一种多标签单分子定位显微镜协议，用于在高密度核环境中研究染色质

Summary

我们提出了一种三色染色质单分子定位显微镜（SMLM）染色与分析方案，能够对常染色质、异染色质和RNAP II进行空间分析的可重复定位。该协议能够在密集核环境中高效进行多色标记，包括染色质相关靶点，实现可靠的同时检测。

Abstract

超分辨率显微镜极大提升了我们探究生物结构超越绕射极限的能力，使其成为研究密集核结构（如染色质、核层）和核仁等核体不可或缺的技术。染色质具有多尺度组织能力——从纳米级核小体到微米级结构域——因此需要具备高分辨率和分子特异性的成像方法。单分子定位显微镜（SMLM），特别是随机光学重建显微镜（STORM），能够精确定位表观遗传标记，为染色质结构和功能提供了关键洞察。然而，核环境中的多标签成像存在独特挑战，包括抗体可及性降低、非特异性结合增加以及荧光团不稳定性。为解决这些问题，我们提出了一种针对高密度核环境优化的序列免疫标记协议，实现了强健的三色SMLM，几乎没有串扰，信号降解更少。该方法包括优化缓冲液制剂、荧光团选择和抗体验证策略，以确保多个靶点的可重复、高保真度标记。重要的是，我们将该协议与计算分析流水线集成，利用单个分子靶点的定位作为空间锚点（种子点），量化靶点间距离、局部密度和多标签共亲和力。这使得对纳米尺度的染色质成分进行详细的空间分析成为可能。该协议作为一个可重复的多组分成像和密集亚细胞环境中定量分析的框架，为研究复杂核结构如染色质的研究者提供了有力工具。

Introduction

单分子定位显微镜（SMLM）的出现，使得对纳米尺度1^{、2、3、4、5}的生物结构进行了前所未有的探索。除了单靶成像，对多色SMLM的扩展进一步推动了该领域的发展，使得能够同时可视化多种分子物种，以及亚衍射结构之间的空间和时间关系（6,7,8,9,10,11）.然而，由于核DNA的致密聚合物特性以及抗体在该环境中的可及性有限，将多重SMLM应用于大量分布的组蛋白修饰仍然具有挑战性（12,13,14,15,16,17,18）。

染色质呈现出层级化、多尺度的组织结构，长度跨越数个数量级，从纳米级核小体组装体到微米级核结构。在最大尺度上，染色体占据不同的染色体区域，基因组进一步划分为A/B区室和拓扑相关结构域（TADs），这些结构域通过环状挤出等机制约束长程调控相互作用，如环状挤出19,20,21,22.在200纳米以下尺度，染色质组织为无序聚合物，由非离散的常染色质和异染色质区块组成，转录活性区域优先定位于PD边界^{23、24、25、26、27、28、29}.在最小尺度（5-20 nm）中，染色质由不规则的核小体组装和核小体离合组成，凸显了缺乏统一的高阶折叠基序，并强调了基因组组织的出现性、依赖于尺度的特性 24,26,30。随着基于测序的方法如染色质免疫沉淀测序和高通量染色质构^象捕获的快速^{发展，染色}质中尺度组织结构的多种特征已被识别出来^31,32.然而，这些技术与成像不同，无法捕捉只有在解析这些结构后才能观察到的空间几何。电子显微镜方法如染色质电子显微镜（ChromEM²⁴）和染色质扫描透射电子显微镜（ChromSTEM²⁵）揭示了染色质具有异质性，并组织成50-200纳米长度尺度的填充畴（25,28,29）。虽然这些技术能够以令人印象深刻的分辨率识别染色质填充结构域，但无法提供SMLM所提供的分子特异性定位。DNA点的积累用于纳米级地形成像（DNA-PAINT²²）和多重荧光原位杂交（FISH）¹⁹使高复用成为可能;然而，DNA-PAINT在富含寡核苷酸的^{核环境中随机}结合事件产生的背景噪声升高影响较^大，而传统的基于热变性的FISH方法则需要破坏原生染色质折叠。此前的研究已应用超分辨率成像技术研究该长度尺度的染色质，并识别出混合的填充域组成，与之前的相分离模型^{12、23、34、35}形成对比。该方案源自一篇之前发表的论文，讨论了这些发现的生物学^意义。因此，鉴于其高分辨率和复用能力，基于免疫染色的dSTORM仍然是近乎原生条件下多色染色质成像的最可行策略。

