. 在 低 针对每个所需激光器（在多标记情况下为3个激光器）设置激光功率，开启激光并照射细胞核，以确保样本正确对齐。
    13. 使用TIRF对照以确保样本经TIRF照明。
    14. 根据需求选择合适的采集Z位置，但可在采集前立即进行调整。
    15. 根据荧光染料的需求设置曝光时间（可使用10至‬-30 毫秒
    16. 点击 获取> 快速时间序列成像.
    17. 设置帧数至 ≥10,000 并点击 应用 在指定目录中创建文件。
    18. 将激光功率调至50%并进行样品光漂白。
    19. 细胞核应先发生漂白，但稍后（数秒后）应开始出现闪烁。
    20. 通过切换已保存的位置或手动控制镜片角度和Z位置，返回至所需的临界角度和Z位置，并采集快速时间序列图像。
    21. 确保载物台无漂移，否则多通道图像的共定位将无法正确完成。使用基准标记（荧光微珠）或在采集开始时保存Z轴位置，以便后续通过设备的多点采集位置保存法进行漂移校正。
    22. 更换滤光片（若使用具有所需荧光团通带的多陷波滤光片则无需更换），并重复步骤 2.3.17–2.3.20（对于后续标记，务必始终从低激光功率开始，调整参数后进行采集）。
  4. 数据处理：
    1. 使用 Bio-Formats 插件将原始图像栈载入 FIJI。通过选择生成最小强度投影 图像> 图像序列> Z 投影 并选择 最小强度 作为投影类型。使用原始图像堆栈减去该最小投影 流程 > 图像计算器在所得图像上执行背景扣除（流程 > 减去背景) 使用滚动球半径为 5 像素.
    2. 定义单个细胞的感兴趣区域（ROI），可通过手动方式或使用 Nuclei Outline 插件完成插件 > GDSC > 细胞 > 细胞核轮廓).
    3. 使用 ThunderSTORM 插件对在定义的 ROI 内预处理后的图像堆栈进行定位分析插件 > ThunderSTORM > 运行分析）。使用适当的参数以实现稳定的定位（例如，图像滤波器：B样条，阶数 = 3，尺度 = 2；峰值强度阈值 = 1.5× std（Wave.F1）；亚像素定位方法：高斯拟合，sigma = 2；拟合半径 = 4；拟合方法：最大似然法）。所得坐标可用于重构超分辨率图像。
    4. 对于多通道实验，合并通道以生成复合的染色质重建 dSTORM 图像（图像 > 颜色 > 合并通道).

结果

代表性三色染色质dSTORM图像

所提出的顺序染色方案已验证适用于多种细胞系，包括BJ成纤维细胞、HCT116、AC16、HeLa、MCF10A等。图1 展示了BJ成纤维细胞、HeLa和MCF10A细胞的代表性图像。

使用模拟数据集验证分析流程

三色免疫荧光实验方案的开发需要建立一种专门的计算方法，以应对多靶标核单分子定位显微镜（SMLM）数据的复杂性（图2A，2B）。鉴于在致密的染色质环境中多个靶标彼此邻近共存，我们构建了一种点云分析框架，该框架直接处理定位坐标，而非重构图像。该方法利用了针对点云数据已有的丰富聚类分析工具40,41,42。我们通过受控的模拟数据集，系统评估了该分析流程区分生物学上有意义的空间模式的能力。生成了四种分布类型以代表不同的染色质组织情景：正态分布代表高度聚集的修饰，均匀分布代表分散模式，环形分布模拟排斥区域，随机分布作为组织对照（图2C）。这些模拟模式被锚定在由实验获得的H3K9me3数据中真实的异染色质簇位置上，从而保留了真实的细胞核空间约束条件。该分析框架采用DBSCAN聚类算法（epsilon = 50 nm，最小点数 = 3），这是SMLM数据聚类分析的多种方法之一40,41,42。为确保聚类参数的合理性，我们此前已描述了一种专为检测染色质压缩结构域而优化的方法34。请注意，当将此步骤作为分析的初始环节时，用户需根据其靶标结构、环境和功能优化参数选择。此处的聚类边界通过凸包计算确定，避免了对结构域几何形状的先验假设。我们的验证结果显示，所有模拟分布模式均能通过其独特的距离直方图谱型被清晰区分（图2D）。当以异染色质中心为参考分析定位点时，每种空间组织类型均呈现出特征性的信号模式。联合占位分析通过双标记模拟并控制其空间关系进行测试（图2E）。空间分离的标记（正态-环形构型）如预期般产生极低的联合密度，表现为平坦的分布曲线（图2E）。重叠的标记模式（正态-随机构型）则显示联合密度随距参考点距离增加而递减，与理论预测一致。这些验证结果表明，我们的分析框架具备在复杂的多靶标数据集中检测和量化空间耦合关系的能力。有关这些模拟数据集生成方法的更多细节，请参阅完整发表的研究文献34。

