活体完整发育大脑中的单细胞电穿孔技术

摘要

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可用于将DNA或其他大分子递送至完整组织内的单个细胞中，包括在体实验样本。本文详细描述了在非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪完整大脑中对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的实验步骤。

摘要

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可用于将DNA或其他大分子递送至完整组织内的单个细胞中，包括在体实验样本。该技术的显著优势在于，可在不影响周围组织的情况下对单个细胞进行实验操作，从而区分细胞自主性效应与全局处理所引发的效应。当与先进的在体成像技术结合时，荧光标记物的单细胞电穿孔可实现对细胞形态、细胞生长以及细胞内事件的直接可视化观察，时间尺度可从数秒延续至数天。尽管该技术已应用于多种在体和离体实验体系，我们已将其优化用于非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪。在本视频文章中，我们详细描述了在白化型非洲爪蟾蝌蚪完整脑内对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的操作流程。同时讨论了提高实验效率的方法，并展示了通过SCE荧光标记神经元后进行活体双光子荧光成像的实例。

方案

仪器设置：

1. 该技术所需的电学设备包括刺激器、示波器，以及装有银丝的微电极夹持器，用于插入微移液管中。我们通常使用 Axon Instruments 的 Axoporator 800A 刺激器，但其他常见的刺激器（如 Grass Instruments SD9 刺激器）也适用于单细胞电穿孔。刺激器连接至前置放大器（headstage），后者与插入含有内充导电溶液的玻璃微电极中的银丝电极相连接。刺激器的另一根导线连接至示波器输入端，该输入端同时也接收来自蝌蚪外部接地电极的信号。蝌蚪外部接地电极是一根简单的银丝，在电穿孔过程中始终保持与蝌蚪的电紧张接触。当微电极与蝌蚪接触时，电路即告完成。
   
   
2. 单细胞电穿孔需要配备工作距离良好的显微镜（至少 5 cm），因为这为操作提供了足够的空间，并允许微电极以约 30–45 度的角度插入。

微移液管的制备：

制备合适的微电极是本方案中的关键步骤。难点在于平衡尖端的细度（直径小于1μm）与穿刺组织时不易折断之间的关系。我们还发现，尖端锥角大于10度的微电极更为理想。

1. 准备一支拉制的玻璃微电极，其尖端直径小于1μm，尖端锥角大于10度。
   1. 选用外径为1.5mm、内径为0.75mm且带有内部丝状结构的硼硅酸盐玻璃，非常适合此用途。
      1. 相对较厚的玻璃可为尖端提供一定的刚性。
      2. 内部丝状结构有助于将回填液体向微电极尖端方向引流。
2. 制备合适的尖端通常需要根据观察结果进行多次调整。不同组织可能需要具有略微不同形状或尖端直径的微电极。

单细胞电穿孔实验方案：

对于新用户，建议首先使用荧光葡聚糖染料，因为与基因编码的荧光蛋白不同，这类染料可在落射荧光显微镜下立即观察到。使用荧光染料可使用户直接看到微电极尖端在组织中的位置，并在电穿孔过程中即时反馈设备是否设置正确以及微电极尖端是否合适。