该方案并非首次证明能标记超过两个核靶点，此前的研究已标记单个蛋白复合物或基因^12,36。尽管核小体翻译后组蛋白修饰成功标记，多色染色质SMLM的标记、成像和分析仍面临重大挑战。首先，在致密染色质环境中进行免疫染色需要优化抗体浓度、培养序列和缓冲液组成，以确保在不过度背景的情况下充分穿透和结合。其次，需要对多重标签进行全面分析，因为常染色质、异染色质与RNA聚合酶等酶之间的相互作用可能超出简单的二元排除。迄今为止，染色质dSTORM成像中显示的最大颜色数量仍为两种，^{分别为18、37、38、39}。

这里我们提出了一套三色染色质SMLM成像和分析的稳健方案。我们的染色工作流程优化了抗体培养时间，并采用改进的成像缓冲液⁴⁰，实现多标签的长时间成像。我们还进一步介绍了用于两色距离分析和三色关节密度分析的计算流程，从而实现异色蛋白、常染色质与转录机制之间关系的定量表征。与早期提出异染色质与常染色质分离的双色染色质SMLM研究不同，三色染色质成像显示基因组被组织为填充结构域，常染色质和主动转录位于构成异染色质核心的边缘³⁴。

该方案为社区提供了一个可重复的多色染色质SMLM实验框架，并建立了适用于多个功能共轭核靶点的分析策略。通过弥合方法学上的空白，它使得系统性地探索超核体层面的染色质结构，补充测序和电子显微镜方法，同时保留了原生的核结构。本文是一篇已发表论文³⁴的扩展方案。

Protocol

注意：后续的协议部分将分为染色过程和采集过程，具体如下所述。有关数据分析教程，请参阅相关出版物³⁴，该出版物详细介绍了多标签组蛋白修饰的分析。

1. 染色工艺：

注意：在整个方案中，提到了35毫米盘子或8个腔室良好的平板。这些是我们团队用于细胞培养的容器，但也有更小更高效的方法。如果使用替代材料，确保缓冲抗体的推荐浓度保持不变。由于该方案具有顺序性，抗体选择对于成功标记非常重要。我们采用标准推理，确保宿主抗体对靶点的不同，使二级抗体能够靶向不同宿主物种，有效减少离靶效应。标记顺序根据靶核位置确定。由于我们针对染色质填积域^{25、28、34、35}，并且理解这是一个扩散驱动的过程，我们总是先标记异色质靶，其次是常染色质，最后是RNAPII，以最大限度减少在密集异色质区域中的立体排异。缓冲区的优化是在协议开发过程中通过经验进行的。我们发现，在第一个靶点后加入山羊血清有助于减少后续步骤中的靶外效应。

