从小鼠阿霉素心脏毒性模型中分离心室心肌细胞

摘要

本方案描述了一种可重复的、无需兰格多夫（Langendorff）装置的方法，用于从阿霉素诱导的心脏毒性模型中分离出具有活性的成年小鼠心室心肌细胞。该方法采用直接左心室顺行灌注，随后进行可控的酶消化，以获得耐钙、杆状的心肌细胞，适用于结构、分子和功能分析。

摘要

阿霉素（Doxorubicin, DOX）是一种有效的化疗药物，其临床应用受到剂量依赖性进行性心脏毒性限制，主要影响心室心肌。在此背景下研究细胞损伤机制需要可靠地分离成年心肌细胞，而在病变或结构脆弱的心脏中，这一过程在技术上具有挑战性。本文介绍了一种无需Langendorff装置的简化且可重复的方案，用于从阿霉素诱导心脏毒性的小鼠中分离功能性心室心肌细胞。在建立C57BL/6小鼠的DOX模型后，迅速切除心脏并夹闭主动脉 离体通过左心室直接进行非循环顺行灌注，使用无钙且含酶的缓冲液。消化后的心室组织经轻柔的机械解离获得单个心肌细胞，随后通过受控方式重新引入钙离子以恢复细胞的钙耐受性。该方法可获得高质量、存活率高、杆状形态的心肌细胞，适用于多种下游实验，包括免疫荧光、肌节结构分析、凋亡检测以及分子信号通路研究。由于无需使用专用的朗根多夫（Langendorff）灌注设备，本方案为研究多柔比星（DOX）诱导心脏损伤机制的实验室提供了一种简便且高产量的解决方案。

引言

阿霉素（DOX）是一种强效的蒽环类化疗药物，但其临床应用受到累积性心脏毒性的限制，这种毒性可进展为扩张型心肌病和心力衰竭^1,2。心肌细胞凋亡是该毒性中的关键致病过程^3,4,5，研究这些细胞事件需要可靠地获取来自阿霉素损伤心脏的功能性成年心肌细胞。然而，阿霉素暴露会使心肌细胞结构脆弱且代谢功能受损⁶，显著增加其在分离过程中对酶解和机械应力的敏感性，导致细胞存活率低下。在现有文献中，朗根多夫灌流法仍是成年心肌细胞分离的主要方法⁷。然而，该方法在应用于受损心肌时存在明显局限性。该技术需要专用设备、精确的主动脉插管以及较高的操作熟练度；在阿霉素处理的心脏中，朗根多夫灌流过程中引入的额外机械应力可能进一步加重细胞损伤，导致结果不一致且常不理想⁸。

为克服这些挑战，我们建立了一种简化且易于操作的方案，用于从急性阿霉素诱导的心脏毒性小鼠模型中分离出耐钙的成年心室心肌细胞⁹通过取消对传统朗格多夫灌注的需求，转而实施一种可控的 离体 通过左心室直接进行顺行灌注，该方法可最大限度减少缺血暴露，并降低对心肌的机械性操作。这些特点有望提高操作的一致性，并改善源自功能受损心脏的易损心肌细胞的存活率^7,10.

目前的方法基于无Langendorff心脏灌流的心肌细胞分离技术的最新进展，并将这些概念扩展至成年心室细胞。成年心室细胞需要维持成熟的收缩结构和钙处理特性，而这些特性无法通过主要针对新生心脏开发的简化消化方法得到充分支持^11,12。因此，本方案为缺乏专用灌注系统的实验室提供了一种实用且可重复的替代方法。所分离的心肌细胞保持了其结构完整性，适用于多种下游应用，包括肌节分析、免疫荧光成像以及凋亡信号通路研究，从而能够在生理相关背景下直接探究阿霉素（DOX）诱导的心脏损伤机制。总体而言，本方案解决了从阿霉素损伤心脏中分离出有活力心肌细胞这一尚未满足的关键需求。

方案

所有动物实验均按照实验室动物护理和使用的机构及国家指南进行，并经西安交通大学机构动物护理和使用委员会审查批准（批准号：XJTUAE2022-1441）。所使用的耗材、试剂和设备列于材料表中。