染色质结构分析的代表性结果

在生物样本中应用我们已验证的分析方法，可揭示通过本方案实现的特征性空间组织模式。利用经过H3K9me3、H3K27ac和RNA聚合酶II三色染色处理的HeLa细胞，我们展示了该方法所具备的分析能力。由于已有超分辨率研究明确证实，在约200 nm尺度上H3K9me3异染色质具有同心环状染色质结构23,28,35，因此其是理想的参考系统。分析首先通过基于DBSCAN的方法识别异染色质区域，随后根据有效半径对其进行分类：小区域（25–40 nm）、中等区域（40–80 nm）和大区域（80–253 nm）。这种按尺寸分层的方式考虑了DNA压缩区域尺寸已知的异质性，其中平均区域半径约为80 nm25。距离测量采用1.5倍簇半径的搜索窗口（图2B 顶部），以捕获邻近的常染色质及聚合酶信号（图3A、B）。

代表性结果表明，H3K27ac 和 RNA 聚合酶 II 在所有异染色质边界附近均有持续定位，这与先前的研究28,44以及关于转录位置相对于染色质结构域的模型23,35,45,46相一致。定量距离分析显示，这些标记物的平均位置非常接近结构域边缘：大结构域中，H3K27ac 位于边界内 -1.0 nm 处，RNA 聚合酶 II 位于边界外 8.4 nm 处；而在较小结构域中，两者也表现出类似的边缘富集特征，仅有轻微的位置差异。这些测量结果表明，活跃的染色质元件主要集中于抑制性与许可性结构域之间的界面区域，而非被完全排除在外。联合密度分析展示了该实验方案揭示共标记靶标之间空间耦合关系的能力（图 3C-F）。相对于异染色质结构域的分析显示，联合密度峰值出现在结构域边界稍外侧（r/r₀> 1），表明 H3K27ac 与 RNA 聚合酶 II 在边缘区域具有优先共定位特征（图 3G-I）。这些结果展示了该染色与分析流程如何有助于在高度密集的环境中探究复杂的空间关系。

染色质免疫荧光，H3K9me3，H3K27ac，RNAPII 标记物，显微镜比较。
图 1：所用细胞的三色图像。 （A）BJ 成纤维细胞、（B）HeLa 细胞和（C）MCF10A 细胞的三色图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

DBSCAN 聚类图、距离分析、联合密度图、坐标数据和邻近性研究。
图 2：靶标相对于异染色质簇空间分布的定量分析框架。（A）本研究中用于多通道 SMLM 数据的分析流程。（B）针对识别出的异染色质簇计算其边缘距离的示意图，以及联合亲和计数方法。这两种方法均用于定量确定两个靶标相对于异染色质簇结构的排列方式。（C）在一项研究34中用于确定靶向结构不同生物学组织模式（聚集于结构域内部、围绕结构域分布或无关联且随机分布）的特定异染色质簇周围的散点分布示例。（D）中心聚集型、随机分布型和环状分布型的边缘距离直方图，以及（E）模拟情况下的联合亲和曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

