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评估完整再生斑马鱼心室的代谢活性 离体 使用细胞外通量分析法

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DOI：

10.3791/70459

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2026年4月17日

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1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

本文内容

摘要

本文中，我们描述了一种用于定量测定氧消耗率和细胞外酸化率的详细方案 离体 成年斑马鱼心室，以表征其氧化代谢和糖酵解代谢能力。

摘要

斑马鱼在成年期全程具备心脏再生能力，部分归因于其代谢适应性。尽管此前有假说认为斑马鱼心脏主要依赖糖酵解，但近期研究揭示了更为复杂的代谢特征，其中氧化代谢是心肌细胞重新分化及成功完成晚期心脏再生的关键组成部分。2025年，我们采用了一种高通量方法来评估完整斑马鱼心室的代谢谱型 离体 利用Seahorse检测法（细胞外通量检测）。该方法可通过Seahorse XFe24分析仪上的XF线粒体应激测试，快速、实时地评估基础和最大氧消耗率（OCR）以及细胞外酸化率（ECAR）。本文中，我们描述了一种对完整斑马鱼心室进行细胞外通量分析的详细方案。该技术能够在活体完整心脏中定量测定OCR和ECAR 离体 将有助于阐明心脏在发育、疾病进展和再生关键时间点的代谢过程。

引言

与人类不同，斑马鱼（Danio rerio）在其整个成年生命周期中均保持再生缺失心肌组织的能力1。发生心脏损伤后，伤口边缘区域的心肌细胞会去分化并重新进入细胞周期2,3，以恢复心肌细胞数量4并重新填充损伤区域。近年来，心肌细胞再分化的再生过程重要性已得到认识5。这两个过程均受到斑马鱼心脏内代谢变化的严格调控，其中糖酵解促进细胞增殖6,7，而氧化磷酸化（OXPHOS）则促进再分化8。尽管在再生研究领域中，利用药理学和遗传学手段调控代谢已广泛应用6,7，但由于斑马鱼心脏体积微小，验证这些干预措施的代谢效应仍具挑战性，通常需要复杂的定制化插管装置9,10,11，或需合并多个心脏样本进行质谱分析12或核磁共振波谱检测8,13。

为了克服这些局限性，我们近期描述了使用 Seahorse XFe24 分析仪对完整斑马鱼心室进行高通量代谢谱分析的方法 离体8细胞外通量测定旨在测量细胞、胰岛及球状体的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。该测定利用固态传感器检测培养基中氧气和质子浓度（pH）的变化，分别反映呼吸电子传递链对氧气的利用以及糖酵解依赖性乳酸生成的情况。图1A)14.

细胞外通量分析可在96孔板（XFe96和XF Pro）、8孔微型板或多种规格的24孔板（XFe24）上进行。尽管96孔板具有较高的通量，但其传感器与孔底之间的工作距离不适合容纳完整的斑马鱼心室。此外，在96孔板的格式中，缺乏固定心室的装置 防止其在培养基中漂浮并干扰传感器。另一方面，XFe24胰岛捕获微孔板最初是为原代胰岛的代谢表征而设计的，因此允许将组织沉积在孔底部，并通过一层筛网（网格）固定。由于斑马鱼心脏体积较小，我们能够将胰岛捕获微孔板适配用于斑马鱼心室，心室在检测全程中均被固定于网格下方。

为了评估线粒体呼吸能力，我们采用了线粒体应激测试（Mito Stress test），该测试使用了四种电子传递链和三磷酸腺苷（ATP）合酶的抑制剂（图1A）。首先，获取基础状态下的耗氧率（OCR）测量值（图1B，品红色）。随后注入复合体V抑制剂寡霉素（oligomycin）。寡霉素抑制ATP合酶活性，从而导致OCR下降，该部分OCR与ATP生成相关（图1B，绿色）。剩余的耗氧量由解偶联呼吸和非线粒体耗氧组成（图1B，分别为橙色和灰色）15。在注入寡霉素之后，加入FCCP，其可消除线粒体膜上的质子梯度（图1A）。为恢复质子梯度，线粒体将耗氧量上调至其最大能力（图1B，蓝色）。最后，加入鱼藤酮（rotenone）和抗霉素A（antimycin A）的混合物，分别抑制复合体I和复合体III（图1A）。该药物组合因阻断了电子从复合体I和III向复合体IV的传递，导致线粒体呼吸链电子传递活动完全停止15。由此可测定非线粒体耗氧量（图1B，灰色）。