1. 缓冲剂制备
   1. 缓冲组件：
      注意：有关组件的更多信息，包括储存和准备时间，请参阅 材料表。我们建议用户在开始方案前准备好所有解决方案，以避免实验错误。淬火溶液应最后加制。
   2. 制作阻塞缓冲
   3. 称重牛血清白蛋白（BSA），使实验所需缓冲液的最终浓度为3%，然后加入离心管。将管子倾斜至45°角，使BSA晶体在管内扩散，然后加入磷酸盐缓冲盐水（PBS）。这样做是为了防止形成无法溶解的晶体团块。
   4. 将管子置于室温，直到所有晶体溶解。不要摇晃管子或漩涡——这会导致气泡形成，吸引蛋白质到表面，阻止BSA完全溶解。
   5. 完全溶解后，添加特里同X-100，使其最终浓度为0.2%（v/v），且根据步骤1.3中选择的体积。如果晶体未完全溶解，需上下移液数次，缓慢混合且不形成气泡。
      注意：制作改良缓冲液时，在此过程中加入10%山羊血清。但改良阻滞缓冲液应在使用时保持新鲜，避免长时间储存，但最终浓度应与 材料表中规定一致——3% BSA，0.2% Triton X-100。
   6. 制作洗衣缓冲剂：
      在1.1.2中重复阻断缓冲的步骤，但为了方便使用材料部分和这里列出的浓度（0.2% BSA，0.1% Triton X-100 在1X -DPBS，修改版中加入1%山羊血清）
   7. 制作定形液：
      1. 在离心管上加入PBS。
      2. 向离心管中加入适量的16%对甲醛，最终浓度为4%。
         注意：从培养箱取出细胞时，请保持新鲜且准备好。虽然目前的固定液通常不使用戊二醛，但可以加入，且由于固定更坚固且固定时间更长，可能有用。dSTORM的装置不具备从戊二醛（GA）进行荧光寿命信号的能力，但具备能力的用户可能会发现这有助于分离荧光团标记结构。
   8. 制作淬火溶液：
      1. 在称重纸上称硼氢化钠。
      2. 准备离心管。
      3. 向管子中加入硼氢化钠。
      4. 把PBS加到管子里。
         注意：添加PBS后溶液应有气泡。
   9. 制作成像缓冲：
      1. 将1,4-二氮基环辛烷（DABCO）溶解在去离子RNASE和无DNASE水中，制成13 mL浓度的DABCO溶液。
      2. 加入12 M HCl（~240微升），直到DABCO完全溶解，pH值达到8.0。
      3. 通过溶解在10X PBS中制备10米亚硫酸钠。地面地面电视不需要任何准备。
      4. 最终制备时，利用先前的原料在去离子水中制备65 mM DABCO与30 mM亚硫酸钠和30 mM DTT（1 M库存）。
      5. 通过滴定用盐酸和氧化钠调整pH，直到pH达到8.0。保存时盖好并用防腐胶封口，温度不超过2°C。使用过程中监控pH值。
2. 第一批标签染色工艺细节：
   1. 专注：
      1. 从培养箱取出活细胞，并将培养基从培养皿中取出。将细胞培养基丢弃在生物危害废物容器中。
      2. 添加足够的PBS覆盖细胞（35毫米皿1毫升，腔室玻璃载玻片500微升）。
      3. 轻轻旋转盘子，用PBS洗净细胞，然后将PBS从盘中取出。将PBS丢弃在生物危害废物容器中。
      4. 加入足够的固定液覆盖细胞（35毫米皿1毫升，腔室玻璃玻片500微升），然后让细胞固定10分钟。
      5. 在固定电池时，称重硼氢化钠作为淬火溶液，并将其加入离心管。
      6. 将固定液从碗中取出，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
   2. 淬火
      1. 在洗涤器中加入足够的PBS以覆盖表面（35毫米皿1毫升，腔室玻璃玻片500微升），然后将洗碗放在摇杯上（任何普通摇杯都可以）洗5分钟。
      2. 将碗从摇瓶上取下，取出PBS，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      3. 在皿内加入足够的淬火溶液（250微升，8孔皿）以覆盖表面（35毫米皿1毫升，腔室玻璃玻片500微升），然后将皿放在摇床上7分钟以淬灭细胞自发荧光。
      4. 当细胞在摇床上时，将剩余的淬火溶液丢弃在离心管中，放入贴有相应标签的液体化学废物容器中。
      5. 将盘子从摇床上取下，取出淬火液，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      6. 在洗碗中加入足够的PBS（250微升，8孔盘）以覆盖表面（35毫米皿1毫升，腔室玻璃载玻片500微升），然后将盘放在摇床上洗净细胞5分钟。
      7. 将碗从摇瓶上取下，取出PBS，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      8. 重复步骤1.2.2.6和1.2.2.7两次（共3次PBS洗涤）。
   3. 阻挡
      1. 在碟内添加足够的阻断缓冲液以覆盖表面（8孔盘250微升，35毫米皿1毫升，腔室玻璃玻片500微升）。
