一种新型密封方案，用于在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片装置的膜上制备防水的硅胶密封。适用于建立芯片模型和小规模芯片平台开发的实验室。我们以塑料和天然组织膜为例演示了该方案。此操作仅需PDMS、甲苯、模具、膜和真空腔室。
本文内容
摘要
摘要
器官芯片（Organ-on-Chip）平台是生物医学研究中迅速发展的领域。该领域的扩展催生了多种不同的材料和构建与应用方法。尽管各类设备（无论是商业提供还是学术界开发）的数量持续增长，但对于新进入器官芯片领域的研究人员而言，通常仍需跨越较大的技术门槛。在新型和现有芯片技术中，一个核心问题仍然是如何实现芯片装置的牢固且无泄漏的密封。本文提出了一种新的芯片开发路径，展示了一种可实现硅胶芯片与三种不同材料培养膜之间可靠防水连接的芯片密封工作流程。该方法对材料投入要求较低，便于新研究者开展芯片开发，并可构建气液界面（ALI）器官芯片。此类芯片适用于通过多孔膜进行培养基供给、且细胞顶端暴露于空气中的细胞培养体系，例如肠道芯片、皮肤芯片，或如本文所述的气道芯片（Airway-on-Chip）。我们提供了两种不同的芯片模具3D设计，展示了其与市售塑料膜以及猪源细胞外基质（ECM）支架的结合方式。该气道芯片可在实验室内部制备，本文列出了可能遇到的各种技术难点，并展示了其此前作为气道芯片的应用实例。这种新型密封工艺包括使用真空抽吸去除经甲苯稀释的聚二甲基硅氧烷（PDMS）灰浆中的甲苯，从而在多孔塑料或天然ECM膜表面形成一层薄而坚固的硅胶涂层。该工艺的第二个创新点在于PDMS灰浆在室温下固化，避免了因不同材料热膨胀系数差异而导致膜结构在密封过程中受损。该方法具有广泛的适用性，可用于连接上述测试材料，制备内置培养膜的多腔室PDMS芯片。
引言
器官芯片设备正成为生物医学研究的核心工具，全球各地的实验室正在开发多种商业和开源模型1。随着这些模型逐渐成为研究的关键组成部分，持续替代传统的静态塑料模型和动物模型2,3，确保这些模型对全球不同背景的研究人员具有良好的可及性和可获取性变得愈发重要。其中关键在于实现定制化、小批量开发的可及性，且不受输入成本和制造成本的限制4，尤其是在非商业或学术用途的模型中1。
在芯片技术领域，最大的挑战之一是在流体流动过程中实现无泄漏的安全密封。最近一篇关于芯片装置泄漏测试的综述指出，无论是工业界还是学术界，腔室之间或向环境中的泄漏均是导致模型和实验失败的主要模式5,6。造成密封失败的原因多种多样：设备尺寸微小、所施加的流体流动与压力，以及最主要的一点——这些设备由不同材料分层组合而成，并通过不同的工艺进行连接6。芯片平台中用作培养膜的材料种类繁多，与其应用范围同样广泛，包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚碳酸酯（PC）、PDMS以及细胞外基质（ECM）膜1。因此，将这些不同材料整合为最终设备的方法也各不相同。具体方法包括使用 胶水/PDMS加压粘合、等离子介导的硅烷化学法、结构的化学功能化、静电纺丝以及溶剂蒸气键合等，具体选择取决于模型中涉及的材料类型7。由于这些工艺需要不同的技术能力和实验室环境，因此在一定程度上限制了学术界对芯片研究的可及性。已有研究指出，尽管商业系统本身的成本和限制阻碍了学术界的使用，但芯片构建过程的耗时性、多步骤特性以及所需设备也制约了其在学术环境中的独立发展1,8,9。在该研究领域的前沿，当前面临的一个关键问题是对模型进行标准化和验证，以确保其可重复性10,11。然而，对于许多希望开展芯片开发以回答特定科学问题、替代动物实验并建立更具生物学相关性的模型的实验室而言，要实现这一目标仍存在显著差距12。
本文介绍了一种芯片封接工作流程，该流程仅需大多数研究环境中常见的技能和设备即可完成。该方法可实现三种不同膜材料与PDMS芯片之间的防水密封界面。整个过程所需的主动操作时间较短，可在非专用芯片实验室环境中进行，并且能够从小批量扩展至中等规模的芯片生产。