总体而言，利用胰岛捕获微孔板结合线粒体应激测试，我们能够快速且可重复地评估完整斑马鱼心室的氧化代谢和糖酵解代谢能力 离体我们将在下文详细介绍该操作的实验步骤。最后，我们展示了未受伤的野生型分离心室的存活情况 离体 在细胞外通量分析仪中进行检测，并在冷冻损伤后第14天（dpci）对转基因斑马鱼心室验证线粒体应激测试8.

方案

以下所述所有涉及动物的实验程序均符合英国修订的《1986年动物（科学实验程序）法案》以及欧洲《2010/63/EU指令》的要求，并已获得牛津大学动物护理与伦理审查中央委员会的批准。

注意：本实验方案使用 Seahorse XFe24 分析仪以及不含酚红和碳酸氢盐的 Seahorse DMEM 培养基进行。

1. 斑马鱼心脏冷冻损伤（可选）

  1. 在开始实验之前，从当地机构和国家主管部门获得适当的伦理批准。
  2. 按照先前描述的方法对斑马鱼心脏进行冷冻损伤处理16,17,18。

2. 水合传感器芯片

  1. 打开细胞外通量检测试剂盒，使用移液器向每个孔中加入500 µL校准液，加载24孔工具板（图2A）。
  2. 使用传感器 cartridge 和水合增强剂（hydro booster）封闭工具板（图2A）。
  3. 将 cartridge 与工具板置于37 °C湿润培养箱中过夜孵育（18–72 h）。整个孵育过程中保持传感器 cartridge 的盖子盖紧。

3. 药物溶液与培养基的制备

  1. 配制药物储备液：将寡霉素溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成10 mM浓度；将羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）溶于DMSO中，配制成5 mM浓度；将鱼藤酮溶于DMSO中，配制成10 mM浓度；将抗霉素A溶于乙醇中，配制成10 mM浓度；若不立即使用，储存于-20 °C。
    注意：建议每2–3个月重新配制一次寡霉素、鱼藤酮和抗霉素A的溶液，每次进行实验前均应重新配制FCCP溶液 。
  2. 用DMEM培养基稀释储备液，配制药物工作浓度（寡霉素500 µM、FCCP 300 µM、鱼藤酮/抗霉素A混合液各450 µM）。确保寡霉素的工作液体积为1.5 mL，FCCP为1.65 mL，鱼藤酮/抗霉素A为1.8 mL，以便可加载30个加药孔（每张试剂盒含24个抑制剂加样孔，另加每种药物6个额外孔以校正移液误差）。
    注意：鱼藤酮/抗霉素A溶液中可能出现少量沉淀，但充分混匀后可减少。请注意，3.2步骤中提到的浓度是药物注入孔板时最终浓度的10倍。
  3. 配制DMEM培养基（pH 7.4），使其含有10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨酰胺，配制后储存于-20 °C备用。

4. 启动细胞外通量分析仪

  1. 在检测前一晚通过侧面按钮打开分析仪，使其温度与环境达到平衡。
  2. 打开计算机并启动 Wave 软件。
  3. 在软件中选择 线粒体应激测试（Mito Stress test）。
  4. 在软件左下角关闭加热器，使分析仪内的温度降至 37 °C 以下，并接近斑马鱼饲养的标准温度 28–29 °C19。
  5. 在 分组定义 页面（位于 注射策略 选项卡下），通过从 化合物目录 中添加各端口将要注入的化合物来设置注射策略。对于线粒体应激测试，将寡霉素（oligomycin）加入 A 端口，FCCP 加入 B 端口，鱼藤酮/抗霉素（rotenone/antimycin）加入 C 端口。D 端口可额外添加一种药物，但本方案中不使用该端口。
  6. 定义实验策略后，删除 注射策略 选项卡下所有其他预设策略。在页面的 分组 侧指定实验组别（例如野生型和突变型），并指定各组将接受的注射策略（即步骤 4.5 中定义的策略）。确保各组之间的注射策略一致，并与所设计的注射策略匹配。
  7. 在 板图（Plate map）页面，通过点击每个组别，然后点击将要放置样本的孔，来指定每个样本在 24 孔板中的位置。
    1. 请注意，其中有四个孔不适合放置样本（图 2B），用作背景校正的空白孔。确保每组样本在板上均匀分布，以消除测量或环境条件中可能存在的位置偏差。
  8. 在 实验方案（protocol）页面，若未使用上述以外的其他抑制剂，则移除 对照或实验 选项卡，并确保软件中的端口与试剂盒上药物的位置相对应。
  9. 软件默认每种条件下自动设置 3 个混合、等待和测量循环。请将循环次数修改为：10 次基线（未处理）、3 次寡霉素、7 次 FCCP 和 9 次鱼藤酮/抗霉素 A 测量，以获得稳定的信号轨迹，并确保抑制剂对三维组织充分作用。确保每个循环包含 3 分钟混合、2 分钟等待和 3 分钟测量。