      2. 将天线放在摇床上至少1小时，以渗透细胞膜并阻断结合位点（占据未指定位点，避免干扰目标位点）。（虽然我们多次测试以确定最短成功阻断时间为20分钟，但强烈建议至少阻断1小时或更久，最多可达过夜。根据目标株和细胞系，可能需要优化。）
      3. 细胞在摇床上时，准备初级抗体染色溶液（详见供应商网站推荐浓度或材料部分表格）。
      4. 为了确定要制备的染色溶液总体积，将0.5毫升加入覆盖细胞所需的体积（例如，对于一个35毫米的碟，准备1.5毫升溶液）。
      5. 将第1.2.3.1节确定的体积从阻断缓冲液中取出，并加入新的离心管以准备染色溶液。
      6. 向阻断缓冲液中加入适量的原级抗体，以获得正确的最终浓度。多种常用抗体的初级抗体库存量可在材料部分查阅。
      7. 将盘子从摇杯上取下，取出阻挡缓冲液，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
   4. 原发抗体染色：
      1. 在洗碗盘中加入足够的初级抗体染色液以覆盖表面（35毫米皿1毫升，腔室玻璃载玻片500微升），然后将皿放在摇床上，至少浸泡1-2小时，最多隔夜以标记细胞靶标。
      2. 将碗从摇罐上取下，去除主要抗体染色液，并丢弃在标有相应标签的液体化学废物容器中。
      3. 在洗涤皿中加入足够的洗涤缓冲液覆盖表面（35毫米皿为1毫升，腔室玻璃玻片为500微升），然后将皿放在摇床上清洗细胞5分钟。
      4. 将洗碗器从摇杯上取下，取下洗涤缓冲液，并丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      5. 重复步骤1.2.4.3和1.2.4.4（共3次洗涤缓冲液）。
      6. 在最后一次清洗时，细胞在摇床上时，准备二次抗染色溶液（详见厂商网站推荐浓度或参考之前的实验）。
      7. 为了确定要制备的染色溶液总体积，将0.5毫升加入覆盖细胞所需的体积（例如，对于一个35毫米的碟，准备1.5毫升溶液）。
      8. 将第1.2.4.7节确定的体积从阻断缓冲液中取出，并将该体积加入新的离心管中，准备染色溶液。
      9. 向阻断缓冲液中加入适当量的二级抗体，以获得正确的最终浓度。多种常用抗体的二级抗体库存量可在 材料表中找到。
      10. 用铝箔将二级抗体染色液包裹离心管，直到准备加入盘内细胞。
   5. 次级抗体染色：
      1. 在皿内加入足够的二级抗体染色溶液以覆盖表面（35毫米皿为1毫升，腔室玻璃载玻片为500微升），然后将皿放在摇床上至少40分钟，将荧光团添加到标记的细胞靶点上。
      2. 确保天线用铝箔覆盖，以防止荧光团漂白。
      3. 将盘子从摇罐上取下，取出次级抗体染色液，并丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      4. 向洗碗盘中加入足够的PBS以覆盖表面（35毫米皿1毫升，腔室玻璃玻片500微升），然后将皿放在摇床上5分钟清洗细胞。
      5. 将碗从摇瓶上取下，取出PBS，丢弃在标有相应标签的液体化学废弃物容器中。
      6. 再重复1.2.5.4和1.2.5.5节一次（共2次PBS洗涤）。
      7. 这些细胞现在可以进行成像或储存以备后续成像。如果立即进行影像检查，请按照采集部分的步骤操作。如果需要保存以备影像检查，请继续按照以下步骤操作。
      8. 在储存前，向皿内添加足够的PBS覆盖表面（35毫米皿为1毫升，腔室玻璃玻片为500微升）。
      9. 先用防腐剂包裹盘子，再用铝箔包覆，以防止液体蒸发和荧光团漂白。
      10. 将包裹好的盘子保存在4°C，直到准备成像。
          注意：对于本方案中使用的标签，碟片可以保存2-3天，否则图像质量会受到显著影响;然而，不同抗体的稳定性可能有所不同，但只要妥善储存，在方案完成后仍能稳定一段时间。不建议将标注的餐具保存超过一周，因为定画液浓度不足以长期稳定。
3. 后续标签染色过程：
   1. 走位：
      1. 参考1.2.3.1 - 1.2.3.2，但使用带山羊血清的阻断缓冲。阻断的潜伏时间可短至1小时，但我们建议后续标记的潜伏时间延长，最高限期为过夜（18-24小时），以减少离靶结合。请参考之前的实验。
      2. 同时，用山羊血清在阻断缓冲液中制备初级抗体溶液，代替阻断缓冲液。
   2. 原发抗体染色：
      1. 按照缓冲液准备部分详细说明，准备改良阻断缓冲液和山羊血清洗涤缓冲液。
      2. 请参阅步骤1.2.3-1.2.4（阻断与原抗染色），使用改良的阻断和洗涤缓冲器：
         注意：原版抗体的潜伏时间可短至1小时，最长可达夜间（8-24小时）。尽管更好的标记表现是通过更长的孵化时间实现的，尤其是多标签。该方案中的数据通过过夜潜伏步骤准备。
      3. 在孵育时间结束前不久，将二级抗体溶液置于改良阻断缓冲液1.1.3中。
   3. 次级抗体染色：
      1. 请参考第1.2.5节（次级抗体染色），但使用含有山羊血清的阻断缓冲液。
         注意：潜伏时间可能短至1小时，但我们测试过更长时间（2-4小时），表现相似。接下来的标签请重复1.3节。