1. 建立多柔比星诱导的C57BL/6小鼠急性心脏毒性模型

1. 动物准备：使用8至12周龄的雄性C57BL/6小鼠（24–28 g），在标准条件下饲养，保持12小时光照/12小时黑暗循环 随意摄取 可自由获取食物和水。将小鼠随机分为DOX处理组和生理盐水对照组（每组n = 3）。
2. DOX 给药
   1. 在无菌生理盐水中配制浓度为1.5 mg/mL的新鲜多柔比星溶液。用铝箔包裹容器以避光保存。
   2. 称重每只小鼠，并计算单次腹腔（i.p.）注射15 mg/kg剂量的给药体积^13,14.
   3. 轻柔地固定小鼠并给予 DOX 溶液 通过 腹腔注射。将小鼠放回笼中，并按照实验计划继续操作。
      警告：DOX 是一种细胞毒性试剂。请穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜），并在指定的化学安全区域操作该试剂。
3. 时间线与监测：每天监测小鼠的一般健康状况和行为。每隔一天记录一次体重。在注射DOX后7天进行心肌细胞分离。

2. 心肌细胞分离用溶液和手术器械的准备

1. 缓冲液制备：这些溶液的详细制备方法见补充表1。
   1. 制备灌流缓冲液和EDTA缓冲液。使用NaOH将所有溶液的pH值调节至7.4。
   2. 用灌流缓冲液配制含有II型胶原酶、IV型胶原酶和XIV型蛋白酶的酶消化液。
   3. 在灌流缓冲液中添加5%胎牛血清（FBS），制备终止缓冲液。
   4. 在M199培养基中加入0.1%牛血清白蛋白（BSA）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、10 mM 2,3-丁二酮单肟（BDM）、脂质浓缩物以及青霉素/链霉素（P/S），制备完全培养基。
   5. 将完全培养基加入灌流缓冲液中，分别配制终钙离子浓度为0.34 mM、0.68 mM和1.02 mM的钙重灌缓冲液。
      注意：所有溶液均需在无菌条件下制备，使用0.22 µm滤器过滤。溶液置于4 °C避光保存，最多可保存两周。分离一只小鼠心脏时，需准备50 mL EDTA缓冲液、100 mL灌流缓冲液（其中60 mL用于胶原酶溶液，10 mL用于终止缓冲液，其余用于灌流和重力沉降）、60 mL胶原酶缓冲液和10 mL终止缓冲液。
2. 手术器械准备：手术前通过高压灭菌对所有手术器械进行灭菌。在手术区域按顺序摆放以下器械：精细剪刀、弯剪、镊子、弯血管钳（图1A）和注射泵（图1B）。