5. 分析仪校准

  1. 从加湿培养箱中取出微孔板和工具板（参见步骤 2.1–2.3）。
  2. 从微孔板上取下加湿增效器和盖子（图 2A），并将传感器微孔板放置在含有校准液的工具板上。
  3. 用移液器将抑制剂轻轻加入对应的加药孔中，移液枪头应接触孔壁，以确保液体平稳流入：在 A 孔加入 50 µL 寡霉素，在 B 孔加入 55 µL FCCP，在 C 孔加入 60 µL 鱼藤酮/抗霉素 A（图 2C）。
    1. 注意：液体仅靠孔口表面张力固定，因此从本步骤开始应避免剧烈移液或敲击微孔板。确保无液体进入传感器孔（图 2C），否则会损坏分析仪。
  4. 在软件上点击 开始运行，为本次运行命名并保存至计算机。此时分析仪的托盘将打开，以便放置微孔板和工具板。
  5. 根据托盘上的板图（左上角为 A1 孔），将载有药物的微孔板和含有校准液的工具板放入分析仪托盘中，并确保安装到位。在将工具板装入托盘前，需先移除其上的加湿增效器和盖子（图 2A），否则会损坏分析仪。
  6. 准备就绪后，通过点击 运行检测 指令软件开始实验。此时分析仪将收回已加载的托盘并启动校准程序。
  7. 开始心脏组织的分离（参见步骤 6.1–6.12）。校准过程大约持续 40 分钟，但工具板可在分析仪中保留更长时间，直至完成心脏组织的分离并将其放入胰岛捕获微孔板中（图 2B、D）。

6. 分离鱼心脏并将其加载到24孔胰岛板上

  1. 打开胰岛捕获微孔板，向24孔胰岛板中每孔加入500 µL DMEM培养基（含10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酰胺），置于室温下。
  2. 将所有网格放入盛有DMEM培养基的35 mm培养皿中，置于室温下，确保网格完全浸没且无大气泡。
  3. 另准备一个35 mm培养皿，加入DMEM培养基（含10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酰胺），置于室温下。该培养皿用于心脏取出后的冲洗，并分离心室与心房及动脉球。
  4. 使用5 g/L MS-222处死一条鱼，并检查其反射是否消失。
  5. 将鱼固定在92 mm培养皿中的海绵上，打开心腔，按先前所述方法解剖心脏16,20。
  6. 在盛有DMEM培养基（含10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酰胺）的35 mm培养皿中冲洗心脏，置于室温下。
  7. 在35 mm培养皿中使用镊子去除心房和动脉球。
  8. 轻轻摇动并挤压心室，使腔内血液排出。清洗心脏时避免损伤心室壁。
  9. 将心脏转移至胰岛捕获微孔板中指定的孔内，根据板图使其自然沉降至相应孔的中央位置。保持微孔板处于室温。所有心室均应纳入检测，即使其已无明显搏动。
  10. 对所有可用的鱼重复上述操作。若需比较不同实验组的代谢活性，建议每组依次各取一个心脏，而非先完成一组所有心脏的分离再进行下一组。尽管心脏在分析仪中可存活至少180分钟（图3A），但为确保各组心脏在培养基中暴露时间一致，推荐采用逐组单个心脏分离的最佳实践操作。
  11. 完成所有心脏的分离后（约20个心脏需60分钟），将心脏平置于胰岛捕获微孔板各孔底部（图2B），并使用细镊子将其调整至孔中央位置（图2D,E）。
  12. 使用镊子将网格覆盖于其上（约20分钟）（图2D）。确保网格方向正确（网面朝下贴近心脏），且无大气泡，以免干扰测量结果（图2E）。
    1. 网格放置到位后，用镊子从边缘轻轻按压，直至听到轻微的“咔”声，表示已固定。注意避免通过网格用镊子碰撞心脏。