2. 采购流程

注意：数据采集时，请使用与所用显微镜兼容的尼康成像软件（NIS）元素软件。任何能控制滤镜、光路和相机设置的软件都可以用来处理这个协议。以下成像协议适用于样品的全内反射荧光（TIRF）照明;然而，该标签协议兼容多种成像形式。通过该标记协议，非TIRF成像可用于STORM，并且是3D STORM应用所必需的。请使用标准的替代影像方法。

1. 后续标签染色过程：
   1. 开启所需的光学元件，并与合适的软件建立连接。在大多数情况下，如NIS中，除非计算机能够与显微镜、摄像机和舞台控制正确通信，否则软件不会完全初始化。
   2. 开放NIS软件（或同等软件）。
   3. 设置实时画面：在相机设置下，开启实时画面>切换保持 自动缩放 ，>将曝光时间设置为30毫秒。
   4. 为采集设置数据路径。
   5. 导航至顶部面板 获取>快速延时>路径
   6. 首次采集时选择合适的文件名，并将帧数设置为10,000。
      注意：这些步骤旨在限制成像开始后样品暴露于光源的时间。
   7. 确保在采集前预先设定了TIRF的临界角和零角。请参阅在线教程资源，了解如何实现这一点。如前所述，如果不使用TIRF照明，这一步可以跳过。
   8. 为相机选择合适的光路，并在NIS或等效软件中的灯泡下切换 Epi Illumination 选项，以确保镜子设置为来自非激光标准光源的广域照明。
2. 样品准备：
   1. 取样并加入成像缓冲液（配方见第1.1节缓冲液制备）。（根据所用成像缓冲液的不同，可能需要采取不同的预防措施。保护样品免受光照。）
   2. 在物镜中加入油后，将样品放在舞台上并用合适的支架，切换 “完美对焦 ”，然后对焦。
3. 影像检查步骤：
   1. 找到激光点，然后导航到盘子上没有细胞的位置。
   2. 切换 TIRF 照明。
   3. 更换滤光片以匹配相应滤光器，以通过红光（或用于采集该样品数据的激光）光。
      注意：使用材料表中描述的多凹槽过滤器。无需多刻痕滤镜，用户也可以选择为染色所用荧光团设计的非区分滤镜立方体成像。
   4. 在最低激光功率 ~ 1 mW 下开启激光器（这取决于照明源，但这样做是为了防止意外漂白），并将镜面角度设为临界角度。
   5. 如果附近没有细胞，则增加激光功率，直到实时画面中激光斑点清晰可见。
   6. 使用 兴趣区域（ROI）工具，绘制、设置并保存激光点所在位置的ROI。
      注意：对于多标签样品，请确保样品所需的所有光源激光点都对齐。在这个方案中，我们使用三束激光，并确保所有点位都对齐。这至关重要，因为空间数据的共配需要激光对准。
   7. 返回 上镜照明 和明亮场滤镜。
   8. 使用ROI定义工具，导航寻找合适的健康细胞（例如，合适的HCT116细胞应具有粘附型、多边形或椭圆形且细胞边界清晰）。
   9. 将ROI置于细胞核中心，点击 确定 以放大至ROI位置（使用明场照明，因为细胞健康状况无法直接通过核的广视场荧光图像确定）。
   10. 返回使用2.3.2中使用的相同方法进行TIRF照明。
   11. 选择合适的滤光片以识别最长波长的标记靶（大多数情况下为极红，即Alexa Fluor 647标记靶）。通常，先选最长波长，以避免短波长的样品因光漂白而出现，以防标记靶具有与光谱重叠的次级样品。
   12. 在 低 激光功率下，每个需要的激光（多标签情况下是3束激光）开启激光并照射核，确保样品正确对齐。
   13. 使用TIRF控制以确保样品被TIRF照射。
   14. 根据需求选择合适的Z位置进行获取。不过，这可以在收购前进行调整。
   15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
   16. 点击获取>快速延时。
   17. 将帧设置为≥10,000，点击 应用 以创建指定目录中的文件。
   18. 将激光功率调到50%，并进行光漂白样品。
   19. 细胞核最初应该会漂白，但不久后（几秒钟后）应该开始闪烁。
   20. 通过切换保存位置或手动控制镜面角度和Z位置，恢复到期望的临界角和Z轴位置，并获得快速延时摄影。
   21. 确保舞台没有漂移，否则多通道图像的共映将无法正确完成。使用受托标记（荧光微珠）或在采集开始时保存Z位置，以便后续通过位置保存法进行漂移校正，以实现设备内的多点采集。
   22. 更换滤光片（或如果使用带通带的多缺口滤光片以获取所需的荧光团，则保持不变），并重复第2.3.17-2.3.20节（后续标记时，确保始终从低激光功率开始，调整参数并获取）。
4. 数据处理：
   1. 使用Bio-Formats插件将原始图像栈加载到FIJI中。通过选择 图像>堆栈>Z项目 ，并选择 最小强度 作为投影类型，生成最小强度投影。使用 图像计算器Process > Scrap Stack 减去该最小投影值。对生成图像进行背景减法（Process > Distract Background），滚动球半径为 5像素。
   2. 手动或使用Nuclei Outline插件（>GDSC > Cells > Nuclei Outline）为单个单元定义感兴趣区域（ROI）。
   3. 在定义的投资回报率范围内，使用 ThunderSTORM 插件（ThunderSTORM > 运行分析插件）对预处理图像栈进行本地化分析>。使用适当的参数进行稳健定位（例如，图像滤镜：B样条，阶数=3，尺度=2;峰值强度阈值=1.5×标准（波形F1）;亚像素定位方法：高斯分布，σ=2;拟合半径=4;拟合方法：最大似然）。由此产生的坐标可用于重建超分辨率图像。
   4. 对于多通道实验，合并通道生成复合染色质重建的dSTORM图像（图像>颜色>合并通道）。