1. 使用上样注射器或反向填充法将待电穿孔化合物的溶液吸入微量移液器中。
   1. 若使用质粒DNA，需确保样品无内毒素污染，浓度为1-2µg/ml，并以水配制。
   2. 荧光葡聚糖染料的浓度应通过实验确定。我们通常将荧光染料用水稀释至约300µM。
   3. 通常，0.5–1 µl 的体积已足够。
   4. 上样前，需将溶液高速短暂离心，以减少吸入微量移液器中的颗粒碎屑，避免堵塞。
   5. 移液管尖端内的气泡常会影响电流流动，因此在将移液管安装到放大器头stage之前，应用力弹击微移液管以排除气泡。
2. 将微量移液器插入安装在三维微操纵器上的固定夹或头架中。确保银丝电极已插入微量移液器内，并与内部溶液形成电紧张接触。
3. 将蝌蚪浸入用蝌蚪培养液（Steinberg溶液，pH 7.4）配制的0.02% MS-222（3-氨基苯甲酸乙酯）中以进行麻醉。
   1. 我们通常在实验中使用44至48期的白化型非洲爪蟾蝌蚪。
   2. 蝌蚪通常在约5分钟后完全麻醉。
   3. 可同时麻醉多只蝌蚪以减少等待时间，但避免将蝌蚪暴露于MS-222超过1小时。
4. 使用塑料移液器将一只麻醉后的蝌蚪转移至电穿孔室中。
   1. 电穿孔室可由实验室自制，方法是在一小块Sylgard®硅胶块中雕刻出蝌蚪形状的腔室，并将一根银质接地导线插入腔内，使其与腔室中的蝌蚪样本形成电紧张接触。
5. 使用湿润的画笔将蝌蚪背部朝上放置。
6. 将微量移液器降低至与皮肤接触，紧邻目标区域。
   1. 靶向细胞体密集区域将显著提高电穿孔的成功率。我们通常以蝌蚪视顶盖为靶区。
   2. 以30至45度的角度插入微量移液器。角度过小会增加皮肤穿刺难度，而角度过大会常阻碍视野。
7. 继续降低微量移液器将首先使皮肤表面产生凹陷，随后穿透进入下方组织。
   1. 优先选择表层细胞 体内 成像，并可通过缓慢降低微移液管尖端直至皮肤出现凹陷来实现靶向定位。
8. 一旦将微移液电极置入组织，应持续监测其电阻。若使用Axoporator 800A（Axon Instruments），电阻值在约10–40 MΩ范围内为最佳。电阻是判断电极尖端直径是否适用于单细胞电穿孔的良好指标。
   1. 高微移液管电阻（>100 MΩ）表明吸头堵塞或微移液器吸头过窄。
   2. 低微移液管电阻（<3 MΩ）<10 MΩ）表明尖端直径过大，通常是尖端破损所致。
   3. 若使用无法直接测量电阻的刺激器，可通过观察示波器测得的电压脉冲幅度来间接测定微电极电阻（下文将讨论）。
9. 施加电压脉冲序列。
   1. 对于质粒DNA，最有效的脉冲序列由持续时间为1 ms的负向方波脉冲组成，以300 Hz的频率递送，脉冲序列持续时间为500 ms。
      1. 脉冲电压通过经验确定，使得在示波器上测得的脉冲幅度介于0.75至1.5μA之间。
   2. 对于荧光葡聚糖染料，以300 Hz的频率施加持续时间为300 μs的正向方波脉冲，脉冲串持续时间为10 ms。
      1. 与DNA实验方案类似，脉冲电压需通过经验确定，使在示波器上测得的脉冲幅度介于0.75至1.5μA之间。
      2. 可根据在落射荧光下观察到的电穿孔结果，对刺激参数进行进一步调整。
         1. 如果电穿孔后的细胞显得暗淡，应逐步增加脉冲参数，直至细胞亮度增强。
         2. 另一方面，如果细胞成簇被标记，则应降低脉冲参数，直至实现单个细胞的标记。
10. 收回微量移液器，重新插入组织中的另一位置，并施加电压脉冲序列。
    1. 为提高产量，我们通常在蝌蚪视顶盖的每个半球内选择多个位点进行电穿孔，各位点之间保持足够间距，以确保标记的细胞不发生重叠。
11. 将电穿孔后的蝌蚪转移至含有 Steinberg 培养液的容器中。
    1. 蝌蚪将在几分钟内迅速从麻醉状态恢复。
12. 同一根微量移液器可用于多只蝌蚪。重要的是要持续观察示波器上所显示脉冲的幅度。
    1. 如果在显著增加脉冲强度后脉冲振幅仍然较低，则可能是电极尖端堵塞所致，这种情况常在一次操作中对多个蝌蚪进行电穿孔时出现。
       1. 一种解除微量尖端堵塞的方法是在将微量移液管插入组织后施加一次正向脉冲。
       2. 如果无法清除堵塞，或堵塞频繁发生，请更换微量移液器。
    2. 如果在显著降低脉冲参数后，脉冲幅度仍然非常大，则表明尖端可能已损坏，需要更换。

筛选成功转染的细胞：

1. 电穿孔后，使用直立式落射荧光显微镜对蝌蚪进行筛选，以检测标记的细胞。
2. 若使用荧光染料，可在电穿孔后仅30分钟即开始对蝌蚪进行筛选。
   1. 然而，我们发现较长的间隔时间与较低的背景荧光水平相关。
3. 对于基因编码的荧光蛋白，通常在电穿孔后至少12小时进行筛选。
   1. 表达荧光蛋白的细胞会随着时间推移而逐渐增亮，因此对于荧光较弱的细胞，可在额外等待12至24小时后重新筛选。
4. 按照前述方法将蝌蚪麻醉后，置于Sylgard®培养皿中并加盖盖玻片。随后在落射荧光显微镜下逐个检查蝌蚪。
   1. 请注意，过度暴露于落射荧光光源将导致光毒性，可能杀死被标记的细胞。因此，应尽量减少细胞暴露于荧光光照的时间。
5. 将蝌蚪放回盛有Steinberg's饲养液的容器中。

讨论

单细胞电穿孔（SCE）是一种用于确定基因功能和实现靶向遗传操作的有力工具。白化蝌蚪具有透明的身体以及易于观察的大脑结构，使其成为在活体生物中可视化神经元生长和细胞内事件的理想模型系统。SCE技术能够在整体未受干扰的大脑中，实现单个神经元生长的可视化，并进行细胞自主性的操作。虽然本视频文章展示了在非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪中进行单细胞电穿孔的操作流程，但该技术也已应用于其他生物体，并被用于海马脑片及分离的细胞培养体系中。