7. 在分析仪上加载样本并获取测量数据

  1. 当心脏组织被置于胰岛捕获微孔板中后，检查软件是否已成功校准所有孔位，计算机屏幕上会以绿色对勾标记提示。此时按下 open tray 弹出工具板。
    注意：此时不会弹出 cartridge，仅会弹出含有校准液的工具板。
  2. 将工具板更换为载有样本的胰岛微孔板，并将其放置在分析仪托盘上。确保胰岛微孔板方向正确（A1 孔位于左上角），并已移除盖板。若未移除盖板，将损坏分析仪。
  3. 放置好胰岛微孔板后，点击 load cell plate 指令软件启动实验。在实验开始的大约前 10 分钟内，传感器将执行平衡步骤，随后开始测量。
  4. 实验完成后（约 4 小时），按下 eject cartridge 以打开托盘，同时弹出胰岛微孔板和 cartridge。
  5. 取出胰岛微孔板和 cartridge，然后点击 done 关闭托盘。此时可点击 view results 查看所采集的数据。
  6. 保存测量数据，从分析仪计算机导出数据，并上传至分析界面以进行进一步分析和处理。此操作将触发从分析仪中移除胰岛板和 cartridge 的流程。
  7. 从分析仪中取出胰岛板和 cartridge，并使用盖板将其封闭。
  8. 将胰岛板置于干冰上速冻，或从孔中取出心脏组织（参见步骤 8.2），若暂不立即进行蛋白分离归一化处理（步骤 8），则储存于 -20 °C 条件下。
  9. 数据保存完成后，关闭软件、分析仪及计算机。
  10. 将数据上传至分析界面，通过选择 standard views 选项中的 OCR 图表来可视化数据。在界面上可查看 OCR 及 ECAR 水平或速率，根据空孔进行背景校正，并通过点击板图选择需显示或隐藏的孔位。

8. 用于归一化的蛋白质分离与定量

  1. 通过将一片蛋白酶抑制剂片剂溶解于10 mL RIPA缓冲液中并充分混匀，制备含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法（RIPA）缓冲液。
  2. 如果尚未完成（步骤7.8），使用胰岛捕获筛插入工具（图2F）从胰岛板中取出网格以释放心脏。小心取出心脏，因为它们可能粘附在网格上。若出现此情况，使用镊子将其分离。如果无法使用筛插入工具移除网格，将培养板置于体视显微镜下，用显微解剖剪小心剪开网格以释放心脏。
  3. 将每个心室置于含有200 µL添加了蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液的1.5 mL离心管中，并置于冰上。
  4. 使用配备一次性研磨杵的匀浆器在冰上对心脏组织进行匀浆处理。
  5. 通过将提供的牛血清白蛋白（BSA）用RIPA缓冲液稀释，配制标准品溶液，浓度分别为：2000 µg/mL、1500 µg/mL、1000 µg/mL、750 µg/mL、500 µg/mL、250 µg/mL、125 µg/mL、25 µg/mL、0 µg/mL。
  6. 按照制造商说明配制Pierce BCA工作液（试剂A:试剂B = 50:1）。使用以下公式计算所需工作液体积：
    (标准品数量 + 样本数量) × 2 × 200 μL
    注：该体积可确保每个样本和标准品孔加入200 µL工作液，并实现每个样本和标准品的双复孔测定。
  7. 在96孔板中，每孔分别加入25 µL各标准品和各样本，每个设置两个复孔。
  8. 每孔加入200 µL工作液。
  9. 将96孔板置于37 °C孵育30分钟。
  10. 将板在室温下冷却10分钟，并使用板封膜密封。确保各孔中无气泡，以免影响酶标仪读数。若出现少量气泡，可用枪头或细镊子将其刺破。
  11. 使用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度。
  12. 根据标准品的吸光度绘制标准曲线，并计算各样本的蛋白浓度。
  13. 在分析界面的归一化标签页（图2G）中记录每个孔的蛋白浓度。