所述密封程序可使用多孔塑料膜或细胞外基质（ECM）膜进行；所提供的示例芯片即采用此方法制备，用于构建可暴露于空气的类气道芯片装置。该方法也可用于其他类似的装置，前提是所用膜材料具有孔隙，而孔隙是该程序的关键要素。所提供的芯片主要用于气液界面（ALI）培养和气道上皮细胞研究，但也可用于其他应用，例如与间充质细胞或肠道细胞共培养的模型8,13。第一种芯片为标准的类气道芯片，具有较大的培养面积（92 mm2），包含两个培养腔室：一个顶端腔室用于空气暴露，通过多孔膜与底部腔室分隔，底部腔室用于容纳培养基，也可选择性地培养另一种浸没式细胞类型（如成纤维细胞、内皮细胞）。在ALI应用中，关键要求是接种于顶端的细胞能够形成紧密屏障，防止培养基渗漏至顶部通道。第二种芯片的设计与第一种相同，但在膜的两侧增加了两个额外腔室，此处使用猪源性ECM膜，通过施加负压实现培养膜的拉伸，从而模拟天然气道的机械拉伸环境。
我们的封接工艺结合了PDMS芯片开发领域的多种要素，并引入了两个创新条件。首先，在将甲苯稀释的PDMS灰浆迅速施加真空，可防止甲苯对膜材料的化学侵蚀，促进硅酮渗入膜的孔隙或表面结构，并形成一层薄而抗位移的表面。甲苯在高浓度下作为溶剂使用，用于稀释液态PDMS；它虽可导致固态PDMS表面溶胀和变形，但在此工艺中正因其溶解性而被采用。对于本实验中使用的PC和PET等塑料膜，若甲苯未能迅速去除，将引起形变和应力开裂。在手动涂布灰浆时必须格外小心，仅将灰浆涂于预制芯片半片的壁面区域，绝不可进入培养区，否则会堵塞培养膜的孔隙，并形成局部PDMS沉积，干扰细胞培养功能并导致实验结果的不一致。其次，在室温（RT）下对PDMS灰浆进行长达72小时的固化，可防止因材料在热膨胀后收缩程度不同而导致膜片或灰浆发生位移。
我们提供了两种芯片模具设计，可通过3D打印机或微铣床加工制备（如文中所述）。 补充文件1，补充文件2），以及使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）和甲苯制备薄砂浆的方法14. 采用该方法可实现将商用塑料膜（PET、PC）在装置内进行密封。此外，我们通过使用猪源性天然细胞外基质（ECM）膜制备相同的芯片，测试了该工艺的适用范围，从而制造出具有周期性拉伸能力的生物芯片。由于器官芯片旨在模拟器官的生理特性 体内 环境，具有产生呼吸过程中体内所经历机械力能力的气道芯片，例如气流产生的剪切应力以及气道收缩时的机械环境 高度具有生物学相关性16所使用的膜包含基底膜、固有层以及胶原蛋白、层粘连蛋白和其他周围的基质蛋白。据我们所知，这是首个基于天然基底膜的芯片，也是首个可实现拉伸的芯片，因而能够在非硅基ECM膜上模拟如呼吸等过程产生的机械应力15这一新应用突显了我们采用塑料与细胞外基质（ECM）进行密封工艺的功能。最后，我们展示了该芯片及膜密封工艺在“气道芯片”（Airway-on-Chip）中的应用，可用于气液界面（ALI）细胞培养。8.
方案
根据《动物实验法》（Wet op de dierproeven），本研究因所用材料均来自死后获取，且未为科研目的宰杀任何动物，故免于伦理委员会审批。原代人呼吸道上皮细胞的分离方案遵循格罗宁根大学医学中心的研究规范（https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg 于2025年1月14日访问）以及关于人体组织材料使用的国家和伦理专业指南（https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf 于2025年1月14日访问）。由于气管支气管组织为器官移植后剩余材料，且已完全匿名化处理，符合荷兰民法典及《器官捐赠法》（Wet op de orgaandonatie）规定，本研究亦免于伦理委员会审批要求。
1. 芯片半片与膜的制备
- 芯片生产
- 从本文的补充文件1和补充文件2下载芯片顶部和底部两半的.STL设计文件。顶部模具生成深度为5 mm的芯片半片，底部模具生成深度为3 mm的芯片半片；两个芯片半片均具有深度为1 mm的培养腔。或者，也可使用适当的CAD软件自行设计芯片结构。
- 准备用于3D打印或微铣削芯片模具的切片文件或铣削路径。微铣削制成的模具可直接使用；而树脂打印的模具在用作PDMS模具前，需经过两次24小时、99.9%乙醇洗涤，并进行紫外交联处理，以适当准备。
- PDMS芯片半片制备（图1）
- 按10:1的比例将液态PDMS基体与固化剂充分混合，并在真空腔中脱气，直至所有气泡完全去除。
