一种简化且稳健的原代人类子宫内膜上皮细胞分离与长期扩增方案

摘要

人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的原代培养在技术上具有挑战性。本方案结合使用混合酶消化法与ROCK抑制剂（Y-27632），可在维持上皮细胞特性的同时提高细胞存活率和扩增能力，为子宫内膜研究及再生医学应用提供了一个可靠的实验平台。

摘要

子宫内膜疾病（包括他莫昔芬相关性子宫内膜增生）的研究因缺乏可靠的模型而受到限制 体外 上皮模型。传统分离人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的方法通常效率低下、技术要求高且难以规模化。本文描述了一种简化的无饲养层培养方案，结合混合酶消化、红细胞裂解以及持续使用ROCK抑制剂（Y-27632），可高效分离并扩增原代HEECs。Y-27632的添加对于减轻解离诱导的细胞凋亡和增强早期细胞贴附至关重要。该方法支持连续传代，在至少3次传代中维持上皮细胞特性，细胞形态可在10次以上传代中保持稳定。通过Western blot和免疫荧光鉴定，证实细胞高表达角蛋白18（Cytokeratin 18）和E-钙黏蛋白（E-cadherin），在选择性培养条件下，波形蛋白（vimentin）阳性间质污染细胞逐步减少。该方法克服了关键技术局限，为子宫内膜研究中的机制探索、疾病建模、药物筛选及再生医学应用提供了可靠且可扩展的上皮细胞来源。该标准化操作流程可替代复杂的共培养系统，有助于更广泛地获取高质量的原代细胞模型。

引言

可靠的体外模型对于推进子宫内膜疾病的研究至关重要，尤其是与他莫昔芬（TAM）相关的疾病¹。尽管TAM被广泛用作乳腺癌的内分泌治疗药物，但其在子宫内膜中具有部分雌激素激动活性，显著增加了子宫内膜增生、息肉的发生率，并在某些情况下导致恶性转化²。目前对他莫昔芬相关子宫内膜病变的临床管理主要依赖孕激素治疗或手术干预，而这两种方法均存在明显局限性。孕激素治疗常伴随突破性出血和体重增加等不良反应，而手术干预可能造成不可逆的子宫内膜损伤并影响生育能力³。这些局限性凸显了建立稳健的上皮细胞模型的必要性，以支持机制研究并促进更优治疗策略的开发。然而，该领域的进展主要受限于获取高纯度、可扩增的人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的技术难题。

该领域的奠基性工作由 Arnold 等人（2001 年）报道，他们通过胶原酶消化和连续筛网过滤分离出间质细胞和上皮细胞群体，经免疫染色验证，纯度超过 98%⁴。尽管该方法取得了成功，但其依赖于单一酶消化，需要较长的处理时间，并依赖逐步过滤去除间质细胞和红细胞污染物，导致实验流程繁琐且难以标准化⁴。随后，Yokomizo 等人（2002 年）利用子宫切除标本建立了原代 HEEC 培养系统，采用与间质饲养细胞的....

方案

新鲜的子宫内膜组织样本取自浙江中医药大学附属第一医院患者手术切除的子宫息肉标本。所有操作均遵循浙江中医药大学附属第一医院医学伦理委员会批准的指南进行（方案编号：2025-KLS-569-01；批准日期：2025年9月14日）。原代人源样本的操作在II级生物安全柜中进行，并穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和眼部防护装置。所有酶类试剂的处理均遵守机构安全规定及《材料安全数据表》（MSDS）指南。

1. 组织获取

1. 从成年女性手术标本中采集新鲜的子宫内膜组织。将组织转移至含有10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌管中，PBS中添加3%青霉素/链霉素（P/S）。
   注意： 所有组织应在手术采集后24小时内完成处理。

2. 组织预处理

1. 将组织在洗涤液（表1）中振荡，连续洗涤两次，每次2分钟，以去除黏液和血凝块。
2. 用5 mL 75%乙醇短暂冲洗组织5秒，以消毒表面。
3. 立即将组织转移至20 mL洗涤液中，洗涤两次，每次5分钟，以去除残留的乙醇。
   注意：由于乙醇易燃，操作时应远离明火，并根据机构化学品安全指南处理含乙醇的废弃物。

