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方法文章

一种用于术后腹腔粘连形成的可转化外科猪模型

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DOI：

10.3791/70377

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2026年3月13日

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1Department of Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Material Science and Engineering, Stanford University, 5Sarafan ChEM-H, Stanford University, 6Department of Pediatrics (Endocrinology), Stanford University School of Medicine, 7Woods Institute for the Environment, Stanford University

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用进行开腹手术并接受肠切除的尤卡坦小型猪建立的术后腹腔内粘连形成的猪模型。该方法可稳定诱导腹腔内粘连，为研究粘连的形成过程以及评估抗粘连策略提供了一个有效平台。

摘要

采用尤卡坦微型猪建立术后腹腔内粘连形成的猪模型。该方案结合了正中开腹术、小肠切除术及双层一期吻合术，并采用单侧壁层腹膜摩擦损伤的方式，以开放性腹部手术的形式进行。术后四周，采用既定的大体和组织学评分标准评估粘连形成情况，评估由经过设盲的观察者完成。使用该模型的所有动物均出现粘连，且呈多灶性分布，累及肠袢之间、肠管与腹壁之间、腹部其他器官表面的腹膜（如肝脏），以及手术区域，严重程度不一。术后四周的组织学分析显示，粘连组织主要由细胞外基质、成纤维细胞和血管构成，符合处于重塑阶段的伤口愈合组织表型。该模型适用于腹腔粘连纤维化生物学研究，以及抗粘连治疗候选药物的转化评价。通过将临床相关的肠道手术操作、明确的腹膜损伤与标准化评估策略相结合，本方案为在大型动物模型中诱导和评估术后腹腔内粘连提供了一种可重复的方法。

引言

术后粘连是腹部和盆腔手术后主要的并发症来源，高达93%的患者会出现此类问题1,2，其中约20%的患者在术后五年内因粘连相关并发症需要住院治疗3,4。腹膜损伤可由腹部外科手术引起，也可由腹腔内刺激（如感染或化学物质暴露）或慢性炎症性疾病（如炎症性肠病）所致。由此形成的粘连可导致多种临床后果，包括反复发作的肠梗阻（有时需再次手术）、不孕症以及慢性疼痛5,6,7。 在恶性肿瘤的多脏器切除术（如减瘤手术）、慢性炎症或肠穿孔后，粘连的形成可能尤为严重，因为广泛的腹膜损伤会加剧纤维化反应。此外，粘连性疾病还会显著增加后续外科手术的难度，常常导致无法实施微创手术，或造成肠道及其他器官的意外医源性损伤。

尽管粘连具有重要的临床意义，但有效的抗粘连策略的开发仍受到限制——这可能部分归因于现有临床前模型在模拟人体解剖结构、生理特征以及伤口愈合反应方面存在局限性8。啮齿类动物模型因其易得性、实验可操作性强以及能稳定形成粘连而被广泛使用9,10,11。然而，其较小的腹腔、较薄的肠系膜以及独特的炎症微环境可能限制其在转化研究中的相关性8,12。这些模型虽推动了抗粘连方法的发展，某些方法在动物实验中表现出显著疗效，但在人体中的临床获益有限或依赖于特定条件8,13,14,15,16,17。此外，在啮齿类动物中难以以具有转化相关性的方式模拟与人类相当的外科手术操作，如肠切除与吻合术，而药物代谢的种属差异进一步限制了 临床推断的可靠性18。

大型动物模型，尤其是猪，由于其解剖和生理特征与人类相似，并且手术操作性相近，被广泛用于研究腹部相关过程，为研究粘连形成及测试治疗干预措施提供了平台19,20,21,22。现有的猪类粘连模型已提供了重要的研究见解，但许多模型聚焦于特定手术操作引起的粘连形成，且通常缺乏标准化的操作流程，限制了其应用价值，尤其是在开放性肠部手术后严重粘连的研究方面23,24,25,26,27。