- 使用宽口径注射器将混合物注入模具，在真空腔中再次脱气约10分钟，直至气泡完全消除。将模具置于干燥烘箱中，在65 °C下固化2小时。
- 用手术刀将固化的芯片半片从模具中取出，并修剪边缘毛边。在顶部半片的每个腔室两端以及指示底部腔室入口位置的两个相邻环处，使用活检打孔器添加四个入口。
注：在本研究展示的结果中，使用了2 mm活检打孔器，并插入2 mm硅胶管以实现培养过程中的培养基和空气流通。1 mm和2 mm的入口便于使用移液器接种细胞，分别对应200 µm和1000 µm规格的移液枪头。可根据不同的管路或泵系统选用其他尺寸的打孔器。
- 膜片制备（图2）
- 从本文的补充文件3下载膜片模板的.STL设计文件。通过3D打印或其他等效制造方法制备模板，以确保膜片形状的一致性。
- 将模板覆盖在PET或PC膜片上，固定牢固后用手术刀将膜片切割成所需形状。
注：在此阶段，可将膜片置于培养皿中进行基质蛋白包被处理，用于细胞培养，且不会影响膜片的结合性能。此步骤可确保仅膜片表面被功能化以促进细胞生长，而PDMS侧壁保持无细胞附着状态，如先前所述8。
2. 膜结合
- PDMS 砂浆的制备
- 将液态 PDMS（步骤 1.2.1）与甲苯按 7:5 的比例混合，并使用宽口径移液枪反复抽吸以充分混匀，方法如前所述14。每张芯片仅需 8 滴；建议每批砂浆使用 1.4 mL PDMS 与 1 mL 甲苯，此量足以制备 8 张同尺寸芯片。砂浆混合的均一性对膜的可靠结合至关重要。
警告：甲苯具有挥发性且高度易燃。暴露可能对神经系统和呼吸系统造成损害。必须仅在通风橱中使用，远离任何点火源，并使用吸附材料和通风处理泄漏。操作时应佩戴防护眼镜以防飞溅，并穿戴不渗透性（腈类）手套。所有实验材料（移液枪头、容器等）应在通风橱中放置 24 小时，待甲苯完全挥发后，方可通过专业废弃物处理服务，投入经批准并明确标识的容器中处置。切勿将甲苯排入下水道。有关更多信息，请查阅安全数据表（SDS）。
注意：应在使用前即时配制砂浆，以防止甲苯过早挥发及塑料污染，容器应为非玻璃材质，最好为一次性使用，使用后应立即丢弃。PDMS 会使玻璃表面固化并部分无法清除；甲苯会溶解并损坏实验室中常用的大多数塑料。
- 将液态 PDMS（步骤 1.2.1）与甲苯按 7:5 的比例混合，并使用宽口径移液枪反复抽吸以充分混匀，方法如前所述14。每张芯片仅需 8 滴；建议每批砂浆使用 1.4 mL PDMS 与 1 mL 甲苯，此量足以制备 8 张同尺寸芯片。砂浆混合的均一性对膜的可靠结合至关重要。
- PET/PC 膜的固定（图 2）
- 使用移液枪头迅速将砂浆涂布于 PDMS 芯片半片上预定放置膜的位置表面。
注意：膜下方的整个区域必须被砂浆润湿。应以移液枪头施加稳固压力，以形成尽可能薄的砂浆层。显微观察显示砂浆层厚度介于 3 至 5 µm 之间。 - 用洁净的镊子夹住已准备好的膜（步骤 1.3）一端，将膜尖端置于芯片正确位置的湿砂浆上，然后让膜自然贴合到位。
注意：此后不得再移动膜；若湿 PDMS 进入腔室，将在膜上形成不规则且无法使用的壁结构。若发生位移，硅胶将覆盖培养区域，从而破坏膜两侧的细胞培养能力，此时应丢弃该膜并重复上一步骤。 - 用镊子轻轻固定膜的位置，并在膜上方重新涂布 PDMS 砂浆，每次涂抹时应轻柔地从腔室方向向外移动，以排除气泡并确保膜在不改变其原始位置的前提下牢固固定。
注意：切勿将 PDMS 涂入膜的内部培养区域；这一点至关重要，因为硅胶会阻止细胞黏附并破坏培养膜的自然表面。 - 在砂浆湿润状态下完成膜固定后，立即将带膜的芯片半片放入真空室，在室温下、25 mBar 真空条件下固化 72 小时。
注意：带膜的芯片半片必须在室温下固化。PET/PC 与 PDMS 的热膨胀系数不同，若采用加热固化，硅胶在冷却过程中会先膨胀后收缩，导致膜发生变形（图 3）。
- 使用移液枪头迅速将砂浆涂布于 PDMS 芯片半片上预定放置膜的位置表面。
- 完整芯片的组装
- 现已可将带膜的芯片半片与另一芯片半片连接。为获得最一致的结果，建议将两个半片均进行 O2 等离子体处理（320 mBar，30 秒），然后用手施加轻微压力迅速压合。