3. 从阿霉素处理的心脏中分离心肌细胞

注意：心肌细胞分离步骤的示意图见图2。在确认所有手术器械、设备和溶液均已准备就绪后，开始分离操作。

1. 主动脉夹闭与心脏切除
   1. 使用 3% 异氟烷麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏测试确认无反应以验证麻醉效果¹⁵。
   2. 将小鼠仰卧位固定于解剖板上。
   3. 沿中线切开皮肤和胸壁以暴露心脏，并剪断降主动脉。
   4. 在约 1 分钟内以受控且稳定的速度将 7 mL EDTA 缓冲液灌注至右心室基底部，以快速清除心室内的血液，同时尽量减少缺血暴露并保持心脏结构完整性，尤其适用于脆弱的多柔比星损伤心脏（图 2A）。
   5. 迅速夹闭升主动脉（图 2B），切除心脏，并立即转移至含有冰冻 EDTA 缓冲液的 100 mm 培养皿中。
      注：从开胸到心脏转移的总时间应理想控制在 2 分钟以内，以尽量减少缺血。
2. 灌注装置设置
   1. 小心修剪掉周围组织。
   2. 将心脏置于含有冰冻灌注缓冲液的解剖皿中。
   3. 使用留置针以 6 分钟内稳定灌注 10 mL EDTA 缓冲液的方式经左心室心尖部进行灌注，以破坏细胞外连接。
   4. 将心脏转移至另一 100 mm 培养皿中，并通过同一导管在 2 分钟内灌注 3 mL 灌注缓冲液以清除心腔内残留的 EDTA。
      注：观察灌注过程中的心脏肿胀情况，并使用弯头止血钳固定主动脉以建立封闭的灌注系统。仔细控制灌注速率和压力，避免过高的静水压，从而降低左心房破裂的风险。
3. 酶消化
   1. 将切除的心脏转移至含有 5 mL 酶消化液的 100 mm 培养皿中。
   2. 将留置针连接至装有 20 mL 酶消化液的注射器，并使用灭菌指示胶带将针头牢固固定在生物安全柜工作台面上。
   3. 将注射器放入微量注射泵中，并以 3 分钟/mL 的受控速率开始灌注（图 2C）。
   4. 通过左心室持续灌注酶溶液 60–90 分钟，直至完成消化，表现为组织弹性完全丧失及心室表面颜色变苍白（图 2D）。若初始灌注后观察到消化不完全，可追加灌注 15–20 mL 酶溶液以继续消化。
      注：更换注射器时应防止针头移位；若发生移位，需重新插入原左心室位置，以保持灌注通路。
4. 组织解离
   1. 将消化完成的心脏转移至含有 5 mL 终止缓冲液的 60 mm 培养皿中。
   2. 使用精细镊子将心室组织撕成小块（图 2E）。
   3. 用 5 mL 移液器轻柔吹打心室组织悬液，以分离单个心肌细胞（图 2F）。
   4. 将细胞悬液通过 100 µm 细胞筛过滤，以去除大块组织碎片。
   5. 用额外 5 mL 终止缓冲液冲洗滤网，以最大化细胞得率。
      注：所有吹打操作均应轻柔进行，移液次数限制在不超过 50 次，以避免对心肌细胞造成机械损伤。
5. 钙离子重新引入
   注：让心肌细胞在 15 mL 离心管中经历 3–4 次连续的重力沉降过程，每次 15 分钟（图 2G）。每次沉降后，小心移除 80% 上清液，并将沉淀重悬于 3 mL 下一阶段的钙离子逐步恢复缓冲液中。每一步均使用预先配制的梯度溶液逐步提高钙离子浓度¹⁶。
6. 细胞计数与接种
   1. 使用血细胞计数板定量细胞密度，并计算杆状与圆形心肌细胞的比例^1,9（图 2H）。
   2. 将 1–5 × 10⁵ 个细胞接种于预先包被层粘连蛋白（10 µg/mL）的 6 孔板中，包被条件为 37 °C 孵育 1 小时，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。如需，可提前一天制备培养板并储存于 4 °C。接种 1 小时后更换为新鲜预温的培养基，之后每 48 小时更换一次。
      注：本方案可在第 3.6 步后暂停。细胞可在短期培养中维持最多 6 小时，用于即时实验。

通过免疫染色评估心肌细胞结构完整性

1. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟。
2. 用 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
3. 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 处理细胞 10 分钟以进行透化，然后用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
4. 用含 1% BSA 的 PBS 封闭非特异性结合位点，封闭 1 小时。
5. 在 4 °C 下与抗肌节 α-肌动蛋白素（sarcomeric α-actinin）的一抗抗体孵育过夜。
6. 用 PBS 轻柔洗涤三次，然后在室温下与相应的荧光二抗孵育 1 小时。
7. 用 PBS 轻柔洗涤三次，然后用 DAPI 复染细胞核 5 分钟。
8. 使用抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。
9. 使用荧光显微镜采集图像，以观察染色模式。