9. 数据分析

  1. 在根据蛋白质含量进行归一化后，通过图表右上角的云按钮将数据从分析界面导出为 Excel 或 Prism 文件，以便进一步分析。
  2. 利用归一化后的数据，通过计算基线测量值的平均值（排除前三个读数，因为初始信号可能不稳定）来确定基础氧耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。
  3. 利用归一化后的数据，通过计算FCCP处理组中最高的三个读数的平均值，来确定最大OCR和ECAR。

结果

该方案可实现对完整斑马鱼心室的OCR和ECAR的定量分析。我们验证了心室在该 离体 通过在无任何药物处理的条件下孵育未受伤的野生型KCL心室进行设置图3A）。数据表明，心室具有稳定的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），相较于空孔的基线测量值，这些参数在至少180分钟内显著升高（图3A）。这些数据表明，心室在此条件下表现出正常的呼吸功能和存活能力 离体 环境。

我们使用不同药物浓度和培养基配方进行了多次氧消耗率（OCR）测量，以确定心室的最佳给药剂量（图3B）。当采用以下组合时：[寡霉素] 10 µM、[FCCP] 8 µM 和 [鱼藤酮/抗霉素] 25 µM，观察到OCR倍数变化（FCCP/基础值）轻微升高；而使用[寡霉素] 50 µM、[FCCP] 30 µM 和 [鱼藤酮/抗霉素] 45 µM 时，OCR倍数变化升高更为明显（图3B）。因此，我们在后续实验中采用了后一组浓度。由于心室为三维结构，药物可能主要作用于组织外层细胞，而难以渗透至心室腔侧的细胞。为解决这一问题，我们进行了透化处理：在将心脏置于DMEM（含10 mM 半乳糖、1 mM 丙酮酸钠、4 mM 谷氨酰胺）中孵育前，先用0.5%皂苷处理30分钟。该处理导致OCR持续降低，并且在注射FCCP后未出现预期的OCR上升（图3C），提示心脏已发生代谢功能衰竭。因此，我们在后续实验中未对心室进行透化处理。

此外，我们在此展示了原始实验的标准化轨迹数据8。利用七种野生型斑马鱼品系在再生能力上的天然差异，我们发现细胞质苹果酸脱氢酶1Ab编码基因mdh1ab可通过心肌细胞的重新分化促进心脏再生。为验证这一发现，我们构建了心肌细胞特异性过表达mdh1ab的转基因斑马鱼（mdh1ab cOE）以及过表达绿色荧光蛋白的对照鱼（GFP cOE）。对这些鱼的心室进行冷冻损伤处理，并在损伤后14天（14 dpci）取样，采用线粒体应激测试（Mito Stress test）分析其代谢特征（图3D）。寡霉素处理未显著改变氧耗率（OCR），但观察到细胞外酸化率（ECAR）轻微上升。向培养基中加入FCCP后，OCR和ECAR均如预期上升，其中mdh1ab cOE样本保持最高的最大呼吸能力（图3D）。最后，使用鱼藤酮/抗霉素处理导致两组样本的代谢活动完全终止。总体而言，该方法使我们能够识别出mdh1ab过表达心室组织以及七种不同野生型斑马鱼品系之间在代谢能力上的显著差异8。

线粒体呼吸示意图、电子传递链过程、OCR 随时间变化的图表。
图 1： Mito Stress 检测期间的葡萄糖代谢。（A）葡萄糖代谢的示意图。葡萄糖通过 GLUT 转运蛋白进入细胞，并通过糖酵解转化为丙酮酸。乳酸脱氢酶（LDH）将丙酮酸转化为乳酸，产生的质子被分泌出细胞。丙酮酸转化为乙酰辅酶 A 并进入线粒体和三羧酸（TCA）循环，为线粒体内膜上的呼吸电子传递链提供能量。复合物 I、III 和 V 的抑制剂以及解偶联剂 FCCP 以红色标注。电子通过呼吸电子传递链的转移以蓝色箭头表示，最终导致氧气和质子转化为水。（B）Mito Stress 检测结果示意图。基础呼吸以品红色标注。注入寡霉素后，氧耗率（OCR）下降，从而可计算 ATP 偶联呼吸（绿色）以及质子漏（橙色）。FCCP 使 OCR 升高至细胞的最大呼吸能力（蓝色）。随后注入鱼藤酮和抗霉素 A，导致线粒体呼吸完全关闭，仅保留非线粒体呼吸（灰色）。请点击此处查看该图的放大版本。