警告：氧气等离子体炉会产生富氧环境、危险氧化物（如臭氧）以及强紫外线辐射。设备应安装在通风良好区域或通风橱内。炉窗应能阻隔全部紫外线，但仍建议佩戴护目镜。易燃材料和金属应远离氧气等离子体区域，以防加速燃烧或释放有毒烟雾。若使用本方案未提及的任何材料，必须参考氧气等离子体安全数据表（SDS）文件。
注意：若无等离子体炉，也可使用等离子体探头，或在第二芯片半片上涂布 PDMS 砂浆，然后在室温下施加轻微压力压合，共同固化 72 小时13。尽管这些方法的效果不如完整的 O2 等离子体炉处理，但在缺乏设备时仍可作为替代方案使用。
- 现已可将带膜的芯片半片与另一芯片半片连接。为获得最一致的结果，建议将两个半片均进行 O2 等离子体处理（320 mBar，30 秒），然后用手施加轻微压力迅速压合。
结果
膜密封完整性测试
为了检测密封芯片的完整性，将含蓝色染料的去离子水加入上层培养室，下层则加入纯去离子水。芯片静置过夜，以评估蓝色染料是否从上层室经膜周围泄漏至下层室。
采用本方法制备的完整硅胶芯片可在纵向弯曲至35°时仍保持膜结构的完整性，此时膜已被柔性PDMS砂浆从两侧包裹并牢固结合于芯片上半部分。PDMS芯片的形变是其正常使用过程中的常见现象，例如当芯片的两半部分粘附于培养皿时即会发生此类形变。
通过连接双向注射泵系统来测试芯片在流体诱导压力下的性能。采用PET和PC膜的芯片在压力达到并包括30 kPa（泵所能提供的最大压力）时，均无腔室间泄漏或芯片破裂现象。在先前的研究中，芯片通常在150 µL/h的流速下运行，该流速对每个装置的腔室施加0.7 Pa的压力8。
膜结合的可视化
为了在显微镜下观察液态PDMS砂浆因室温真空封接而侵入膜的0.4 µm孔道的过程，使用尼罗红对PDMS砂浆进行染色。选择尼罗红是因为它是一种疏水性染料，能够很好地与液态PDMS混合。染色剂通过将1%的尼罗红充分混合于液态PDMS中制备，以便在光学显微镜下呈现红色。室温固化程序按上文所述重复进行。将带有染色砂浆的膜包埋于石蜡中，并用切片机进行切片。膜切片置于载玻片上，通过光学显微镜成像（图4）。为验证将PDMS用甲苯稀释成砂浆以及施加真空以使PDMS侵入膜孔道这两个步骤的必要性，可在补充图3中查看采用与未采用这些方法的膜之间的对比结果。
细胞活力检测
在之前的一项研究中，检测了使用甲苯构建装置时可能产生的化学毒性。芯片分别在聚二甲基硅氧烷（PDMS）研钵中添加或不添加甲苯制备，人肺腺癌上皮Calu-3细胞培养2天至完全融合，并如前所述在芯片中继续培养1天8。通过台盼蓝染色法评估细胞死亡：将所有细胞从装置中取出，计数染成蓝色的死亡细胞与未染色的活细胞。细胞增殖通过在芯片培养基中孵育试剂后进行AlamarBlue检测来评估，使用酶标仪读取荧光吸光度，该数值反映细胞增殖情况（图5）8。
细胞外基质基底膜的连接
为了展示该方法在实现多种膜材料牢固且柔韧结合方面的普遍适用性，本实验采用完全基于细胞外基质（ECM）的膜材料重复了该方案（图6）。含基底膜的ECM支架按照先前所述方法从猪尿膀胱制备17。简言之，取自4至8月龄雌性动物的猪尿膀胱组织由荷兰格罗宁根当地屠宰场（Kroon Vlees b.v.）获取，并在采集后3小时内进行处理。去除膀胱上的结缔组织和脂肪后，将膀胱翻转至内面朝外，在室温下以PBS保存组织的同时，用钝性解剖法去除上皮层。ECM支架在进行膜连接前需进行脱水处理17。将制备好的支架裁剪后，按照上述方案连接至PDMS芯片的两半部分。此外，设计了一款新型模具，在装置内部增加了用于拉伸膜的额外腔室，以证明抽真空形成的硅胶键合同样能够耐受水平方向的机械应变（补充文件2）。
细胞外基质膜完整性测试
膜密封完整性测试按上述方法进行。随后，将拉伸芯片连接至注射泵，通过在装置的侧腔施加负压，使细胞外基质膜在过夜期间产生1 mm的水平拉伸（图7）。
在带有PET膜的标准气道芯片中进行上皮细胞与成纤维细胞共培养的分化
为了验证所提供的芯片作为气道芯片在气液界面（ALI）细胞培养中的性能，在先前的研究中8，将人肺腺癌上皮Calu-3细胞（ATCC，Manassas，VA，USA）在该装置中培养至融合状态并暴露于空气中。在顶侧空气暴露10天后，可见Calu-3上皮细胞分化为黏液分泌细胞，通过阿利新蓝染色检测到的黏液产生可证明该分化现象（图8）8。
