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一种传统中药方剂对肠道重组腺相关病毒吸收的增强作用

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DOI：

10.3791/70413

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2026年4月24日

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1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种建立外翻肠囊模型的实验方案，用于评估中药（TCM）与重组腺相关病毒（rAAV）在肠道吸收过程中的相互作用，为优化口服基因递送策略提供一种离体（ex vivo）研究平台。

摘要

口服重组腺相关病毒（rAAV）递送具有重要的治疗潜力，但受限于肠道吸收效率低下。传统中药（TCM）在口服制剂中广泛应用，是潜在吸收促进剂的重要来源。然而，其对rAAV摄取与转导的影响仍 largely 未被探索。外翻肠囊模型可提供一种定量方法 离体 用于研究这些相互作用的平台。本文介绍了一种利用外翻肠囊模型的详细方案，可在受控实验条件下定量评估腺相关病毒（rAAV）穿越肠上皮的转运及其在肠组织内的基因转导。关键步骤包括从小鼠等实验动物获取小肠节段，将肠段外翻形成肠囊，并向每个肠囊内填充含氧缓冲液。将外翻肠囊浸入含有rAAV颗粒的含氧缓冲液中，在37 °C下孵育，以实现肠腔暴露和载体转运。终点分析包括取样肠囊内部（浆膜侧）液体，检测穿过上皮的rAAV颗粒，并分析肠囊组织中的外源基因表达，以评估转导效率。通过检测多个肠段区域，该方案可揭示不同肠段在rAAV摄取方面的差异。此外，在孵育过程中加入经典中药复方葛根芩连汤（GZNG），可评估其对载体摄取和转导的影响。外翻肠囊法为筛选rAAV血清型、递送增强剂以及rAAV载体与中药成分之间的相互作用提供了有价值的平台。其操作简便且可平行化的特点，也适用于临床前研究中的高通量筛选。

引言

重组腺相关病毒（rAAV）是一种具有前景的全身性基因治疗载体平台，目前主要探索三种递送途径：静脉注射1，腹腔注射2，以及口服给药3尽管静脉和腹腔注射途径已被广泛研究，但作为非侵入性给药方式的口服给药仍相对缺乏探索。口服重组腺相关病毒（rAAV）递送的可行性最早由Xin等人证实。4，报道了口服rAAV2后成功转导肠道黏膜并诱导产生抗HIV免疫反应。类似地，Hara等3,5，证明了口服rAAV/Aβ可转导胃肠道黏膜并减少脑内淀粉样蛋白沉积，而Steel等人6 发现口服疫苗在生存率和抗肿瘤免疫方面优于肌肉注射。同一项研究报道，rAAV6 比 rAAV5 具有更强的肠道趋向性。除疫苗应用外，该载体在其他疾病模型中也已展现出治疗潜力。Ma 等人7 和郝等人8 黄等人证明，口服rAAV分别在胃肠道转导后导致肝脏的肿瘤抑制和胃的抗纤维化治疗。9 鉴定出经改造的血清型Rec2在口服给药后可选择性转导棕色脂肪组织，而静脉给药则主要表现出对肝脏的趋向性10尽管这些开创性发现具有重要意义，但关于口服重组腺相关病毒（rAAV）递送的研究仍然有限，部分原因在于缺乏 体外 大规模评估的筛选系统

由 Wilson 和 Wiseman 于 1954 年建立的外翻肠囊模型11，至今仍是一种研究肠道药物吸收机制的重要体外平台。与其他吸收模拟装置不同，该系统独特地涵盖了除简单被动扩散之外的多种生理过程12。这一特性使其在研究中药13时尤为有利。利用该系统，已有文献报道中药成分常在胃肠道不同节段表现出区段依赖性的肠道吸收模式。例如，一项研究表明，五味清浊散中的多种生物碱在不同肠段选择性吸收，其中空肠和回肠的摄取活性最高14。此外，中药成分的联合给药可调节肠道吸收。Liao 等人15报道，与白芷提取物合用可显著增强葛根素的肠道吸收，凸显了中药成分相互作用对节段性吸收的影响。因此，外翻肠囊模型是阐明中药制剂及其他药物复杂吸收行为与协同作用机制的理想工具。