Results

代表性的三色dSTORM染色质图像

所提的顺序染色方案已在多种细胞系中经过验证，包括BJ成纤维细胞、HCT116、AC16、HeLa、MCF10A等。 图1 展示了BJ成纤维细胞、HeLa和MCF10A细胞的代表性图像。

利用模拟数据集验证分析流程

三色免疫荧光协议的开发需要开发一种专门的计算方法，能够处理多靶核SMLM数据的复杂性（见图2A，2B）。鉴于多个靶点共存的密集染色质环境，我们实现了一个点云分析框架，直接处理定位坐标而非重建图像。该方法利用了针对点云数据^40、41、42可用的广泛聚类分析工具。我们系统评估了分析流程利用受控模拟数据集区分生物学意义空间模式的能力。生成了四种分布类型以表示不同的染色质组织场景：针对紧密聚类修饰的正态分布、分散模式的均匀分布、用于排除区建模的环向分布，以及作为组织控制的随机分布（见图2C）。这些模拟图样锚定于基于实验H3K9me3数据的真实异染色质簇位置，保持了真实的核空间约束。该分析框架采用DBSCAN聚类（ε=50纳米，最小点=3），这是SMLM数据^40、41、42中众多聚类分析方法之一。为确保聚类参数的准确性，我们此前描述了一种针对染色质填充域检测的优化方法³⁴。请注意，作为分析的初始步骤，用户需要通过目标的结构、环境和功能优化选择所需的参数。这里通过凸包计算确定簇边界，消除了对域几何的假设。我们的验证通过独特的距离直方图谱（图2D）证明了所有模拟分布模式的明显区分。当分析相对于异染色质质心的定位时，每种空间组织类型都产生了特征。联合占用分析采用了带有受控空间关系的双标记模拟（见图2E）。空间分离标记（正态-环面构型）如预期地产生最小的节理密度，导致分布剖面平坦（图2E）。重叠的标记图案（正态-随机构型）随着距离参考点的增加，导致连接密度递减，符合理论预测。这些验证结果展示了我们框架在复杂多目标数据集中检测和量化空间耦合关系的能力。有关这些模拟数据集如何生成的更多信息，请参阅完整出版物³⁴。

染色质组织分析的代表性结果

我们验证的分析方法在生物样本中的应用揭示了通过该方案可实现的典型空间组织模式。利用我们对H3K9me3、H3K27ac和RNA聚合酶II进行三色染色处理的HeLa细胞，我们展示了该方法所带来的分析能力。鉴于先前超分辨率研究中确立的200纳米尺度染色质同心组织证据，H3K9me3异染色质作为理想的参考系统23,28,35。分析从基于DBSCAN的异染色质结构域开始，随后按有效半径分类：小域（25-40 nm）、中域域（40-80 nm）和大域域（80-253 nm）。这种尺寸分层解释了DNA包装结构域尺寸的异质性，平均结构域半径约为⁸⁰纳米。距离测量采用1.5倍的簇半径搜索窗口（图2B顶部）捕捉近端常染色质和聚合酶信号（图3A，B）。

代表性结果显示，H3K27ac和RNA聚合酶II在所有结构域类别中一致定位于异染色质边界附近，符合先前研究^28,44，以及转录位置相对于染色质结构域^{的模型23,35,45,46}。定量距离分析显示平均位置非常接近结构域边缘：大域中H3K27ac距离边界8.4纳米处显示H3K27ac，RNA聚合酶II距离边界8.4纳米，而较小域则表现出相似的边缘关联，位置差异较小。这些测量表明活性染色质元素集中在抑制区与允许区的界面，而非完全排除。联合密度分析展示了该协议揭示共标记靶点间空间耦合的能力（见图3C-F）。相对于异染色质结构域的分析显示，连接密度峰值出现在结构域边界外（r/r₀> 1），表明H3K27ac-RNA聚合酶II在外围区域具有优先共定位（见图3G-I）。这些结果展示了染色和分析流程如何帮助研究密集环境中复杂的空间关系。

