一种简化且稳健的方案，用于分离和长期扩增原发人类子宫内膜上皮细胞

摘要

人类子宫内膜上皮细胞（HEEC）的初级培养在技术上具有挑战性。该方案结合了混合酶消化与ROCK抑制剂（Y-27632），以提升细胞存活率和扩增率，同时保持上皮身份，为子宫内膜研究和再生应用提供了坚实的平台。

摘要

关于子宫内膜疾病（包括他莫昔芬相关子宫内膜增生）的研究因缺乏稳健的 体外 上皮模型而受限。传统的人类子宫内膜上皮细胞（HEEC）分离方法通常效率低下、技术要求高且扩展性差。本文描述了一种简化的无喂食方案，整合了混合酶消化、红细胞溶解和持续ROCK抑制剂（Y-27632）处理，以实现高效分离和扩增原发性HEEC。Y-27632的加入对于减轻解离诱导的凋亡和增强早期细胞粘附至关重要。该方法支持连续通道，同时至少保持3段上皮性，10段以上的形态特征得以保留。通过Western印迹和免疫荧光法鉴定，细胞角蛋白18和E-钙切蛋白表达较高，且在选择培养条件下，维黄素阳性基质污染物逐渐减少。通过解决关键技术限制，该方法为机理性研究、疾病建模、药物筛查及子宫内膜再生应用提供了可靠且可扩展的上皮细胞来源。标准化的工作流程为复杂共培养系统提供了替代方案，促进了更广泛的高质量原细胞模型的获取。

引言

可靠的 体外模型 对于推进子宫内膜疾病研究至关重要，尤其是与他莫昔芬（TAM）^相关的疾病。尽管TAM广泛用于乳腺癌的内分泌治疗，但其在子宫内膜中的部分雌激素-激动活性显著增加子宫内膜增生、息肉，以及在某些情况下的恶性转化的发生^率。目前他莫昔芬相关子宫内膜病理的临床管理主要依赖孕酮治疗或手术干预，但这两种方法都有显著局限性。孕酮治疗常伴有突破性出血和体重增加等不良反应，而手术治疗则可能导致不可逆的子宫内膜损伤并影响生育能力^。这些局限性凸显了建立稳健的上皮模型的必要性，以支持机制性研究并有助于改进治疗策略的发展。然而，该领域的进展主要受限于获得高纯度、可扩展的人类子宫内膜上皮细胞（HEEC）的技术挑战。

Arnold等人（2001）报道了该领域的基础性工作，他们通过胶原酶消化和顺序筛过滤分离了基质和上皮细胞群体，通过免疫染色4确认其纯度超过98%。尽管取得了成功，该方法依赖单酶消化，需要长时间处理，且依赖分阶段过滤去除基质和红细胞污染物，使得工作流程劳动密集且^{难以标准化}。随后，Yokomizo等人（2002）通过三维共培养与基质^喂养细胞建立了从子宫切除标本中建立的初级HEEC培养系统5。虽然基于馈源的微环境部分支持上皮生长，但该系统仅允许有限的通道通过，通常不超过五条通道，这限制了其在需要大规模稳定上皮扩张的应用中的实用^性。

为克服这些限制，开发了一套简化且高度可重复的HEEC分离和长期培养方案。基于先前研究证明ROCK抑制剂Y-27632显著提升人类角质细胞、龈上皮细胞和乳腺上皮细胞的初级培养效率，同样的原理也应用于子宫内膜组织^6,7,8。该方法包含三个关键特征：混合酶消化以促进高效组织解离;作为减少早期污染并促进上皮附着的关键红细胞溶解步骤;以及持续补充Y-27632以抑制凋亡、支持粘附和增强增殖能力。采用此策略，HEECs可以在保持上皮形态和高表达的CK18和E-cadherin ^9,10的同时扩展到多个通道。值得注意的是，连续传代至少3代未出现可检测的表型漂移，显示了培养系统的稳定性和可扩展性。

该方法直接解决了初级HEEC培养长期存在的技术挑战，包括高组织输入需求、复杂的工作流程、低重复性以及有限的扩增潜力。通过在整个排代过程中保持上皮身份和功能特征，该方案为子宫内膜再生、病理生理学、高通量药物筛选及细胞-生物材料相互作用等研究提供了可靠的平台。通过将组织处理与序列扩展相结合，这一标准化工作流程解决了生殖生物学中长期存在的瓶颈，支持未来在组织工程、再生医学和个性化治疗中的应用。

该方案要求采集新鲜组织样本，最好在采集后24小时内进行处理。细胞产量和生长特性可能因组织来源而异，例如子宫内膜息肉与正常子宫内膜。常见的失败原因包括组织消化不完整、红细胞污染过多或Y-27632补充不足。虽然该系统支持多段通道的扩增，但为了在延长培养过程中保持表型稳定性，可能需要进一步优化。