选择合适的模型用于rAAV吸收研究需要全面权衡生理准确性、技术复杂性和通量之间的利弊。下表总结了用于研究肠道吸收的主要实验模型。

本研究提供了概念验证，证明外翻肠囊模型可用于研究重组腺相关病毒（rAAV）载体的肠道吸收。该方法为中药复方（TCM）共给药如何影响rAAV载体的肠道吸收提供了有价值的见解，强调了在生理相关条件下进一步表征其机制相互作用的必要性。通过该方法优化中药增强的口服递送策略，可能促进非侵入性rAAV治疗药物的开发，从而提高患者的依从性和治疗可及性。

研究人员应根据以下标准评估外翻肠囊模型，以确保其符合实验目标。该模型的适用范围包括血清型的快速筛选、佐剂/增强剂的评价以及区域动力学研究，而不适用的情况和局限性则包括长期表达研究（>48 h）和系统药理学研究。

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方案

所有动物实验均严格遵循海军军医大学动物伦理委员会批准的指南（批准号 CHEC (A.E)-2025011）。

1. 配制台氏液和病毒溶液

  1. 台氏液预处理：
    1. 准备两份500 mL的台氏液（pH 7.4）（见材料表）。
    2. 将其中一份冷却至4 ℃，另一份加热至37 °C。
    3. 分别用95% O₂/5% CO₂气体饱和每份溶液。
  2. 病毒溶液制备：
    1. 将重组AAV9-CMV-EGFP加入37 °C的台氏液中，使其终浓度为1 × 1011 vg/mL（对照条件）。
    2. 实验组中，在AAV9-CMV-EGFP溶液中加入溶于溶剂的中药复方GZNG（表2），终浓度为200 mg/mL。
    3. 仅GZNG对照组：在不含AAV9-CMV-EGFP的台氏液中加入GZNG（200 mg/mL）。
      注意：病毒稀释液需在使用前即刻配制，以保持其感染活性。GZNG溶液的pH值约为5.0–6.0。

2. 动物准备与肠道组织采集

  1. 禁食：手术前24小时对8周龄的Sprague–Dawley大鼠进行禁食。在此期间保证自由饮水，以维持水合状态。
    注意：禁食有助于减少肠道内容物，确保在肠道吸收测量期间获得准确结果 离体 实验。
  2. 在禁食前检查动物健康状况，确保其处于良好状态。出现痛苦或疾病迹象的动物应排除在研究之外。
  3. 腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）以诱导深度麻醉。通过检查动物是否无反射反应且呼吸平稳，确认其已完全麻醉。
    警告：戊巴比妥是一种危险的管制药品；操作时须佩戴手套和个体防护装备，在通风橱中进行，以避免皮肤接触或吸入，并遵循机构规定的安全处置和应急处理指南。
  4. 在确认深度麻醉后，通过颈椎脱位法实施安乐死。
  5. 用75%乙醇擦拭腹部和胸部区域，以消毒皮肤并减少手术过程中的微生物污染。
  6. 使用无菌手术剪沿腹部区域做正中切口，以暴露腹膜腔。
  7. 轻柔分离并暴露胃和肠。操作过程中使用无菌铺巾保护周围组织和器官。
  8. 小心切开幽门括约肌，将胃与近端十二指肠分离。确保十二指肠保持完整，以供后续操作使用。
  9. 在直肠-肛门交界处解剖远端结肠，避免损伤周围组织。
  10. 使用精细镊子或剪刀轻轻分离小肠的肠系膜附着部分。注意避免牵拉或撕裂肠系膜。
  11. 立即将完整的肠道转移至冰浴的充氧Krebs-Ringer缓冲液（Tyrode溶液，4 °C）中。