为解决这些局限性，我们建立了一种猪术后腹腔粘连模型，该模型结合了正中腹切开术、小肠切除术以及单侧腹壁腹膜摩擦损伤。这种多灶性腹膜损伤策略重现了腹部外科手术中常见的促粘连性损伤，在术后四周时间点可形成不同强度和位置的粘连，且在实施定向腹壁摩擦的一侧腹壁 必定产生粘连，同时在腹腔其他区域形成随机分布的粘连。通过将具有临床相关性的肠道手术操作与明确且可重复的腹膜损伤相结合，该模型克服了既往猪模型的关键局限性，为研究术后粘连的形成机制以及评估抗粘连干预措施提供了一个稳定可靠的实验平台。

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方案

伦理声明

所有猪的研究均按照斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）方案 #34052 批准的协议进行，该方案此前已有描述28。

1. 动物饲养

  1. 从经过认证的供应商处获取尤卡坦小型猪（推荐体重9至12公斤，7至9周龄）。建议每组使用 n = 4头猪。将动物成对饲养于光照和温度可控的房间内。
  2. 自由提供标准猪饲料。动物应可随时获取饮用水，以避免脱水。
    注意：动物在手术及终末取材前需禁食12小时。
  3. 按照机构标准，定期监测并记录体重和总体健康状况。

2. 麻醉与术前准备

  1. 在猪的饲养环境中使用肌肉注射赛拉嗪（2.2 mg/kg，肌肉注射[IM]）和氯胺酮（12 mg/kg，IM）进行镇静。建立静脉通路。待执业兽医评估镇静效果充分后，小心将动物转运至手术室。有关麻醉与镇痛信息，请参见补充表格，具体方案可能因机构而异。
  2. 进入手术室后，通过气管插管确保动物气道通畅。在持证兽医的监督下，通过配备废气清除系统的麻醉回路，使用精密挥发罐向氧气中加入异氟烷，以在整个手术过程中维持麻醉状态。
  3. 根据需要给予静脉输液、抗恶心药物（马罗匹坦，1–2 mg/kg，IV）、血管收缩药物和正性肌力药物，以治疗术中低血压，避免肠道灌注不足，降低吻合口漏的潜在风险。完整药物信息请参见补充表格，具体用药方案依机构而定。
  4. 涂抹眼用软膏以润滑眼睛，防止角膜擦伤。在切皮前1小时给予头孢唑林（25 mg/kg，IV）或等效抗生素，以预防伤口感染。根据机构兽医标准实施术中镇痛方案。补充表格中提供参考方案，包括卡洛芬（25 mg/kg，IV）与长效布托啡诺（0.18 mg/kg，IV）联合用药。

3. 手术步骤

  1. 将动物仰卧位置于加热垫上以维持正常体温。每10分钟通过脉搏血氧仪测量血氧饱和度（SpO2），用心率监测仪监测脉搏，并监测体温。
  2. 使用电动剪刀去除腹部毛发，随后用酒精棉片擦拭皮肤一次，再用浸有聚维酮碘的纱布进行皮肤准备。用无菌毛巾吸去腹部多余的消毒液。
  3. 用无菌毛巾和手术巾覆盖腹部，以在整个操作过程中维持无菌状态。在预定切口部位使用25号针头于腹壁皮下注射利多卡因（2 mg/kg，皮下注射（SQ））。
  4. 沿腹白线使用10号刀片手术刀做正中腹切开术，全层切开皮肤、皮下组织及腹壁肌肉以进入腹膜腔。放置腹壁牵开器并外翻肠管。
  5. 在距回盲瓣近端约10–15 cm处识别一段肠管，使用剪刀切除2.5 cm（1英寸）的小肠节段。使用电凝切除相应的肠系膜，以实现肠系膜血管的止血。使用间断的3-0丝线缝合关闭两端肠管，确保严密闭合。行双层侧侧一期吻合术（功能性端端吻合）。内层采用合成的3-0可吸收缝线连续缝合，外层采用3-0不可吸收缝线连续缝合。在整个操作过程中尽量减少肠内容物溢出。
  6. 使用无菌纱布或电凝划痕板，对右侧腹壁腹膜壁层约3 × 5 cm区域进行轻柔摩擦，施加中等压力摩擦10–15次，直至腹膜表面呈现毛糙外观或腹壁出现浆膜下水肿。左侧腹壁可不进行摩擦，作为技术对照；但在此模型中，粘连通常随机分布于整个腹部，类似于人类疾病表现。
  7. 将肠管复位至腹腔内，移除腹壁牵开器。用1 L温热的无菌生理盐水冲洗腹腔，彻底吸除所有液体，并在关闭切口前确认止血（无活动性出血）。
  8. 使用连续的2-0可吸收缝线缝合筋膜。使用连续的2-0或3-0不可吸收缝线行锁边缝合（棒球缝合）关闭皮肤，并以无菌敷料覆盖切口。该手术平均持续时间为1小时。
  9. 手术结束时静脉注射阿替美唑（0.2 mg/kg）以逆转镇静作用，随后拔管。动物自主呼吸恢复后予以拔管。持续监测生命体征（脉搏、血氧饱和度、体温、血压），直至完全从麻醉中恢复。