为了验证我们实现长期无泄漏流动和共培养的实验流程，可参考之前发表的一项研究；完整的细胞培养方法详见该文章8。人呼吸道上皮细胞在芯片的顶侧培养室中，在持续气流条件下培养21天，同时将原代呼吸道成纤维细胞倒置培养在膜的另一侧。简而言之，原代呼吸道上皮细胞通过蛋白酶处理（0.2 mg/mL，HBSS中，37 °C孵育2小时）、细胞刮取，并从3名健康肺供体的剩余气管支气管组织中分离获得细胞并进行冻存，这些供体无其他可用信息。人呼吸道成纤维细胞（AFs）则以相同方式从一名供体的移植后慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺组织支气管部分分离获得。
在图9中，可以观察到芯片的示意图，以及上述细胞通过和沿装置腔室分布的情况。
在ECM膜上进行上皮细胞与成纤维细胞的共培养
含有基底膜的支架可支持上皮细胞和间充质细胞的培养。将永生化的人角质形成细胞（HaCaT细胞）以60 × 103 个细胞/cm2 的密度接种于膜的上皮侧（内侧），24小时后细胞活力为95%，而塑料细胞培养瓶中的细胞活力为91%（图10A）。随后，将正常人肺成纤维细胞（MRC-5细胞）以相同密度（60 × 103 个细胞/cm2）接种于膜的间质侧（外侧），并与HaCaT细胞共培养14天，以评估在天然ECM膜上长期共培养时上皮-间充质细胞的存活能力（图10D）。上皮细胞在膜的内侧形成融合的单层结构，而成纤维细胞在外侧表面分布较稀疏，但仍保持其典型的纺锤状形态（图10C）。三维重建视频见补充文件417。
本研究介绍了一种改进的膜密封方法，可形成牢固的聚二甲基硅氧烷（PDMS）-膜连接，能够抵抗芯片手动操作过程中可能造成的破坏，并支持在高达0.7 Pa的压力下进行长期灌注培养。我们证明，硅胶通过培养膜的孔隙渗透至膜内，从而在芯片两半部分与抽真空的PDMS灰浆之间形成共价硅烷键，实现膜的结合。此外，只要正确使用灰浆，该方法不会引发细胞毒性。所制备的芯片支持长期的上皮单层培养以及上皮-间充质共培养。尽管该方法仅适用于多孔膜，但它仍是一种低投入、可高效制备稳定且适用于细胞培养的气液界面（ALI）芯片的方法。
图1。PDMS芯片半片制备与膜制备示意图。 在PDMS芯片半片制备（步骤1.2）中，使用宽口径注射器将液态PDMS注入芯片模具，上模注入4.4 mL，下模注入2.4 mL。PDMS半片在65 °C下固化2小时，随后在上层芯片半片的腔室末端及模具所示位置打孔形成4个入口。在膜制备（步骤1.3）中，将打印好的膜模板牢固地贴合在膜表面，使用新刀片沿模板边缘切割，并将芯片用膜从周围材料中分离。膜可用于细胞培养的涂层处理，或直接进入步骤2使用。使用BioRender制作。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2．膜结合步骤。使用前立即按照上述方法配制PDMS灰浆。将灰浆滴加至培养腔周围的四个角落，并用移液管的斜端轻轻涂抹至膜结合区域。先将膜的一端放置于灰浆上，待其与培养腔对齐后，再轻柔地让其自然贴合到位。随后以滴加方式重新涂抹灰浆，并仔细刷涂膜的边缘，注意避免任何硅胶接触培养区域内的膜表面。完成半芯片膜结合后，立即放入真空室中，以去除微小气泡，确保硅胶渗入表面及孔隙，并去除甲苯，从而最小化对膜的化学侵蚀。使用BioRender绘制。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3．膜放置示例。 (A) 成功的膜放置，在室温下固化。(B) 在烘箱中固化的膜结合（65 °C 而非室温），可见膜因硅胶加热后收缩而向腔室内膨出。(C) 完整的芯片，PET和PC膜位置正确。(D) 膜放置不当会导致芯片每侧体积随膜移动而改变，引起流动不稳定，并对芯片内的细胞以及连接在芯片上的泵施加应力。使用BioRender创建。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4。切片并封片的PET和PC膜的光学显微镜图像。 显示由于我们的真空室温固化程序，硅胶渗入膜孔的情况。（A） 同一膜在未施加PDMS时的图像，可见清晰的孔隙，以及偏振光图像中干净的表面。（B） PDMS砂浆用尼罗红染色后，可见品红色的硅胶成功渗入孔隙，并在真空条件下薄层覆盖表面。