结果

通过形态学、增殖能力和分子水平评估，证实了原代 HEEC 培养体系的成功建立，如图1所示。本方案结合混合酶消化、红细胞裂解和ROCK抑制剂，实现了从人子宫内膜组织中高效分离并稳定扩增上皮细胞。

形态学观察表明，Y-27632 在早期培养过程中具有关键作用。在最初 48 小时内使用 10 µM Y-27632 培养的 HEECs 能迅速贴壁，并于第 3 天形成具有典型铺路石样结构的紧密上皮细胞岛（图 2）。这些克隆在第 5 天至第 7 天持续扩展，最终形成融合的上皮细胞层。相比之下，未添加 Y-27632 的培养体系中细胞贴壁效果差、增殖缓慢，在整个观察期间未能形成有序的上皮细胞簇。该形态学差异得到了动力学增殖实验的支持（图 3），Y-27632 处理组细胞从第 3 天到第 9 天的光密度值显著更高，其中在早期培养建立阶段效应最为明显。

为了验证扩增细.......

讨论

建立可靠的 体外 人源子宫内膜上皮细胞（HEECs）模型对于研究子宫内膜生物学与病理学至关重要¹¹尽管已开发出多种 HEEC 分离方法，但大多数方法仍受限于技术复杂、效率低下以及扩增潜力有限^4,5许多实验方案还依赖饲养层，这会引入变异性并限制可扩展性¹²本研究通过提出一种简化的、可重复的方案，解决了长期存在的技术难题，实现了原代人子宫内膜上皮细胞（HEECs）的高效分离与稳定扩增。该方法的成功关键在于三个核心步骤的有序整合：采用混合酶消化法实现有效的组织解离，通过特异性红细胞裂解步骤提高初始纯度，随后在添加ROCK抑制剂Y-27632的培养基中进行培养。

该工作流程的效果在代表性结果中显而易见。添加Y-27632显著改善了细胞早期贴附和克隆形成能力（图2），经处理的培养物迅速形成界限清晰的上皮细胞岛，并呈现典型的铺路石样形态。相比之下，未添加Y-2763.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dispase	Solarbio	CAS:42613-33-2	用于 HEECs 的分离
胶原酶 I 型	Merck	SKU:SCR103	用于 HEECs 的分离
100 µm 孔径滤网	Solarbio	431752	用于 HEECs 的过滤
兔抗 CK18 抗体	abcam	ab133263	用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
兔抗 CDH1 抗体	abcam	ab40772	用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
兔抗 VIM 抗体	abcam	ab16700	用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
4% 多聚甲醛	solarbio	P0099	用于免疫荧光染色检测 HEECs 的分化标志物
CO2 培养箱	Thermo Scientific	42820906	用于细胞培养
离心机	Eppendorf	5404HN133048	细胞离心
100 mm 细胞培养皿	Corning	430167	用于细胞培养
50 ml 离心管	Corning	430829	用于细胞离心
1.5 ml 微量离心管	NEST	081722CK01	用于细胞消化
细胞筛	Solarbio	431752	细胞过滤
磷酸盐缓冲液	Tecono	20201033	洗涤液
DMEM	Gibco	8122622	中和培养基组分
青霉素/链霉素	Thermo Scientific	15140-122	抗生素
胎牛血清	Gibco	2556132P	中和培养基组分
0.05% 胰蛋白酶	Basalmedia	K431010	用于 HEECs  的解离
Y-27632	Solarbio	IY0040	ROCK 抑制剂
红细胞裂解缓冲液	Solarbio	R1010	裂解红细胞
1% Triton X-100	Thermo Scientific	HFH10	细胞膜通透化
驴抗兔 IgG 抗体	Thermo Scientific	A32790TR	二抗
DAPI	Thermo Scientific	62248	DNA 染色
1 × PBST	Solarbio	P1031	洗涤缓冲液
原代 HEECs 专用培养基	iCell	iCell-f004-002h	用于 HEECs 培养
倒置共聚焦显微镜	Zeiss	LSM880	用于获取免疫荧光图像；配备 40x 物镜
MRC-5 细胞系	iCell	iCell-h146	人子宫内膜腺癌细胞系；经 STR 鉴定
Ishikawa 细胞系	iCell	iCell-h113	人子宫内膜腺癌细胞系；经 STR 鉴定