4. 术后护理

  1. 术后前3天每天口服（PO）卡洛芬（Carprofen）25–50 mg，每日两次，之后根据需要（PRN）给予镇痛。保持动物摄入液体饮食 高 术后前3天采用蛋白质饮食（每天2次，每次1.5瓶）。
    注意：尽管术后10–14天常规拆线是常见做法，但在无伤口感染或裂开迹象的动物中，为避免在计划的4周处死前额外进行麻醉操作，缝线保持原位未予拆除。
  2. 口服阿莫西林（10 mg/kg），每日两次，持续一周，之后根据伤口感染指征（红肿、温热，伴或不伴渗出）按需给药。
  3. 每天检查动物两次，观察其食欲、活动情况、肠道功能及伤口完整性。若怀疑感染，应与兽医讨论抗生素的剂量与使用时长。手术后最初3天应保留无菌敷料，以尽量降低伤口感染风险。术后每2至3天记录一次体重，以确保体重维持稳定。
  4. 从术后第4天（POD4）开始将动物过渡到固体饲料。在动物仅通过固体饲料摄入足够热量之前，用补充性液体高蛋白饮食辅助固体饲料的摄入。

5. 安乐死

  1. 在兽医监督下，按照机构和美国兽医协会（AVMA）标准，使用静脉注射安乐死溶液，在4周时对动物实施安乐死，随后进行尸检和组织采集。
  2. 肉眼评估粘连情况。立即采集组织和血液样本用于后续分析。所有生物性和药物性废弃物应按照所在机构的环境健康与安全指南进行处理。

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结果

所提出的猪术后粘连模型（图1）结合了一种改良的评分系统，用于实时评估粘连程度28。在4周时间点，由3名对实验条件设盲的研究人员独立完成粘连评分，评估对象为一组具有代表性的n=4只猪，每只动物的最终粘连评分取三者平均值（图2A）。在腹腔内受检动物中，无论腹部刮擦侧还是非刮擦侧，均在100%的动物中形成了腹腔内粘连28。刮擦侧的粘连评分显著高于非刮擦侧（图2A）。刮擦侧与非刮擦侧之间的差异采用非配对t检验确定（p < 0.05）。在所有动物中，粘连累及多个腹部部位，包括小肠和大肠、肝脏Glisson囊、大网膜及其他内脏结构（图2B）。为进行后续分析，将粘连组织小心分离并单独采集，同时将任何感兴趣的邻近组织分别收集，以避免交叉污染（图2C）。术后4...

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讨论

所提出的猪类粘连模型为腹腔内粘连的建模提供了一种具有临床相关性和可靠性的方法。与局灶性或单部位损伤模型相比，本研究有意选择了中线开腹术、小肠切除吻合术以及标准化的壁层腹膜摩擦损伤相结合的方式，以重现开放性腹部手术过程中所遇到的多种腹膜损伤因素。沿腹侧壁对壁层腹膜进行可控摩擦，模拟了人类开腹手术中常见由牵开器引起的组织损伤，而肠切除与吻合术则引入了具有临床相关性的肠道操作、缺血应激以及缝线介导的炎症反应。