白色/品红色区域已高亮显示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5。在PDMS砂浆中使用或不使用甲苯作为稀释剂对芯片装置的细胞活力无显著影响。 将Calu-3细胞以每芯片6.5 × 104个细胞的密度接种，在达到汇合状态后，于刃天青检测前对上清液进行过夜孵育，并对细胞进行台盼蓝染色。使用或不使用甲苯制备的组别之间（n=4）的差异通过非配对Student t检验进行分析，p > 0.05 = ns（无显著性差异）8。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6．基底膜芯片。（A）由于PDMS/甲苯砂浆未及时抽真空，导致膜完整性失效，从而损伤了基质蛋白并破坏了芯片的密封性。（B）膜和芯片密封成功，但膜处于松弛状态被密封。（C）膜和芯片密封成功，芯片具备流体流动和拉伸功能。请点击此处查看该图的放大版本。
图7．拉伸状态下的ECM芯片的两张图像。（A） 芯片处于静止状态。（B） 芯片在1.2 mm水平拉伸下的状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图8。人肺Calu-3上皮细胞在芯片中经气液界面暴露后进行阿尔新蓝染色（细胞核呈洋红色，黏液呈蓝色）。 Calu-3细胞培养至融合状态后，在基底侧以150 µL/h的持续流速培养10天，顶侧则分别进行培养基覆盖或空气暴露。培养过程中使用蠕动泵在37 °C、5% CO2的培养箱内维持灌注。培养结束后取出膜结构并进行染色。图中显示了Calu-3细胞在培养10天后，完全浸没培养 (A) 与空气暴露培养 (B) 条件下的阿尔新蓝染色横截面图像8。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9。装置内长期共培养的原代人上皮细胞与成纤维细胞的可视化。 将气道成纤维细胞接种于装置中，过夜贴壁后翻转装置，并在膜的另一侧接种上皮细胞。细胞培养至融合状态后暴露于空气，在37 °C、5% CO2的培养箱中，以蠕动泵维持150 µL/h的持续流速继续培养21天。培养结束后取出膜，经固定、包埋后切片并贴附于载玻片上进行染色。上皮细胞使用黏蛋白5AC（MUC5AC）18（黏液组分）和叉头框蛋白J1（FOXJ1）19（参与纤毛生成信号通路的转录因子）进行染色。成纤维细胞使用麦芽凝集素（WGA）染色以显示细胞磷脂双分子层。细胞在HBSS中与5 µg/mL的染料孵育15分钟，随后用PBS洗涤三次，再进行成像。所有细胞核均用DAPI染色显示。（A）横截面视图：由（B）和（C）图像的Z轴层扫投影生成。（B）芯片膜上上皮细胞的MUC5AC/FOXJ1/DAPI染色。（C）基底层腔室中成纤维细胞层的完整外部结构8。请点击此处查看该图的放大版本。
图10细胞活力及在基底膜支架上的共培养。（A） 在表皮侧接种的HaCaT细胞的活/死染色活力检测，共检测了3个独立样本，每个样本随机采集3个视野（n = 3）。采用单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）结合Tukey校正进行统计检验。图表显示均值±标准差。共培养的 （B） 上皮侧的 HaCaT 细胞 (C) 含有基底膜支架的基质侧由胶原纤维包绕的MRC-5肺成纤维细胞，比例尺为50 µm。 (D) 从顶部和底部等距视图观察的共培养3D图像，比例尺为100 µm，动态可视化见于 补充材料 图4(E) 脱细胞前后基底膜支架的厚度，共测量了14个黏膜样本，其中6个（以三角形表示）用于脱细胞处理。对每个样本随机扫描三个视野，每个视野至少测量10个点。17. 请点击此处以查看此图的放大版本。
补充图1. 标准PET/PC芯片上下两部分的芯片模具设计。（A） 芯片底部模具的图像，可由补充文件1中的.STL文件制作而成。（B） 芯片顶部模具的图像，可由补充文件2中的.STL文件制作而成。（C） 用于切割芯片膜的膜片模板图像，可由补充文件3中的.STL文件制作而成。请点击此处下载该文件。
补充图2. 拉伸ECM膜芯片上下两部分的芯片模具设计。（A）芯片底部模具的图像，可由补充文件4中的.STL文件制得。（B）芯片顶部模具的图像，可由补充文件5中的.STL文件制得。请点击此处下载该文件。