方案

从浙江中国医科大学第一附属医院通过手术切除的患者子宫息肉样本中采集了新鲜的子宫内膜组织样本。所有手术均按照浙江中国医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准的指导方针（协议号2025-KLS-569-01;2025年9月14日批准）进行。初级人体样本的处理在二级生物安全柜中进行，使用适当的个人防护装备，包括实验室外套、手套和眼部防护。所有酶试剂均按照机构安全法规和材料安全数据表（MSDS）指南进行处理。

1. 组织获取

1. 从成年女性的手术标本中采集新鲜的子宫内膜组织。将组织转移到含有10毫升磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）并补充3%青霉素/链霉素（P/S）的无菌管中。
   注意：所有组织应在手术采集后24小时内完成处理。

2. 组织预处理

1. 在洗涤液中搅动组织（见表1），连续两次，每次2分钟，以去除粘液和血栓。
2. 用5毫升75%乙醇短暂冲洗组织5秒，消毒表面。
3. 立即将组织转移到20毫升洗涤液中，进行两次洗涤，每次5分钟，以去除残留的乙醇。
   注意：由于乙醇易燃，请按照机构化学品安全指南，远离明火并处理含乙醇废物。

3. 组织消化与细胞采集

1. 组织切碎
   1. 用两片无菌刀片剁碎子宫内膜组织，直到能通过1毫升移液管尖端抽取碎片（~2 mm³）（约10分钟）。
   2. 将切碎的组织转移到50毫升离心管中。
2. 酶促消化
   1. 向装有组织片段的管子加入10毫升消化液（见表1）。
   2. 将管子浸泡在37摄氏度的水浴中30分钟。每15分钟轻轻摇晃管子，促进消化。
   3. 继续培养，直到组织碎片明显解离，溶液因释放细胞而显浑浊。
3. 消化终止
   1. 加入10毫升中和溶液以终止酶促消化。
   2. 使用设定为800微升的P1000移液器上下移液约15次，彻底混合。
4. 过滤与离心
   1. 通过100微米网状过滤器过滤消化后的悬浮液。
   2. 离心机在156 ×克 ，温度25°C，离心5分钟。
5. 红细胞（RBC）裂解
   1. 小心抽取上清液，不要扰动沉淀。
   2. 将细胞沉淀重新悬浮于2毫升预冷却红细胞溶解缓冲液中。
   3. 在冰上（约4摄氏度）孵育3–5分钟，轻轻搅拌。
6. 溶解终止
   1. 加入≥10毫升PBS或全培养基以停止裂解反应。
   2. 离心机在156 ×克 ，25°C下5分钟。

4. 初级文化的启动

1. 洗涤与离心
   1. 小心抽取上清液，不要扰动沉淀。
   2. 将沉淀重新悬浮在20毫升中和溶液中。
   3. 通过移液法混合约15次。
   4. 离心机在156 ×克 ，温度25°C，离心5分钟。
2. 休养与播种
   1. 抽吸上清液。
   2. 用1毫升移液器缓慢上下移液8–10次，轻柔地将细胞沉淀重新悬浮于含10微米Y-27632的初始培养基中。
   3. 将细胞悬浮液镀入100毫米培养皿中。
      注意：为了获得最佳初始播种密度，请根据估计的细胞产量选择培养容器。如果预期产率是10个⁶ 格电池×>1，使用100毫米的碟子;若产量较低，则使用60毫米的碟子。相应地调整培养基体积（例如，100毫米碟为10毫升;60毫米碟为4毫升）。
3. 培养条件
   1. 将盘子置于含5%二氧化碳的加湿环境中，温度为37°_C。
   2. 每3天更换为无Y-27632的新鲜上皮培养基。
      注意：监测细胞附着和形态;一旦细胞开始增殖，每两天更新培养基。

5. 细胞传递

1. 胰蛋白酶化的准备
   1. 当培养物达到80%–90%的汇合度时，将100毫米的培养皿从孵育箱中取出。
   2. 丢弃已用过的介质。
   3. 用2毫升PBS冲洗细胞两次。
   4. 仔细抽取并清除残留的PBS。
2. 胰蛋白酶化
   1. 在盘中加入2毫升0.05%胰蛋白酶。
   2. 轻轻旋转，确保细胞层均匀覆盖。
   3. 在37°C下孵育7分钟。
   4. 用显微镜（40倍物镜）检查细胞以确认脱离。
3. 中和与收集
   1. 加入8毫升中和液以阻止胰蛋白酶消化。
   2. 将细胞悬浮液转移到15毫升离心管上。
   3. 移液器约15次以获得单细胞悬浮液。
   4. 离心机在156 ×克 ，25°C下5分钟。
4. 重新休养与重新播种
   1. 在不扰动沉淀的情况下抽取上清液。
   2. 用1毫升移液器上下移液约10次，轻柔地将细胞沉淀重新悬浮于10毫升的上皮细胞培养基中。
   3. 将1×10个⁶ 个细胞，在10毫升上皮细胞培养基中播种到一个新的100毫米盘中。
   4. 调整播种密度，促进次日形成孤立、均匀分布的单细胞或小簇，避免过度拥挤。
5. 航行后维护
   1. 在标准培养条件下（37°C，5%_CO2）孵育。
   2. 定期观察培养过程，每两天更换一次上皮细胞培养基。
      注意：细胞通常在获得健康、粘附且汇聚度≥80%的单层后，即可准备下游应用。
      注意：所有接触初级人类细胞的材料均被视为潜在生物危害。在处置或进一步加工前，这些材料采用10%漂白剂消毒，符合机构生物安全指南。