多孔传感器盒装置；胰岛捕获微孔板；示意图；实验装置。
图2： 传感器盒与胰岛捕获微孔板布局。（A）盖子-传感器盒-液压增压器-功能板复合体（上图）和倒置的传感器盒（下图）的实物图。比例尺：1 cm。（B）装载了斑马鱼心室的胰岛捕获微孔板图像。红色圆圈标示未放置心室的空白孔，用于后续数据分析中的背景校正。比例尺：1 cm。（C）XFe24传感器盒中加药口布局的示意图。A口含有寡霉素，B口含有FCCP，C口含有鱼藤酮/抗霉素混合物。D口可保持空置，或加入额外药物。S表示传感器口，不应含有任何液体，以免损坏分析仪。（D）位于孔底部的斑马鱼心室代表性图像，左侧带网格，右侧无网格。比例尺：5 mm。（E）包含心室、网格（黄色）和传感器盒（绿色）的胰岛捕获微孔板的示意图横截面。P表示加药口，S表示传感器。波浪线代表培养基。（F）胰岛捕获筛网插入工具。比例尺：1 cm。（G）分析界面中的归一化标签图标。请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼心脏代谢率；OCR、ECAR 图谱；药物效应；皂苷通透性研究。
图 3： 斑马鱼心室代表性 OCR 与 ECAR 测量结果。（A）未受伤野生型斑马鱼心室（KCL 品系）的代表性 OCR 与 ECAR 曲线，未接受检测中所用抑制剂处理（n = 2，红线）。不含任何生物材料的空孔所获得的曲线以灰色表示（n = 4）；OCR：双因素重复测量方差分析，时间因素 P = 0.0200，时间 × 孔板交互作用 P = 0.0196，孔板因素 P < 0.0001，组别因素 P < 0.0001；ECAR：双因素重复测量方差分析，时间因素 P = 0.1323，时间 × 孔板交互作用 P = 0.0216，孔板因素 P = 0.0009，组别因素 P < 0.0001；数据以均值 ± 标准误表示。（B）不同药物浓度及培养基条件下 OCR 的倍数变化。采用单因素方差分析（P = 0.0032）结合 Tukey 多重比较检验。[O] 5 µM，[F] 4 µM，[RA] 2 µM，n = 6；[O] 10 µM，[F] 8 µM，[RA] 25 µM，n = 8；[O] 25 µM，[F] 16 µM，[RA] 45 µM，n = 8；[O] 50 µM，[F] 30 µM，[RA] 45 µM，n = 8；[O] 100 µM，[F] 60 µM，[RA] 90 µM，n = 8。O，寡霉素；F，FCCP；RA，鱼藤酮/抗霉素。（C）经皂苷处理通透化的心室（红色，n = 4）与未经处理心室（灰色，n = 4）的曲线比较；双因素重复测量方差分析，时间因素 P < 0.0001，时间 × 样本交互作用 P < 0.0001，处理因素 P < 0.0001，样本因素 P = 0.824；数据以均值 ± 标准误表示。经皂苷处理与未处理心室的 OCRmax 比较采用非配对 student's t 检验（P = 0.0850）。（D）mdh1ab cOE（红色，n = 8）与 GFP cOE（灰色，n = 8）14 天后心脏损伤修复期（14dpci）心室的代表性 OCR 与 ECAR 曲线。OCR：双因素重复测量方差分析，时间因素 P < 0.0001，时间 × 样本交互作用 P < 0.0001，基因型因素 P < 0.0001，样本因素 P = 0.1098；ECAR：双因素重复测量方差分析，时间因素 P < 0.0001，时间 × 样本交互作用 P = 0.7507，样本因素 P = 0.2154，基因型因素 P < 0.0001。数据改编自 Lekkos 等，20258，并以均值 ± 标准误表示。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文详细描述了利用Seahorse XFe24分析仪和Mito Stress测试对离体斑马鱼心室进行OCR和ECAR分析的实验方案。心肌细胞代谢在心脏再生过程中发挥着至关重要的作用21,22,23,24。然而，对再生斑马鱼心脏代谢表型的验证仍存在挑战，相关研究在多数发表文献中往往缺乏6,7。由于斑马鱼心脏体积较小，采用NMR波谱或质谱等技术通常需要合并多个心室样本才能获得足够的信号强度8,12,13。相比之下，本文所述方法可对多个独立的心室样本分别进行OCR和ECAR测量，从而提高统计效力。