补充图3. 密封程序的验证：比较不使用甲苯降低砂浆黏度并在常温下无真空处理时PDMS侵入孔隙的情况。所有条件均使用PET膜（0.4 µm孔径），经PDMS（含1%尼罗红）处理后，将膜嵌入石蜡中，再进行封片和光学显微镜成像。(A) 未经稀释的PDMS在真空条件下涂覆于PET膜上。可见膜表面形成较厚的PDMS层，而PDMS未进入膜的孔隙中（以白色框高亮显示）。(B) 稀释后的PDMS砂浆在真空条件下涂覆于PET膜上。膜表面可见PDMS层，但未观察到PDMS进入孔隙（以白色框高亮显示）。(C) 稀释后的PDMS砂浆在真空条件下涂覆于PET膜上。膜表面可见一层较薄的PDMS，并且可观察到PDMS沿膜侵入孔隙内部（以白色框高亮显示）。请点击此处下载该文件。
补充图4. 猪源ECM支架上共培养HaCat（上皮细胞）与MRC-5（间质细胞）的三维可视化图像。 该共培养体系的顶部与底部等距视图的三维动画，其静态图像见图10D，比例尺为100 µm。请点击此处下载该文件。
补充文件 1. 底部模具的 3D .STL 文件。 该模具可用于通过 3D 打印或等效制造方法制作标准芯片的下半部分。请点击此处下载此文件。
补充文件 2. 上模具的 3D .STL 文件。 该模具可用于通过 3D 打印或等效制造方法制备标准芯片的上半部分。请点击此处下载此文件。
补充文件 3. 膜模板的 3D .STL 文件。 该模板可用于制备适用于所提供芯片的正确尺寸的膜，可通过 3D 打印或等效的制造方法制作。 请点击此处下载此文件。
补充文件 4. 拉伸芯片底部模具的 3D .STL 文件。 该模具可通过 3D 打印或等效制造方法用于制备拉伸芯片的下半部分。请点击此处下载此文件。
补充文件 5. 拉伸芯片上模具的 3D .STL 文件。 该模具可通过 3D 打印或等效制造方法用于制备拉伸芯片的上半部分。请点击此处下载该文件。
讨论
本文提供的芯片封接方案代表了一种制备防水PDMS-膜芯片密封的新方法，该方法适用于在流动条件下进行长期培养，仅需有限设备即可完成，且无需特殊技能即可掌握。我们展示了使用硅胶灰浆将膜材料（PET、PC、ECM）固定在表面以制备带膜芯片晶圆的操作流程，并证明快速施加真空可促进PDMS渗入塑料膜的孔隙并覆盖其表面。我们还证实，所制备的芯片密封良好，能够胜任多种细胞培养应用。
PDMS与塑料的键合有多种不同的方法，这种键合策略十分常见，因为PDMS具有利于细胞培养的特性，例如透气性或可图案化性，而塑料膜则具有良好的细胞培养相容性7。这些方法包括使用O2等离子体、电晕或臭氧处理进行表面活化，从而促进硅或玻璃之间共价键的形成20。此外，也可采用化学粘接技术，使用诸如APTES（(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷）或MPTMS（(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷）等有机硅烷对两种材料的表面进行功能化，引入反应性基团21。另一种方法是使用环氧树脂或其他胶粘剂将PDMS与塑料基底粘合22。本文提出一种结合表面活化与化学粘接的混合方法，利用多孔膜和真空条件，在仅通过O2等离子体 表面活化的情况下，形成穿过膜的物理连接。通过甲苯稀释PDMS，我们使其在真空条件下渗入膜的孔隙中，从而实现不同膜材料通过PDMS-PDMS共价键在芯片两半以及嵌入砂浆的膜之间牢固结合。通过在这些孔隙中形成物理性的硅胶网络，我们避免了对表面化学处理或热压机提供的高温高压的依赖，而这些条件通常是辅助上述技术所必需的23。
在本研究中，提供了一种大规模双室芯片（补充文件 1），该芯片可实现多种功能。其次，提供了一种能够进行周期性水平拉伸的芯片（补充文件 2）。这些装置可作为“器官芯片”中的气道模型（Airway-on-Chip），同时该模型也可用作肠芯片（gut-on-chip），如先前研究所示13。本文主要提供了一个逐步操作指南，其中包含多种不同的模具制备、膜准备和芯片构建方案，可根据研究人员的具体需求应用于其他新型芯片平台。建议在最终封合步骤中使用 O2 等离子体炉。然而，手持式等离子体设备或使用 PDMS 砂浆进行手动加压也已被证实在此步骤中可行24。在本操作规程中，针对封合过程的各个关键环节，已明确指出了关键难点与技术要点，包括是否预先包被膜、PDMS/甲苯砂浆必须立即使用的重要性、确保砂浆不进入培养区域的重要性，以及在砂浆连接完成后膜不得发生位移的必要性。