结果

如 图1所述，通过形态学、增殖和分子评估确认了初级HEEC培养系统的成功建立。通过结合混合酶消化、红细胞溶解和ROCK抑制剂，该方案实现了从人类子宫内膜组织中高效分离并稳定扩增上皮细胞。

形态学观察表明Y-27632在早期培养过程中起到了关键作用。用10 μM Y-27632培养的HEEC在前48小时迅速附着，并在第3天形成具有经典鹅卵石图案的连贯上皮岛（见图2）。这些菌落在第5天和第7天稳步扩展，最终形成汇聚的上皮层。相比之下，未携带Y-27632的培养物表现出附着不良、增殖缓慢，且在整个观察期内未能形成有组织的上皮簇。这些形态差异得到了动力学增殖测定（见图3）的支持，其中Y-27632处理的细胞在第3天至第9天的光学密度显著提高，且最显著的效应出现在早期培养建立阶段。

为验证扩张...

讨论

建立可靠的人体子宫内膜上皮细胞（HEEC）体外模型对于研究子宫内膜生物学和病理学^{至关重要。}尽管已有多种HEEC隔离方法被开发，但大多数仍受限于技术复杂性、低效率和膨^{胀势受限。}许多协议还依赖馈线层，这带来了变异性并阻碍了可扩展性¹².本研究通过提出一种简化且可重复的方案，解决了长期存在的挑战，实现了主要HEECS的高效分离和稳定扩展。该方法的成功源于三个关键组成部分的顺序整合：混合酶消化以有效解离组织，专门进行红细胞溶解步骤以提升初始纯度，随后培养基中补充ROCK抑制剂Y-27632。

这一工作流程的影响体现在代表性结果中。加入Y-27632显著改善了早期细胞附着和菌落形成（见图2），处理后的培养物迅速形成明显的上皮岛，并展现出典型的鹅卵石形态。相比之下，未检测Y-27632的培养物表现出...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
散开	太阳生物	CAS：42613-33-2	对于HEECs的隔离
胶原酶I型	默克	SKU：SCR103	对于HEECs的隔离
100 和微型;M 网格过滤器	太阳生物	431752	对于HEEC过滤
兔子反CK18	ABCAM	AB133263	用于免疫荧光染色以检测HEECs的分化标记
兔子抗CDH1	ABCAM	AB40772	用于免疫荧光染色以检测HEECs的分化标记
兔子反VIM	ABCAM	AB16700	用于免疫荧光染色以检测HEECs的分化标记
4% 对甲醛	索拉比奥	P0099	用于免疫荧光染色以检测HEECs的分化标记
二氧化碳孵化器	热力科学	42820906	用于细胞孵育
离心机	埃彭多夫	5404HN133048	细胞离心机
100毫米细胞培养皿	科宁	430167	对于细胞培养
50毫升离心管	科宁	430829	对于细胞离心
1.5毫升微离心机管	NEST	081722CK01	用于细胞消化
细胞过滤器	太阳生物	431752	细胞过滤
磷酸盐缓冲溶液	特科诺	20201033	洗涤液
DMEM	吉布科	8122622	中和介质的组成部分
青霉素/链霉素	热力科学	15140-122	抗生素
胎牛血清	吉布科	2556132P	中和介质的组成部分
0.05% 胰蛋白酶	巴萨尔梅迪亚	K431010	关于HEECs 解离
Y-27632	太阳生物	IY0040	ROCK抑制剂
红细胞溶解缓冲液	太阳生物	R1010	红细胞裂解
1% 特里顿 X-100	热力科学	HFH10	膜渗透
驴抗兔IgG	热力科学	A32790TR	二级抗体
达皮	热力科学	62248	DNA染色
1 台 PBST	太阳生物	P1031	洗涤缓冲器
主HEEC专用介质	iCell	iCell-f004-002h	对于HEECs的文化
倒置共焦点显微镜	蔡司	LSM880	用于获取免疫荧光图像;配备40X变速箱
MRC-5细胞系	iCell	iCell-h146	人类子宫内膜腺癌细胞系;STR画像。
石川细胞系	iCell	iCell-h113	人类子宫内膜腺癌细胞系;STR画像。