传统的代谢谱分析方法（如代谢组学）仅能提供组织在采集瞬间的代谢谱快照。通过线粒体应激测试，我们能够实时获取心室如何应对各种代谢挑战的活体数据，包括其最大呼吸能力，而这些信息在使用其他方法时并不明显。为了实现斑马鱼心室的活体表型分析，研究人员曾尝试对斑马鱼心脏进行灌注9,10,11，但该方法需要复杂的定制设备和高度熟练的技术人员才能完成插管操作，且通量较低。本研究所用分析仪提供了一种更简便的替代方案，采用 commercially available 的设备，可实现高通量（每次20个心室）的心室表型分析。据我们所知，目前尚未有研究将本文所述方法与其他活体氧测定技术（如克拉克型电极）进行直接比较。

重要的是，我们所描述的方法可根据研究问题进行调整。该检测方法此前已被用于表征完整的斑马鱼胚胎25,26。除了本文所述的线粒体应激测试外，线粒体燃料灵活性测试也已优化，用于评估人源心肌组织切片的代谢燃料利用能力27。此外，细胞能量表型测试已被改进，用于表征墨西哥盲 cavefish（Astyanax mexicanus）心脏再生过程中的糖酵解能力28。我们预计该实验方案还可应用于其他三维结构，例如心脏类器官，并可用于验证基因扰动对未受损斑马鱼心脏代谢通路的影响。

我们认识到该技术存在一定的局限性。在技术挑战方面，心脏在分离后被置于室温下的DMEM培养基中处理，而未维持在斑马鱼最适温度28 °C19。将水温降低至18 °C可能对斑马鱼心脏的原位功能产生显著影响in situ29,30。然而，我们并不认为短期暴露于室温会对离体心室的生理状态产生显著影响，因为心室在被迅速转移至28 °C的分析仪后即可恢复。在我们的操作中，大多数心室在心房被解剖后即停止明显搏动，提示缺乏起搏刺激是导致不收缩的原因。此外，在分离过程中，培养基未进行氧合，可能导致轻度缺氧，但在首次测量前，当样本在分析仪中混合后，氧水平可恢复至正常状态。

关于心脏温度的另一个实际考虑因素涉及分析仪中的加热器被关闭，从而导致温度从37 °C降至28–29 °C。该分析仪无法将加热功率降低至所需温度。然而，当分析仪运行时，托盘内部的温度比室温高6–7 °C。此温度范围与斑马鱼饲养的最佳温度相符19。

该检测在大量斑马鱼心室上进行，因此无法区分不同细胞类型对观察到的 OCR 和 ECAR 变化所做出的贡献。在研究早期再生时间点的代谢速率时，这一限制可能尤为重要，因为此时大量涌入的免疫细胞31可能会掩盖心肌细胞的 OCR 变化。此外，心室腔内残留的血液也可能影响代谢读数。在肝素7存在下使心脏充分放血，或可进一步减少血细胞在心脏内凝集所造成的影响。为了增强所用抑制剂向心室内部细胞的扩散，我们尝试使用皂苷进行通透化处理。然而，皂苷通透化导致 OCR 在整个检测过程中持续下降，最终使心室发生呼吸衰竭。这些局限性可通过分离、培养和分析单个心肌细胞来避免，但该方法需要细胞长时间培养32，在再生环境中可能并非最优选择。