利用该模型，所有动物均形成了不同程度和分布的粘连，重现了普通外科临床实践中所遇到的复杂粘连性疾病，包括常见的术后后遗症，如粘连性肠梗阻，以及在非直接损伤部位（未擦伤侧）出现的粘连。尽管该模型有意在腹腔内特定部位造成擦伤以诱导粘连形成，但需要注意的是，整个腹膜腔均暴露于具有损伤性的条件之下，包括干燥、灌洗以及腹壁牵拉，这些因素本身已足以诱发粘连形成。在此背景下，该模型反映了一种全局性的"场效应"，模拟了临床实践中腹部手术所伴随的弥漫性腹膜损伤风险。

该方案适用于多种物种。我们此前已证明，此模型可在小鼠中实施并具有...

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披露

作者无相关披露信息。

致谢

本研究发表的工作得到了斯坦福大学SPARK项目、美国外科医师学会外科粘连改进项目资助（由卡里诺家族慷慨资助）以及斯坦福大学外科系的支持。我们感谢斯坦福大学兽医服务中心及比较动物馆的工作人员。所有观点、分析、参考文献和图表均由作者创建并核实。人工智能工具仅用于轻微的语言和语法修改。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物
雌性尤卡坦微型猪，体重9至12公斤（7至9周龄）S&S Farms8
外科手术用品
DMI4000 B 显微镜Leica Microsystems组织学
材料
Euthasol Virbac安乐死
伊红Y醇溶液染色剂Azer Scientific  Cat#ES709组织学
磨砂载玻片Fisher Scientific Cat#12-550-400组织学
Mayer′苏木精溶液 Sigma-Aldrich 货号 MHS80 组织学
药物
阿莫西林Covetrus59629感染预防
10 mg/kg 口服，每日两次，持续1日
Ancef/头孢唑林Covetrus84773术前感染控制
25 mg/kg 静脉注射
阿替美唑Covetrus82124镇静逆转剂
0.2 mg/kg 
阿托品Covetrus74760心动过缓
0.04 mg/kg  
布托啡诺缓释剂（ER）Wedgewood Pharmacy镇痛
0.18 mg/kg 静脉注射
卡洛芬 - 术中使用Dechra镇痛
25 mg/kg 静脉注射 
卡洛芬 - 术后Dechra镇痛
25-50毫克 口服 必要时
CereniaZoetis止吐
术中静脉注射一次，剂量为1-2 mg/kg
异氟烷Dechra镇静 
利多卡因 2%VetOneV1 510212镇痛
术前切口前皮下注射 2 mg/kg
氯胺酮Dechra麻醉 &与镇痛
12 mg/kg 肌内注射
多巴酚丁胺Hospira 根据麻醉医师进行给药与滴定 
聚维酮碘（Betadine）ValleyVet12265消毒剂
赛拉嗪（Rompun）DechraGW l400000镇静/镇痛
2.2 mg/kg 肌内注射
外科手术用品
3-0 PDS（聚对二氧环己酮）缝线EthiconCat#Z316H吻合术
数量 - 2 
3-0 丝线缝合线（弹脱式） EthiconCat#1679H吻合术
数量 - 1 包弹出式盖子
0-0 PDS（聚对二氧环己酮）缝线EthiconCat#Z990G白线关闭
数量 - 1
3-0 Prolene 缝线EthiconCat#8684G皮肤闭合
数量 - 1
Bovie 电灼器 Grayline Medical SupplyCat#E2516稳态与切割
一套标准的无菌腹部外科手术器械，包括腹部拉钩（如Army/Navy拉钩或Richardson拉钩）。 
3M Tegaderm + Pad 3MCat#3593外科敷料
高蛋白液体饮食确保饮食
1.5 瓶，每日两次
软件
BioRender协议编号 SH28Z3OOKI图像生成 
Adobe IllustratorAdobev29.8.1图像生成 
FIJINIH图像生成 
*注：人工智能工具仅用于轻微的语言和语法修改*
每日两次  IV - 静脉注射，IM - 肌肉注射，PO - 口服，SQ - 皮下注射，PRN - 按需

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