研究人员已多次根据书面方案重复此封接操作；仅需以下几点说明即可在第二次尝试时成功完成封接。在进行应力测试或长期细胞培养过程中若出现泄漏，可考虑几种解决方案。首先，研究人员应确保灰浆是用尚未开始固化的PDMS液体新鲜配制，并与甲苯充分混合。灰浆的低黏度特性使其能够形成一层薄而光滑的涂层，在抽真空时流入膜孔隙中。其次，应涂抹足够的灰浆以完全覆盖膜的底部和顶部，但若用量过多，在加压时会流入培养区域， 而用量过少则会留下间隙，导致室间泄漏。第三，膜在安装前及安装过程中必须保持平整。 最后，尽管该过程依赖手工操作，芯片必须始终保持高度洁净，以确保最终完全键合，因此快速且洁净的操作至关重要。
尽管本文展示了三种不同类型多孔膜的连接方法，但该方法对其他膜材料的适用性尚无法预测。这是因为不同材料对甲苯的化学耐受性以及孔隙密度和尺寸的差异，均会影响密封过程的结果。然而，我们首次实现了可拉伸的全细胞外基质（ECM）膜结合，表明该方案具有较高的通用性。但膜的拉伸性能一致性尚未得到可靠验证，因为不同的基底膜区域、器官来源和制备批次可能导致力学性能的差异。此外，ECM膜在细胞培养中的活性也容易随时间发生变化，无论是在培养过程中还是在储存期间19。尽管该方法适用于多种膜材料和芯片结构，但其有效实施依赖于 人工涂抹灰浆的操作，虽然耗时较短，但在我们所提供的较大规模模型上更容易成功。最后，尽管膜结合过程仅需使用PDMS、甲苯、膜材料和真空腔室，但芯片的最终密封仍需依赖O2等离子体处理，而该设备并非在所有实验室都具备。
尽管存在一些局限性，但所提供的实验方案具有创新性，且无需特殊技能即可操作。据我们所知，通过抽真空将低粘度的PDMS砂浆经膜孔形成硅橡胶网络的方法尚属首次。与以往在功能芯片所用不同材料之间实现化学或机械功能连接的方法不同，该方案可在大多数实验室环境中实现。
致谢
本工作得到了精准医学供氧（P4O2）联盟以及Stichting Proefdiervrij基金的支持。衷心感谢Isadora Kraguljac提出使用尼罗红染色的想法，该染料可与聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合，用于可视化硅胶网络结构；同时感谢Marjan Reinders-Luinge在膜切片与封片方面的出色技术。作者谨向药物分析部门及Sabeth Verpoorte致以最诚挚的谢意，感谢他们提供氧气等离子体炉的使用权限，若无此设备，本项工艺将无法实现。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 宽口注射器 | BD Emereld | 307727 | |
| 2 mm 活检打孔器 | KAI medical | BP-20F | |
| Calu-3 细胞系 | ATCC | HTB-55 | RRID: CVCL_0609 |
| HBSS（Hanks 平衡盐溶液） | Gibco | 14170112 | |
| O2 等离子体烘箱 | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| PC 微孔细胞培养膜 | ipCELLCULTURE | 1000M25/620N403/47 | |
| PET 微孔细胞培养膜 | ipCELLCULTURE | 2000M23/610N403/47 | |
| 聚二甲基硅氧烷/Sylgard 184 硅橡胶基础剂与固化剂 | Dow Corning | DOWC25100445 | |
| 聚甲基丙烯酸甲酯（8 mm） | Colltec | N/A | |
| 标准光敏树脂（灰色）（1 kg） | Elegoo | N/A | |
| 甲苯 | Merck | 1,08,325 | |
| 真空腔室 | FisherScientific | 12080253 |
参考文献
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