3. 离体 外翻肠囊制备

  1. 按如下方式选取肠段：取距幽门远端10 cm处的8 cm肠段，定为十二指肠段。
  2. 从十二指肠段远端起始16 cm处开始，采集一段8 cm的空肠段。
  3. 从空肠段再向远端延伸16 cm处开始，获取一段8 cm的回肠段。
  4. 对于结肠，采集距盲肠盲端近端5 cm处的一段8 cm肠段。
    注意：确保组织具有弹性且完整，适合在制备过程中进行翻转。
  5. 使用装有冰冷、充氧Tyrode's溶液的2 mL注射器冲洗肠腔。
  6. 根据机构的生物危害废物处理规程处置流出液，以维持无菌状态并防止污染。
    警告：处理生物废物时应佩戴手套和适当的防护装备，避免接触潜在感染性物质。所有生物废物和流出液均须按照机构的生物安全指南进行处置，防止环境污染。
  7. 将肠段近端套入一根4 mm抛光玻璃棒上。确保玻璃棒表面光滑，以防黏膜撕裂。
  8. 用2-0丝线结扎肠段远端，将组织固定在玻璃棒上。确认组织在翻转过程中保持稳定。
  9. 通过沿玻璃棒轻轻滑动组织，轻柔地将肠段翻转，直至完全暴露黏膜面。避免过度拉伸或扭转，以保持组织完整性。
  10. 向肠腔内注入2 mL冰冷的Tyrode's溶液，检查是否泄漏。可接受的泄漏量应在1分钟内<5%。若发现泄漏，应调整缝线并确认黏膜面完全翻转。
    注意：应在低温环境中进行翻转操作，以最大限度减少酶降解并保持组织活性。
  11. 将一段5 cm长、直径3 mm的玻璃毛细管插入翻转肠段的开口端，作为灌流入口。轻柔推进导管，避免造成黏膜撕裂。
  12. 使用2-0丝线固定导管。确保导管位置固定，不发生塌陷或阻碍液体流动。
  13. 对缝线施加轻柔张力，以维持肠囊的正常形态。防止弯曲或扭曲，因为这些情况可能干扰灌流并影响吸收结果。
  14. 避免过度收紧，以免损伤组织或使肠囊变形。在整个实验过程中保持张力均匀。定期检查翻转肠囊是否存在泄漏或结构损伤。若泄漏超过5%，应在继续实验前修复或更换肠段。

4. AAV 转导与孵育

  1. 将每个翻转的肠囊放入含有4 mL 37 °C 氧合Tyrode's溶液的7 mL锥形管中。
  2. 加入病毒溶液，分组如下：对照组：仅加入AAV9-CMV-EGFP；实验组：AAV9-CMV-EGFP + GZNG。
  3. 在37 °C静置孵育2小时，期间持续向溶液中通入95% O2/5% CO2气体混合物。

5. 取样、终点处理与分析

  1. 时间过程取样
    1. 使用校准的微量注射器在 0、30、60、90 和 120 分钟时从每个肠段中抽取 50 µL 浆膜液。确保取样准确，避免引入气泡。
    2. 立即用 50 µL 预热至 37 °C 的 Tyrode 溶液替换所抽取的液体，以维持渗透压平衡和内部体积。尽量缩短抽取与替换之间的时间，以保持实验条件的一致性。
      注意：使用微量注射器（例如 Hamilton 注射器）时，应保持无菌操作，并轻柔操作，防止损伤肠段膜。
    3. 在每个时间点迅速完成取样，以尽量减少对孵育环境的干扰。
  2. 病毒滴度测定
    1. 根据试剂盒说明书，使用市售的动物基因组 DNA 提取试剂盒从浆膜液中提取总 DNA。
    2. 通过 qPCR 对 rAAV 载体基因组拷贝数进行绝对定量。使用 SYBR Green 试剂盒及 ITR 引物，在标准 96 孔板中用热循环仪进行 qPCR 扩增，循环条件如下：初始变性：95°C 10 分钟；变性：95°C 15 秒；退火与延伸：60°C 1 分钟；共 40 个循环。
    3. 为定量基因组拷贝数，使用质粒 rAAV-CMVp-gfp 的系列稀释液（1 ng、0.1 ng 和 0.01 ng）生成标准曲线。利用这些稀释液的相应循环阈值（Ct 值）计算病毒基因组拷贝数。
    4. 利用标准曲线确定所收集浆膜液中的载体基因组拷贝数。结果以每 100 ng 提取 DNA 中的基因组拷贝数表示。
      注意：确保所有试剂和设备均无菌，防止 DNA 提取和 qPCR 分析过程中发生污染。设置适当的对照以验证 qPCR 准确性，包括无模板对照（NTC）和质粒标准品。
    5. 每个样本进行三次重复 qPCR，以确保结果的可重复性和可靠性。
  3. 终末组织处理
    1. 使用无菌移液器吸除每个肠段中残留的管腔液。操作轻柔，避免组织破裂。
    2. 用含 1% 青霉素–链霉素（P/S）的磷酸盐缓冲液（PBS）对每个肠段冲洗三次，以去除残留培养基、细菌和杂质。确保充分洗涤，为后续应用保持无菌状态。
    3. 使用无菌手术剪或刀片将肠组织切成 2 mm3（2 mm × 2 mm × 0.5 mm）的片段。保持片段大小均一，以保证孵育条件一致。
    4. 将组织片段置于 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1%（v/v）P/S 的 DMEM 培养基中，在 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 48 小时。孵育期间每 12 小时更换一次培养基。
      注意：此步骤可维持组织活性，支持实验后细胞恢复。切割和洗涤过程中应保持黏膜完整。进行三次完整的 PBS 洗涤，以清除碎片和微生物污染物。保持恒定温度（37 °C）和高湿度，以支持代谢活性和组织健康。
      警告：使用无菌工具操作组织片段，避免机械应力，以维持上皮完整性。
  4. 孵育后分析
    1. 分样 A（组织学分析）：
      1. 将组织样本在 4 °C 下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 24 小时，以保存细胞结构。
      2. 固定后，将组织包埋于 OCT 包埋剂中，并进行苏木精-伊红（H&E）染色，以评估组织完整性和形态。
        警告：多聚甲醛为有害固定剂，应在通风橱内操作，并佩戴适当个人防护装备。
    2. 分样 B（荧光分析与基因组定量）：
      1. 将剩余组织在液氮中速冻，并在 -80 °C 保存，待后续处理。
      2. 使用冷冻样本进行荧光显微镜观察，检测 EGFP 表达，评估转染效率或病毒摄取情况。
      3. 进行 DNA 提取，随后通过 qPCR 测定病毒基因组拷贝数或转基因表达水平。

