一种来自Aconitum pendulum的生物活性成分通过调节PI3K/Akt通路减轻大鼠类风湿性关节炎相关炎症

摘要

采用网络药理学和分子对接技术，鉴定了A. pendulum中抗类风湿关节炎（RA）的活性成分。体内研究表明，二萜生物碱，尤其是斯米诺汀A，可通过PI3K/Akt通路缓解大鼠的RA症状。

摘要

在传统中医及多种民族医学实践中，Aconitum pendulum N. Busch 的根部常用于疏通经络、祛除风湿、活血化瘀及缓解关节疼痛。因此，这种药用植物已成为不同民族医学体系中治疗扭伤和风湿性疾病的重要药物。本研究通过体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，探讨了从 A. pendulum 中先前分离出的六种化合物改善类风湿关节炎（RA）相关炎症的作用机制。研究采用了多种技术手段，包括网络药理学、分子对接、酶联免疫吸附测定（ELISA）、苏木精-伊红（H&E）染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（q-PCR）以及蛋白质印迹（WB）。结果表明，六种化合物之一的smirnotine A可通过靶向PI3K/Akt信号通路并抑制炎症反应，从而缓解RA症状。这些发现为理解 A. pendulum 在治疗类风湿关节炎中的传统应用提供了物质基础与作用机制的科学依据。

引言

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征为滑膜炎症、滑膜衬里层增生、免疫细胞浸润、侵袭性血管翳组织形成以及随之而来的关节破坏^1,2,3。RA 全球患病率为 0.5%–1%，对公共卫生构成重大负担，并严重影响患者的生活质量^4,5,6,7。传统治疗药物——如甲氨蝶呤（MTX）、糖皮质激素、Janus 激酶（JAK）抑制剂和非甾体抗炎药（NSAIDs）——常因不良反应和患者疗效差异而受限，凸显了开发新型治疗方法的必要性⁸。

天然产物，特别是生物碱，在类风湿关节炎（RA）治疗中因其多靶点作用机制和良好的安全性而受到关注。小檗碱、青藤碱和苦参碱等生物碱可调节关键的炎症通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子κB（NF-κB）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）以及Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT），并下调肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介....

方案

50只无特定病原体（SPF）级雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180–200 g）由湖北省疾病预防控制中心（湖北省预防医学科学院）（中国武汉；动物使用许可证号：SCXK(JB) 2023-0005）提供。所有涉及动物的实验操作均严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（第8版，2011年）。本研究方案经天津杰尼科生物科技有限公司实验动物伦理委员会审查并批准（批准号：GENINK-20250074）。本研究中使用的主要试剂和设备列于随附的材料表中。

细胞培养
人源类风湿关节炎（RA）细胞系 MH7A 在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，并于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中维持培养¹⁷。

动物与处理
动物饲养于标准的无特定病原体（SPF）设施中，采用独立通风笼具（IVC）系统，并在严格控制的环境条件下进行管理：温度控制在21.0–25.0 °C，相对湿度为40–70%，光照周期为12小时，每小时完全换气15次。经过7天的适应性饲养后，将大鼠随机分为六个实验组，并额外准备若干备用大鼠以应对意外情况。通过在右后足跖皮下注射100 µL完全弗氏佐剂（CFA；10 mg·mL^-1

结果

A. pendulum 衍生物对抗类风湿关节炎靶点的影响
六种化合物的三维结构以 SDF 格式获取，其 SMILES 编号上传至 SwissTargetPrediction 数据库进行靶点预测。保留预测概率大于 0 的靶点，并将结果导出为 CSV 文件。去除重复项后，共鉴定出 97 个潜在的化合物相关靶点。

从 GeneCards、OMIM 和 TTD 数据库中收集了与类风湿关节炎（RA）相关的疾病靶点，分别获得 3520、5 和 3 个靶点。经合并并去除重复项后，共获得 3257 个与 RA 相关的靶点。通过维恩图可视化化合物靶点与疾病靶点的交集，结果显示有 79 个重叠靶点（图 4A）。

将这些常见靶点导入 STRING 数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用 Cytoscape 3.9.1 进行可视化和分析。在所得网络中，节点代表靶点，边代表它们之间的相互作用。最终的 PPI 网络包含.......

讨论

本项整合研究揭示了来自Aconitum pendulum N. Busch的C19-二萜生物碱——斯米尔诺亭A（smirnotine A）抗类风湿关节炎作用的新颖作用机制。研究结果表明，斯米尔诺亭A通过靶向抑制PI3K/Akt信号通路，显著缓解RA炎症，该机制与此前报道的其他二萜生物碱的作用机制明显不同。

网络药理学预测与分子对接验证相结合，成功鉴定出EGFR和PTGS2为主要靶点，其结合亲和力分别为-9.5和-10.2 kcal·mol⁻¹。网络药理学分析表明，蛇根碱A的抗类风湿性关节炎（RA）作用可能涉及对EGFR和PTGS2的调控，进而可能抑制PI3K/Akt信号通路。基于上述预测及既往研究报道，推测该效应独立于Nrf2通路发生。尽管该假定机制为二萜类生物碱的治疗潜力提供了新的视角^31,32,33，但仍需通过直接的实验验证（如.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	诺唯赞	Q111
AKT (60 kDa) 单克隆小鼠抗体	武汉三鹰生物技术	60203-2-Ig
BCA 蛋白检测试剂盒	广州洁必思生物科技	G3522
BSA 标准品	广州洁必思生物科技	G8532
MH7A 细胞完全培养基	上海复恒生物科技	FH-MH7A
IL-10 ELISA 检测试剂盒	伦畅硕生物科技	ED-13626
IL-17A ELISA 检测试剂盒	伦畅硕生物科技	ED-10344
IL-1β ELISA 检测试剂盒	伦畅硕生物科技	ED-10351
IL-6 ELISA 检测试剂盒	伦畅硕生物科技	ED-10377
TNF-α ELISA 检测试剂盒	伦畅硕生物科技	ED-11776
荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	ViiA-7
GAPDH 单克隆小鼠抗体	武汉三鹰生物技术	60004-1-Ig
高速冷冻离心机	湖南科诚仪器设备	HI-16KR
HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR	诺唯赞	R223
HRP 标记山羊抗小鼠二抗	武汉三鹰生物技术	SA00001-1
HRP 标记山羊抗兔二抗	碧云天生物技术	A0208
人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞系 MH7A	启赛生物技术	QS-H075
酶标仪	BioTek	MQX200
显微镜	Leica	FLEXACAM C1
多功能酶标仪	Molecular Devices	FlexStation 3
P-AKT (60 kDa) 多克隆兔抗体	武汉三鹰生物技术	28731-1-AP
石蜡切片机	Leica	RM 2016
PCR 扩增仪	Applied Biosystems	proFlex
磷酸盐缓冲液 (1× PBS)	启赛生物技术	QS-S001
PI3K (85 kDa) 多克隆兔抗体	Affinity	AF6241
P-PI3K (85 kDa) 多克隆兔抗体	Affinity	AF3242
Smirnotine A	由本实验室分离鉴定	C39H49NO11
组织脱水机	武汉俊杰电子	JT-12J
组织包埋机	武汉俊杰电子	JB-L6
组织展片烘片机	武汉俊杰电子	JK-6
Trizol	Ambion	15596-026
胰蛋白酶细胞消化液 (0.25% 胰蛋白酶， 含 EDTA，不含酚红)	启赛生物技术	QS-S401