图1：所用单元的三张彩色图像。 三色图像为（A）BJ成纤维细胞（B）HeLa和（C）MCF10A。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：针对异染色质簇的靶点空间组织定量分析框架。 （A） 本研究中使用的多通道SMLM数据分析流程。（B）识别异染色质簇与联合亲和力计数方法的外围距离计算示意图。这两种方法都用于定量确定两个靶点相对于异染色质簇结构的排列。（C） 研究中使用的特定异染色质簇周围散布分布示例³⁴，用于确定目标结构的不同生物组织（群聚于同一结构域内、环绕结构域、未关联且随机分布）。（D）中心聚类、随机分布和环向分布的外围直方图距离;（E）模拟情况下的联合亲和力曲线。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：组蛋白结构域周围转录标记的定量空间关系。 （A） 多标记HeLa细胞典型生物学数据的外围直方图距离。RNAPII和（B）H3K27ac相对于H3K9me3团簇，分别在小域（<40 nm）、中域（40-80 nm）和大域（>120 nm）中。（C-E）示例：HeLa细胞（H3K9me3、H3k27ac、RNAPII2-S2p，含嵌入和放大图像）的三张标签dSTORM图像，针对单一域。（F）凸包（红色）区域的拟合，定义区为灰色。（G）数据集中中等规模数据中，RNAPII相对于H3K27ac和H3K27ac（H）相对于RNAPII的亲和图，ROI。（一）RNAPII和H3K27ac在分析中所有中等大小区域的联合密度投资回报率。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

这一三色SMLM协议代表了我们在密集核环境中染色质组织研究能力上的重大进展。序列免疫荧光标记方法结合点云空间分析，后者以定位估计为分析基础，为研究人员提供了研究不同染色质修饰与活性转录机制之间纳米尺度关系的强大工具，这些关系此前传统显微技术无法检测。

该方案的顺序染色策略解决了多靶核成像固有的根本挑战。与相对稀疏的细胞质或膜相关结构不同，核着染色质靶点存在极高密度且空间域重叠。我们改进的阻断方法，在每次标记轮后加入二级抗体宿主物种的血清，有效防止抗体对之间的交叉反应，同时保持靶点特异性。4°C的过夜培养确保抗体完全穿透整个核体积，这对于实现定量SMLM分析所需的均匀标记密度至关重要。该方案能够可靠地生成15-20纳米分辨率的多细胞系图像，广泛适用于染色质组织研究。

以下是影像检查的排查建议。如果原子核未漂白，最可能的原因是样品激光强度不足，这可能是由于功率设置较低或TIRF角度错误所致;在这种情况下，可以通过检查激光对准、增加激光功率并仔细调整TIRF角度来排查故障。如果核内的闪烁次数很少但始终保持明亮，说明核子漂白不足。如果眨眼非常稀少且细胞核完全看不见，最可能的原因是染色失败，重复实验前应检查试剂和抗体。相反，如果核眨眼次数非常多（这是理想结果），则需要更长的漂白时间，直到单个且分隔良好的单分子眨眼能够被视觉识别出来。在传统的SMLM实验中，通常可以通过明确定义的参考结构（如微管）来估算适当的标记密度;然而，染色质表现出高度异质的组织结构，缺乏明确的真实结构，这使得这种估计更具挑战性。基于实证优化和以往经验，我们确保有效标记密度达到每 μm² 约 100 个定位，从而实现染色质填充结构域的稳健重建。在我们的协议中，我们没有使用任何受托人标记，但建议用户有没有。在我们的实验中，横向偏移仍保持在0.2像素（小于~5纳米）以内，可以忽略。因此，我们没有使用受托人标记。

选择H3K9me3、H3K27ac和RNA聚合酶II为纳米级染色质组织提供了互补的信息。H3K9me3是理想的空间参考，因为它形成了代表构成性异染色质的离散、明确的簇，并且可以通过自动化聚类算法可靠地识别。H3K27ac标记了积极参与基因调控的增强子相关染色质，而RNA聚合酶II则直接指示活跃转录位点。这三个靶点共同研究转录机制和调控染色质修饰相对于核结构中异染色质区域的组织方式。

点云分析框架解决了以往染色质组织研究的关键局限，实现了在密集核环境中进行全面的空间分析。传统的两两比较方法无法捕捉当多个染色质修饰共存于同一核区时所产生的复杂空间关系。我们的方法利用关节密度分析揭示H3K27ac和RNA聚合酶II相对于H3K9me3簇的共定位位置，提供了单独双色实验无法获得的定量信息。