RNAPII H3K27ac 分析；基因表达、染色质研究中的直方图、显微镜图像和数据图表。
图 3：转录标记物在组蛋白结构域周围的空间定量关系。（A）多标记 HeLa 细胞代表性生物数据中 RNAPII 与（B）H3K27ac 相对于 H3K9me3 簇的小（<40 nm）、中（40–80 nm）和大（>120 nm）结构域的边缘距离直方图结果。（C–E）HeLa 细胞三标 dSTORM 图像示例（H3K9me3、H3K27ac、RNAPII2-S2p），其中包含单个结构域的插图和放大图像。（F）对（E）中所示结构域进行凸包（红色）拟合并标出分析区域（灰色）。（G）在数据集中所有中等大小结构域的分析 ROI 中，RNAPII 相对于 H3K27ac 的亲和力图谱，以及（H）H3K27ac 相对于 RNAPII 的亲和力图谱。（I）所有中等大小结构域在分析 ROI 中 RNAPII 与 H3K27ac 的联合密度图。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

这种三色单分子定位显微技术（SMLM）方案代表了我们在致密细胞核环境中研究染色质组织能力的重要进步。通过结合顺序免疫荧光标记方法与基于定位点估计值作为分析基础的点云空间分析，该技术为研究人员提供了一种强大工具，可用于检测不同染色质修饰与活性转录机制之间在纳米尺度上的相互关系，而这些关系此前使用传统显微镜技术无法被探测到。

该方案的顺序染色策略解决了多靶点细胞核成像中存在的基本挑战。与相对稀疏的细胞质或膜相关结构不同，细胞核染色质靶标密度极高，且空间区域相互重叠。我们改进的封闭方法，在每轮标记后加入针对二抗宿主物种的血清，能有效防止抗体对之间的交叉反应，同时保持靶标特异性。在4°C条件下过夜孵育，可确保抗体充分渗透至整个细胞核体积，这对于实现定量单分子定位显微镜（SMLM）分析所需的均匀标记密度至关重要。该方案可在多种细胞系中稳定获得分辨率为15–20 nm的图像，广泛适用于染色质结构研究。

以下是成像过程中的故障排除建议。如果细胞核未发生漂白，最可能的原因是样品处的激光强度不足，这可能是由于激光功率设置过低或TIRF角度不正确所致；此时应通过检查激光准直、提高激光功率以及仔细调整TIRF角度来进行排查。如果细胞核中出现的闪烁点非常少但持续保持明亮，表明细胞核漂白不充分。如果闪烁点极为稀疏且完全无法观察到细胞核，则最可能的原因是染色失败，应在重复实验前检查试剂和抗体。相反，如果细胞核内闪烁点数量非常多（这是理想结果），则需要延长漂白时间，直至能够清晰分辨出彼此分离良好的单分子闪烁信号。在传统的SMLM实验中，通常可借助微管等结构明确的参考体系来估计标记密度；然而，染色质具有高度异质性的组织结构，并缺乏明确定义的真实结构，使得此类评估更具挑战性。基于经验优化和先前的研究经验，我们确保有效标记密度达到约每平方微米100个定位点（100 localizations per µm²），以实现对染色质压缩结构域的可靠重建。在本实验方案中，我们未使用任何基准标记物，但若使用者具备相关条件，我们建议使用。在我们的实验中，横向位移保持在0.2像素以内（小于约5 nm），可忽略不计，因此未使用基准标记物。

选择H3K9me3、H3K27ac和RNA聚合酶II可提供关于染色质在纳米尺度上组织结构的互补信息。H3K9me3可作为理想的空間参考标志，因其形成离散且界限清晰的簇状结构，代表组成型异染色质，并可通过自动聚类算法可靠识别。H3K27ac标记与增强子相关的染色质，积极参与基因调控；而RNA聚合酶II则直接指示活跃转录位点。这三种靶标共同揭示了转录机制和调控性染色质修饰在细胞核结构中相对于异染色质区域的组织方式。

点云分析框架通过实现对致密核环境中的全面空间分析，解决了以往染色质结构研究中的关键局限性。传统的成对比较方法无法捕捉当多种染色质修饰在同一核区域内共存时所产生的复杂空间关系。我们的方法利用联合密度分析，揭示H3K27ac与RNA聚合酶II相对于H3K9me3簇的共定位区域，从而提供从独立的双色实验中无法获得的定量信息。