分离心肌细胞中凋亡信号通路的分析

1. 蛋白质提取与定量
   1. 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解心肌细胞。
   2. 将匀浆样品在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟，收集上清液用于后续分析。
   3. 采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid）比色法测定蛋白质浓度。
2. Western blot分析
   1. 取30 µg蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，并将分离后的蛋白质转移至PVDF膜上。
   2. 用含1% Tween-20的TBS缓冲液配制5%脱脂牛奶封闭膜，随后在4 °C下与针对Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3的一抗孵育过夜；这些是多柔比星（DOX）心脏毒性研究中常检测的关键蛋白标志物¹⁷。
   3. 孵育相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，使用增强型化学发光试剂检测信号，并通过数字成像系统获取图像¹⁸。
3. 数据分析
   1. 定量数据以三次独立生物学重复实验的均值 ± 标准误（SEM）表示。
   2. 使用GraphPad Prism进行统计分析，对于多个组别和时间点的比较采用双因素方差分析（two-way ANOVA），两组间比较则采用非配对双尾t检验。当p-值< 0.05时，认为差异具有统计学显著性。

结果

细胞得率与活力的评估

与生理盐水处理组相比，接受多柔比星（DOX）的小鼠表现出明显的体重下降（补充图1A）。急性DOX诱导的心脏毒性模型的成功建立进一步得到了证实，表现为血清中心肌损伤标志物（包括cTnT和CK）显著升高（补充图1B,C），以及通过心脏组织切片的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示心肌细胞凋亡明显增加（补充图1D）。

在模型确认后立即分离心肌细胞。显微镜检查显示，生理盐水处理组和多柔比星处理组的心脏均获得了形态一致的杆状静息心肌细胞（图 3A，B）。细胞短暂贴附于培养皿表面后，高倍镜成像显示两组细胞均具有清晰的肌节条纹结构（图 3C，D）。

讨论

成功分离高质量且耐钙的成年心肌细胞对于心脏病理生理学的细胞水平研究至关重要。本方案可稳定地从健康和病变小鼠心脏中获得具有功能的心肌细胞，其中两个步骤对维持细胞活力尤为关键。首先，需仔细优化并监控酶解灌注的持续时间。消化不足会导致组织解离效果差和得率低，而过度消化则会破坏细胞结构完整性，导致细胞过度收缩或呈圆形。最佳终止点表现为组织弹性的丧失和心室颜色变浅。病变心脏（如经阿霉素处理的小鼠心脏）更为脆弱，使这一最佳时间窗口更窄。建议从标准消化时间开始，并根据观察到的细胞得率和质量进行调整。其次，需逐步重新引入钙离子，以逆转初始无钙灌注所诱导的钙麻痹状态。逐步恢复钙浓度可使心肌细胞重建钙稳态并恢复收缩功能。跳过或加快此步骤将导致细胞过度收缩，并显著降低存活率。

系统性地排查故障对于成功分离成年心肌细胞至关重要，尤其是在应对组织消化和细胞活力方面的挑战时。组织消化不良（心脏未能软化）通常是由于胶原酶保存不当或过期导致酶活性下降所致，此时需要重新配制新鲜的酶液。灌流效率低下也可能阻碍酶的均匀输送，这常由气泡存在或血液清除不完全引起，应仔细检查并排除。相反，当消化看似充分（心脏已软化），但有活...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	喷射生物过滤	TCD000100
100 μm细胞滤筛	Corning	431752
15 mL 离心管	喷射生物过滤	CFT011150
50 mL 离心管	喷射生物过滤	CFT011500
60 mm 细胞培养皿	喷射生物过滤	TCD100060
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A1470
胶原酶II	Sigma-Aldrich	C6885
胶原酶IV	Sigma-Aldrich	C5138
弯头止血钳	RWD生命科学	F22003-10
弯头剪刀	RWD生命科学	S12001-09
精细剪刀	RWD生命科学	S12000-09
镊子	RWD生命科学	F13014-12
留置导管（26G）	Becton, Dickinson and Company	381312
胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS）	MedChemExpress	HY-150287
异氟烷	RWD生命科学	R510-22-10
层粘连蛋白（小鼠）	赛默飞世尔科技	23017015
脂质浓缩物（化学成分明确）	MedChemExpress	HY-K3019
M199 培养基	Sigma-Aldrich	M4530
青霉素-链霉素	MedChemExpress	HY-K1006
蛋白酶XIV	Sigma-Aldrich	P5147
灭菌指示胶带	明尼苏达矿业及制造公司（3M）	CT060934701
注射泵（ISPLab01）	保定申辰精密泵	SC-49464A