代表性结果始终显示出一个连贯的组织模型，而非严格的染色质区隔。H3K27ac和RNA聚合酶II在不同结构域大小的异染色质簇边缘优先定位，定量测量显示其位置距离簇边界10纳米以内，支持其他采用类似方法和转录模型的组别研究结果 23,28,35,45,46.关节密度分析显示，活性转录机制与增强子相关染色质最常在异色质簇周围区域偶对。这些发现挑战了简单的相分离模型，支持了不同的染色质修饰保持近距离空间而非形成独立区室的综合组织原则。

该方案的模块化设计使得通过靶点替代研究多样化的染色质生物学问题成为可能，同时保持相同的分析框架。复制时序研究可以替代细胞周期蛋白，如增殖细胞核抗原（PCNA）和微小染色体维持（MCM），而DNA损伤反应研究则可能针对γH2AX和修复因子。细胞周期研究可以研究分裂过程中发生变化的组蛋白修饰，分化研究则可能聚焦于与谱系承诺相关的表观遗传标记。顺序标记方法适用于任何存在可靠抗体的核蛋白或染色质修饰组合，主要受谱兼容性和交叉反应性考虑的限制。这种灵活性使研究人员能够在保持定量空间分析能力的同时，解决各种细胞过程中染色质动态的根本性问题。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andor iXon Ultra 888电子倍增CCD	安多尔	DU-888U3-CSO-#BV	匿名
牛血清白蛋白	西格玛·奥尔德里奇	A7030	用于挡块和清洗缓冲器。不要在4°下存储基于BSA的阻断缓冲超过1个月;C
长春新工业光电子技术有限公司，型号MGL-FN-532（532纳米）及nbsp;	PSU-H-LED	https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htm	匿名
相干OBIS激光盒（405 nm， 488 nm， 532 nm， 552 nm， 637 nm）及nbsp;	连贯	1228877	激光与3&ndash同步;10 kW/cm³采样处平均功率，每个波长通道至少收集10,000帧，且不超过bbsp;10–30 MS 获取时间。
DABCO（1,4-地亚氮基环-（2.2.2）-辛烷）	西格玛	D27802	匿名
DBPS（1次）	赛莫飞舍尔	14190-136	匿名
蒸馏水	匿名	匿名	任何蒸馏水都可以;
数字地面电视（二硫代特灵醇），1M	西格玛	43816	匿名
八个井膛盖玻璃	塞尔维斯	C8-1.5H-N	任何玻璃底板都可以，但体积必须根据容器的不同进行调整。
山羊防老鼠 AF568	赛莫飞舍尔	A11004	原料浓度：2 mg/mL 标签后稳定性：2–3天
山羊反兔子 AF647	赛莫飞舍尔	A21245	原料浓度：2 mg/mL 标签后稳定性：4–5天
山羊抗老鼠 A488	赛莫飞舍尔	A11006	原料浓度：2 mg/mL 标签后稳定性：2–3天
H3K27ac一级抗体	赛莫飞舍尔	MA5-23516	库存浓度：1.0 mg/mL
H3K9me3原版抗体	阿布卡姆	AB1769156	库存浓度：1.287 mg/mL
高透明度聚丙烯锥形管 15 mL	康宁	352096	用于定水和淬火溶液
高透明度聚丙烯锥形管 50 mL	科宁	352070	用于40毫升工作中的阻挡和洗涤缓冲液
盐酸（HCl），12M	西格玛	258148	匿名
尼康Eclipse Ti-E，配备完美对焦系统	尼康	TI-DH 611392	倒立显微镜及nbsp;
尼康 SR APO TIRF，100倍放大，1.49 分辨率;	尼康	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series	匿名
普通山羊血清	阿布卡姆	AB7481-1002	在第一个标签完成后使用。应该存在于定型和洗涤缓冲区中
对甲醛 16%	电子显微镜科学	15710	用在固定液中，制作后两周内应用完。保持光线保护，4度;C
磷酸盐缓冲盐水（PBS）10X	安比恩	AM9625	匿名
移液器头 1000 uL	SureOne	02-707-404	任何移液器头都可以，只要它对应体积
RNAPII-PS2	阿布卡姆	AB252855	原汁浓度：0.98 mg/mL
硼氢化钠	赛莫飞舍尔	S678-10	每次淬火缓冲液都用新鲜的。
氢氧化钠（NaOH）	Thermo Fisher等;	A16037.36	匿名
亚硫酸钠	西格玛	S0505	匿名
特里顿 X-100 10%	Thermo Fisher等;	28314	匿名