从小鼠阿霉素心脏毒性模型中分离心室心肌细胞

摘要

本方案描述了一种可重复的、无需兰格多夫（Langendorff）装置的方法，用于从阿霉素诱导的心脏毒性模型中分离出具有活性的成年小鼠心室心肌细胞。该方法采用直接左心室顺行灌注，随后进行可控的酶消化，以获得耐钙、杆状的心肌细胞，适用于结构、分子和功能分析。

摘要

阿霉素（Doxorubicin, DOX）是一种有效的化疗药物，其临床应用受到剂量依赖性进行性心脏毒性限制，主要影响心室心肌。在此背景下研究细胞损伤机制需要可靠地分离成年心肌细胞，而在病变或结构脆弱的心脏中，这一过程在技术上具有挑战性。本文介绍了一种无需Langendorff装置的简化且可重复的方案，用于从阿霉素诱导心脏毒性的小鼠中分离功能性心室心肌细胞。在建立C57BL/6小鼠的DOX模型后，迅速切除心脏并夹闭主动脉 离体通过左心室直接进行非循环顺行灌注，使用无钙且含酶的缓冲液。消化后的心室组织经轻柔的机械解离获得单个心肌细胞，随后通过受控方式重新引入钙离子以恢复细胞的钙耐受性。该方法可获得高质量、存活率高、杆状形态的心肌细胞，适用于多种下游实验，包括免疫荧光、肌节结构分析、凋亡检测以及分子信号通路研究。由于无需使用专用的朗根多夫（Langendorff）灌注设备，本方案为研究多柔比星（DOX）诱导心脏损伤机制的实验室提供了一种简便且高产量的解决方案。

引言

阿霉素（DOX）是一种强效的蒽环类化疗药物，但其临床应用受到累积性心脏毒性的限制，这种毒性可进展为扩张型心肌病和心力衰竭^1,2。心肌细胞凋亡是该毒性中的关键致病过程^3,4,5，研究这些细胞事件需要可靠地获取来自阿霉素损伤心脏的功能性成年心肌细胞。然而，阿霉素暴露会使心肌细胞结构脆弱且代谢功能受损⁶，显著增加其在分离过程中对酶解和机械应力的敏感性，导致细胞存活率低下。在现有文献中，朗根多夫灌流法仍是成年心肌细胞分离的主要方法⁷。然而，该方法在应用于受损心肌时存在明显局限性。该技术需要专用设备、精确的主动脉插管以及较高的操作熟练度；在阿霉素处理的心脏中，朗根多夫灌流过程中引入的额外机械应力可能进一步加重细胞损伤，导致结果不一致且常不理想⁸。

为克服这些挑战，我们建立了一种简化且易于操作的方案，用于从急性阿霉素诱导的心脏毒性小鼠模型中分离出耐钙的成年心室心肌细胞⁹通过取消对传统朗格多夫灌注的需....

方案

所有动物实验均按照实验室动物护理和使用的机构及国家指南进行，并经西安交通大学机构动物护理和使用委员会审查批准（批准号：XJTUAE2022-1441）。所使用的耗材、试剂和设备列于材料表中。

1. 建立多柔比星诱导的C57BL/6小鼠急性心脏毒性模型

1. 动物准备：使用8至12周龄的雄性C57BL/6小鼠（24–28 g），在标准条件下饲养，保持12小时光照/12小时黑暗循环 随意摄取 可自由获取食物和水。将小鼠随机分为DOX处理组和生理盐水对照组（每组n = 3）。
2. DOX 给药
   1. 在无菌生理盐水中配制浓度为1.5 mg/mL的新鲜多柔比星溶液。用铝箔包裹容器以避光保存。
   2. 称重每只小鼠，并计算单次腹腔（i.p.）注射15 mg/kg剂量的给药体积^13,14.
   3. 轻柔地固定小鼠并给予 DOX 溶液 通过 腹腔注射。将小鼠放回笼中，并按照实验计划继续操作。
      警告：DOX 是一种细胞毒性试剂。请穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套、护目镜），并在指定的化学安全区域操作该试剂。
3. 时间线与监测：每天监....

结果

细胞得率与活力的评估

与生理盐水处理组相比，接受多柔比星（DOX）的小鼠表现出明显的体重下降（补充图1A）。急性DOX诱导的心脏毒性模型的成功建立进一步得到了证实，表现为血清中心肌损伤标志物（包括cTnT和CK）显著升高（补充图1B,C），以及通过心脏组织切片的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示心肌细胞凋亡明显增加（补充图1D）。

在模型确认后立即分离心肌细胞。显微镜检查显示，生理盐水处理组和多柔比星处理组的心脏均获得了形态一致的杆状静息心肌细胞（图 3A，B）。细胞短暂贴附于培养皿表面后，高倍镜成像显示两组细胞均具有清晰的肌节条纹结构（图 3C，D）。

讨论

成功分离高质量且耐钙的成年心肌细胞对于心脏病理生理学的细胞水平研究至关重要。本方案可稳定地从健康和病变小鼠心脏中获得具有功能的心肌细胞，其中两个步骤对维持细胞活力尤为关键。首先，需仔细优化并监控酶解灌注的持续时间。消化不足会导致组织解离效果差和得率低，而过度消化则会破坏细胞结构完整性，导致细胞过度收缩或呈圆形。最佳终止点表现为组织弹性的丧失和心室颜色变浅。病变心脏（如经阿霉素处理的小鼠心脏）更为脆弱，使这一最佳时间窗口更窄。建议从标准消化时间开始，并根据观察到的细胞得率和质量进行调整。其次，需逐步重新引入钙离子，以逆转初始无钙灌注所诱导的钙麻痹状态。逐步恢复钙浓度可使心肌细胞重建钙稳态并恢复收缩功能。跳过或加快此步骤将导致细胞过度收缩，并显著降低存活率。

系统性地排查故障对于成功分离成年心肌细胞至关重要，尤其是在应对组织消化和细胞活力方面的挑战时。组织消化不良（心脏未能软化）通常是由于胶原酶保存不当或过期导致酶活性下降所致，此时需要重新配制新鲜的酶液。灌流效率低下也可能阻碍酶的均匀输送，这常由气泡存在或血液清除不完全引起，应仔细检查并排除。相反，当消化看似充分（心脏已软化），但有活.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿	喷射生物过滤	TCD000100
100 μm细胞滤筛	Corning	431752
15 mL 离心管	喷射生物过滤	CFT011150
50 mL 离心管	喷射生物过滤	CFT011500
60 mm 细胞培养皿	喷射生物过滤	TCD100060
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A1470
胶原酶II	Sigma-Aldrich	C6885
胶原酶IV	Sigma-Aldrich	C5138
弯头止血钳	RWD生命科学	F22003-10
弯头剪刀	RWD生命科学	S12001-09
精细剪刀	RWD生命科学	S12000-09
镊子	RWD生命科学	F13014-12
留置导管（26G）	Becton, Dickinson and Company	381312
胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS）	MedChemExpress	HY-150287
异氟烷	RWD生命科学	R510-22-10
层粘连蛋白（小鼠）	赛默飞世尔科技	23017015
脂质浓缩物（化学成分明确）	MedChemExpress	HY-K3019
M199 培养基	Sigma-Aldrich	M4530
青霉素-链霉素	MedChemExpress	HY-K1006
蛋白酶XIV	Sigma-Aldrich	P5147
灭菌指示胶带	明尼苏达矿业及制造公司（3M）	CT060934701
注射泵（ISPLab01）	保定申辰精密泵	SC-49464A