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结果

本方案用于评估 AAV9 介导的基因递送在小肠不同节段的效率，以及 GZNG 处理对增强基因转移和表达的影响。观察到若干关键结果，既证明了该方案的成功应用，也揭示了在特定条件下可能出现的一些变异性。

通过组织学（H&E染色）和荧光（EGFP）分析对小肠（十二指肠、空肠、回肠和结肠）中AAV9介导的EGFP表达进行评估，结果显示所有检测组织均实现了成功转导（图1）。明场图像（图1A–D）表明这些组织结构完整，呈现正常的组织学结构。相应的荧光图像（图1E–H）显示所有区域均有清晰的EGFP表达，绿色荧光表明病毒递送和转导效果良好。这些结果表明AAV9载体在小肠组织转导中具有有效性。值得注意的是，rAAV介导的外源基因主要在肠腔内衬的肠上皮细胞中表达。该定位特征与AAV在肠道递送中的已知嗜性一致：早期一项口服AAV研究表明，外源基因可在...

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讨论

在本研究中，一种新型 体外 建立了一种通过改进经典外翻肠囊模型来评估肠道重组腺相关病毒（rAAV）吸收的方法。该方法可在受控条件下实现对小肠不同节段腺相关病毒（AAV）转导效率的特异性分析，并可用于评估中药复方（TCM）与rAAV之间的协同作用。本文讨论了该方法的关键步骤、常见问题及解决方案、方法改良、局限性，及其在基因治疗与药物递送领域的广泛应用前景。

关键实验步骤
在利用外翻肠囊模型进行重组腺相关病毒（rAAV）转导研究时，需特别关注若干对实验成功至关重要的技术环节。组织的选择与制备至关重要。应一致地获取肠段（例如，根据解剖标志确定长度的十二指肠、空肠、回肠或结肠），以确保结果的可重复性24。外翻操作本身是一个需要精细技术的关键步骤。使用润滑的玻璃棒或类似工具，将离体肠段小心地翻转至内侧朝外25。在此操作过程中，必须避免组织发生扭转或过度拉伸，因为粗暴操作可能导致显微撕裂或明显的黏膜破裂。同样重要的是在受控条件下的病毒感...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨向所有在本研究过程中提供宝贵讨论和技术支持的同事与合作者表示感谢。我们同时也感谢机构提供的支持，使本项工作得以顺利开展。本研究由国家自然科学基金资助（项目编号 #82474349，资助对象：CL）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMWISENT319-005-CL液体，含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红和丙酮酸钠
EGFP CDS 区域 qPCR 引物TSINGKEF: 5‘-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3’；R: 5‘-TGTCGGCCATGATATAGACG-3’
胎牛血清WISENT086-550优质，适用于原代细胞培养
青霉素-链霉素（P/S）WISENT450-201-EL该溶液含有 10,000 单位/mL 青霉素和 10,000 µg/mL 链霉素。
PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）TaKaRaRR036A
TaKaRa MiniBEST Universal RNA 提取试剂盒TaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401本产品适用于采用 SYBR Green 染料法的荧光定量实验，兼容多种实时荧光定量 PCR 仪器。
TSINGKE TSP202-200 Trelief  Hi-Pure 动物基因组 DNA 提取试剂盒TSINGKETSP202-200
Tyrode's 溶液源叶R20268-500ml主要成分为氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸盐、氯化钙、葡萄糖和 HEPES。

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