代表性结果一致表明，染色质呈现出一种紧密关联的组织模式，而非严格的区室化分隔。H3K27ac 和 RNA 聚合酶 II 均优先定位于不同大小异染色质簇的边缘区域，定量测量显示其位置在簇边界 10 nm 范围内，该结果与采用类似方法和转录模型的其他研究团队的发现相一致23,28,35,45,46。联合密度分析表明，活跃的转录机器与增强子相关染色质在异染色质簇周围区域的耦合频率最高。这些发现挑战了简单的相分离模型，支持一种整合性的组织原则，即不同的染色质修饰在空间上保持紧密邻近，而非形成彼此分离的独立区室。

该方案的模块化设计通过替换靶标，同时保持相同的分析框架，可用来研究多种染色质生物学问题。在复制时序研究中，可将靶标替换为增殖细胞核抗原（PCNA）和微型染色体维持蛋白（MCM）等细胞周期相关蛋白；而在DNA损伤应答研究中，则可靶向γH2AX及修复因子。细胞周期相关研究可检测分裂过程中动态变化的组蛋白修饰，而分化研究则可聚焦于与谱系决定相关的表观遗传标记。这种顺序标记方法适用于任何存在可靠抗体的核蛋白或染色质修饰组合，主要限制因素为光谱兼容性和交叉反应性。这种灵活性使研究人员能够在维持定量空间分析能力的同时，探究各种细胞过程中染色质动态变化的基本问题。

披露

本方案的作者没有披露信息或利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金U54CA268084、U54CA261694和R01CA228272，美国国家科学基金会（NSF）基金EFMA-1830961和CBET-2430743，以及Rob和Kristin Goldman、David Sachs先生和Christina Carinato慈善基金会的慈善资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Andor iXon Ultra 888 电子倍增CCD AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
牛血清白蛋白Sigma AldrichA7030用于封闭和洗涤缓冲液。基于 BSA 的封闭缓冲液在 4 ℃ 下储存不得超过 1 个月°C
长春新产业光电技术有限公司，型号 MGL-FN-532（532 nm） PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Coherent OBIS 激光器箱（405 nm，488 nm，532 nm，552 nm，637 nm） 相干1228877 激光准直使用3–10 kW/cm²³ 样品处的平均功率，每个波长通道至少采集 10,000 帧 10–30 毫秒 成像时间 
DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷）SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
去离子水NANA任何蒸馏水均可 
DTT（二硫苏糖醇），1 MSigma43816NA
八孔腔室盖玻片CellvisC8-1.5H-N可使用任何玻璃底板，但需根据容器调整体积。
山羊抗小鼠 AF568Thermo FisherA11004储存浓度：2 mg/mL
标记后稳定性：2–3 天
山羊抗兔 AF647Thermo FisherA21245储存浓度：2 mg/mL
标记后稳定性：4–5 天
山羊抗大鼠 A488Thermo FisherA11006储存浓度：2 mg/mL
标记后稳定性：2–3 天
H3K27ac 一抗Thermo FisherMA5-23516储存浓度：1.0 mg/mL 
H3K9me3 一抗 AbcamAB1769156储存浓度：1.287 mg/mL 
高清晰度聚丙烯锥形管 15 mL  康宁 352096用于固定剂和淬灭溶液 
高清晰度聚丙烯锥形管 50 mL康宁352070用于配制 40 mL 工作浓度的封闭缓冲液和洗涤缓冲液
盐酸（HCl），12 MSigma258148NA
尼康 Eclipse Ti-E 显微镜，配备完美对焦系统 尼康TI-DH 611392 倒置显微镜 
尼康 SR APO TIRF，100倍放大，1.49 数值孔径 Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series NA
正常山羊血清AbcamAB7481-1002在完成第一轮标记后使用。应存在于封闭缓冲液和洗涤缓冲液中
16% 多聚甲醛 电子显微镜科学公司15710固定液中使用，配制后应在2周内用完。4℃避光保存。°C
磷酸盐缓冲液 (PBS) 10XAmbionAM9625NA
1000 µL 移液器吸头SureOne02-707-404任何移液器吸头均可使用，只要其’适用于该体积
RNAPII-PS2AbcamAB252855储存浓度：0.98 mg/mL
硼氢化钠Thermo FisherS678-10每次使用新鲜的淬灭缓冲液。 
氢氧化钠(NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
亚硫酸钠SigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher 28314NA

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