受损组织可能会影响所采用的归一化方法。在本研究中，我们使用BCA法将OCR归一化为每微克蛋白质每毫升（µg protein/mL）。尽管由于胶原蛋白富含羟脯氨酸和脯氨酸，导致BCA法对其反应较弱——这类成分在使用铜离子检测时信号较差——但伤口中其他无细胞成分的存在仍可能影响归一化结果。未来的研究可考虑采用总DNA33作为心室中活细胞数量的准确反映。

此外，我们未能重现由寡霉素依赖性抑制复合体V所预期引起的OCR降低15。尽管某些研究显示，寡霉素处理分离的心肌细胞可导致OCR下降32,34,35，但本文的数据更接近于最近一项关于分离的成年小鼠心肌细胞研究所报道的无反应现象36。由于我们使用的寡霉素浓度显著高于上述研究中报道的浓度，因此尚不清楚将终浓度提高至50 μM以上是否会产生影响。

最后，尽管耗氧量主要取决于呼吸作用，但细胞外酸化不仅由糖酵解产生的乳酸引起，还可能源于二氧化碳转化为碳酸的过程。已有报道称，在以葡萄糖为培养基的成肌细胞中，基础状态下的细胞外酸化约有三分之一来源于二氧化碳37。因此，若未对呼吸作用所导致的酸化比例进行校正，我们建议在解读Seahorse分析仪所得的ECAR测量结果时应保持谨慎38。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢尼克·豪（Nick Howe，安捷伦科技公司）和托马斯·尼科尔（Thomas Nicol，牛津大学）在本方法开发过程中提供的支持与关键性讨论。我们谨向牛津大学生物医学服务部一级动物设施（University of Oxford, Biomedical Services Unit）以及牛津大学发育与再生医学研究所（Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford）的工作人员致谢，感谢他们对斑马鱼的饲养与转运工作。本研究得到了英国医学研究理事会（Medical Research Council，项目编号 MR/W006731/1 至 KL）和费萨尔国王专科医院 & 研究中心（RA 的博士后奖学金）、惠康基金会机构战略支持基金（204826/Z/16/Z，授予 JSOM）、英国心脏基金会 IBSRF（FS//17/58/33072，授予 LCH）、欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（715895，CAVEHEART，ERC-2016-STG，授予 MTMM）、英国心脏基金会项目基金（PG/15/111/31939 和 PG/23/11189，授予 MTMM）。MTMM 还获得英国心脏基金会牛津研究中心卓越中心（RE/24/130024）和英国心脏基金会再生医学中心（RM/13/3/30159）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml Eppendorf管 StarlabS1615-5550
96孔板 ThermoFisherAB-0800
抗霉素AChemCruz sc-202467A
DMEM 培养基安捷伦1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
干冰 
乙醇Supelco1.00983.2500
细胞外通量检测试剂盒 安捷伦103518-100包装包含工具板、水力增压器、传感器盒和盖子（随胰岛板一起提供）
FCCPSigma-Aldrich C2920
葡萄糖安捷伦103577-100
谷氨酰胺安捷伦103579-100
培养箱
胰岛捕获微孔板安捷伦101122-100包装内含25个网格
胰岛捕获筛选插入工具安捷伦101135-100
显微解剖镊ideal-tek31317605-S 规格（需要 2 个，用于分离心室与动脉球及心房）
显微解剖剪FST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
寡霉素MP 151786
研钵电动匀浆器 VWR431-0100
研钵杵VWR431-0094
35 mm 培养皿Greiner Bio-One627102
92毫米培养皿Starstedt82.1473
Pierce BCA 法检测试剂盒赛默飞世尔科技23227
Pierce 蛋白酶和磷酸酶抑制剂迷你片剂，EDTA-free赛默飞世尔科技A32961
丙酮酸安捷伦103578-100
RIPA裂解缓冲液圣克鲁斯sc-364162
鱼藤酮MP 02150154-CF
Seahorse Analytics Agilent 间期安捷伦https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Seahorse XFe24 分析仪安捷伦https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
封固剂赛默飞世尔科技AB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
海绵做一个足够长且足够深的切口，以便将鱼腹侧朝上放入
Wave（版本 2.6.1.56）安捷伦https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF校准剂 安捷伦100840-000

参考文献

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Seahorse
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