利用联锁脉搏注射技术和显微外科血管修复技术，工程化高精度临床前小鼠脑转移模型

摘要

本研究通过交叉脉冲注射和显微外科修复，建立了 通过 短暂性颈内注射肿瘤细胞的高精度小鼠转移模型。它能维持脑血流，防止颈总动脉阻塞，并提供更优越的临床前模型，提高肿瘤转移率和降低死亡率。

摘要

脑转移仍是一个毁灭性的临床问题。脑转移研究的一个主要挑战是缺乏能够准确复现转移过程的高质量模型，从而使癌细胞如何在大脑中定殖机制提供洞察。传统的颈内动脉注射脑转移模型通常要求颈总动脉（CCA）永久连接，这会改变大脑血流动力学并损害血脑屏障（BBB）的完整性。该方案提出了一种精细的方法，用于建立高保真度小鼠脑转移模型。核心创新是采用互锁脉搏注射（IPI）技术进行肿瘤细胞递送，随后在穿刺部位进行显微外科动脉重建，以恢复CCA的生理血流。与传统CCA结扎模型相比，IPI显微外科修复方法显著降低了围手术期死亡率（2.86%对25.71%），并提高了脑转移建立率（94.12%对65.38%）。IPI技术采用串联注射器结构，以减少颈内注射时的细胞反流。肿瘤细胞输注后，CCA会通过立体显微镜下的显微外科缝线进行细致修复，从而避免永久性闭塞。这保留了肿瘤细胞进入时大脑的原生血流动力学和血球结构完整性，同时显著提高手术成功率并降低死亡率。转移性颅内病变通过连续生物发光成像和组织病理学得到验证。该方法为研究脑转移的病理生理和临床前治疗评估提供了更优的平台，从而重现转移过程。

引言

脑转移是成人中最常见的恶性脑肿瘤类型，发生频率约为原发性脑肿瘤的十^倍。据估计，10%至20%的系统性癌症患者在疾病晚期会发展为脑转移，这是导致死亡的主要原因之一^1,2。尽管原发性癌症治疗取得了显著进展，但脑转移患者的预后依然不佳。脑转移患者的一年生存率低于20^%。某些癌症为何以及如何转移至大脑的机制仍然未知。治疗挑战因脑转移的独特生物学特性而加剧，包括BBB的存在、独特的脑免疫微环境以及肿瘤细胞与神经胶^质细胞的复杂相互作用^4,5。

脑转移的药效学和致病机制研究都高度依赖精确的临床前动物模型，这些模型准确复原了人类疾病过程。目前脑转移的动物模型虽然被广泛使用，但主要基于颅内正位植入、静脉注射或尾静脉注射、心脏注射或颈动脉注射6,7,8,9,10。然而，这些模型并不完全反映人类疾病进展，常常未能捕捉到如肿瘤细胞在生理流动条件下穿过完整BBB等关键步骤¹¹。静脉注射和心内注射导致脑特异性肿瘤形成效率低下，且常导致广泛颅外转移，导致动物在脑转移发生前过早死亡。¹²。传统的颈内动脉注射法能提高颅内肿瘤形成率，但需要永久结扎CCA。通过改变大脑血流动力学，这种连接可能诱发同侧脑区缺血，并损害肿瘤细胞递送所需的生理血流模式，从而影响肿瘤细胞在脑内的空间分布和定植生态位（^13,14）。

能够更忠实模拟脑转移病理生理的高质量动物模型至关重要¹⁵。理想的脑转移模型应涵盖整个转移级联反应，包括肿瘤细胞向脑血管的归巢、穿透血脑屏障（BBB）以及与脑微环境的动态相互作用¹⁶。高模型忠实度对于机制性研究和治疗评估都至关重要⁶.然而，现有的颈动脉注射模型并未完全还原关键生理条件，特别是正常脑血流的维护和循环肿瘤细胞的自然分布。

为克服现有脑转移临床前模型的局限性，基于IPI技术和显微外科动脉修复，开发了一种高精度动物模型，以更准确地重现转移级联反应。该方法在肿瘤细胞注射后进行短暂的动脉阻塞，随后细致修复动脉穿刺部位，恢复同侧CCA的生理血流。这种方法不仅提升了模型的一致性和成功率，更关键的是通过维持大脑的原生血流动力学来保护BBB。通过最小化脑内血流的干扰，改良的颈内注射模型提供了一个高精度平台，更准确地重现脑转移定植的自然过程，从而为研究脑转移机制和评估潜在治疗方案提供了更好的工具。

方案

所有动物实验均由中国科学院生物物理研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（批准号：SYXK2021124）。达到预定终点的动物按照中国科学院生物物理研究所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的《动物安乐死指南》和美国动物管理局（AVMA）动物安乐死指南（2020）¹⁷进行了安乐死。

1. 单电池悬浮液的制备

1. 在完整的RPMI-1640培养基中培养B16F10和4T1细胞，辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素。
2. 将细胞温度保持在含5%二氧化碳的加湿孵化箱中，温度为37°C。
3. 在手术前一天确认荧光素酶表达并确认无支原体污染。
4. 手术当天，当细胞汇聚度达到80%时，先用磷酸缓冲生理盐水（PBS）清洗细胞，然后在37°C下进行0.25%胰蛋白酶化，时间少于3分钟。
5. 向细胞中加入10%含FBS的RPMI-1640培养基，以淬灭0.25%的胰蛋白酶。
6. 将细胞以300 ×克 离心3分钟。用PBS清洗细胞两次以去除残留血清，然后用血细胞计计数。
7. 使用特洛潘蓝排除法确认注射时细胞存活率保持在90%–95%。
8. 将细胞以2×10⁶ 细胞/毫升的PBS重悬。注射前将细胞冰藏保存。
   注意：可以使用路西法酶标记的B16F10和4T1细胞。B16F10作为代表性例子被介绍。

2. 小鼠准备与围手术期准备

1. 使用7–8周大的雄性C57BL/6小鼠。
2. 在手术板下方放置热敷垫以防止体温过低。手术前30分钟打开热敷垫。
3. 用高压灭菌器消毒所有手术器械、手术板和饲养笼。用75%乙醇消毒立体显微镜和手术台。
4. 其他无法通过高压灭菌灭菌的物品应使用紫外线照射和75%乙醇消毒（见图1A）。
5. 麻醉前称重小鼠，并记录术前体重作为基线。
6. 将10克三溴乙醇加入离心管，然后加入10毫升三级戊醇。摇晃管子直到三溴乙醇完全溶解。
   注意：三溴乙醇可能引起不良反应，包括死亡率;仔细监测麻醉深度。
7. 将溶液过滤至0.22微米过滤器，制成100%原装溶液。
8. 将100%原有溶液用0.9%氯化钠盐水或稀释剂稀释至2.5%的工作溶液（1：40稀释）。每种新制备的工作溶液必须对小鼠麻醉效果进行测试。
9. 通过腹腔内注射2.5%三溴乙醇，剂量为0.2毫升/10克体重，麻醉小鼠。如有需要，通过在原始麻醉体积的三分之一处补充剂量来延长麻醉时间（见图1B）。
   注意：根据体重调整麻醉剂量，并持续监测呼吸。
10. 通过施加轻微刺激（例如夹趾）并确保小鼠完全麻醉，并观察到无运动反应。
11. 麻醉后剃掉脖子部位的毛发，并在脚趾上做一个剪掉的痕迹。
12. 涂抹眼药膏以保护眼睛免受干涩。
13. 将小鼠放在手术板上，用胶带固定四肢和上门牙（见图1C）。
14. 通过监测呼吸频率和捏痛反射来监测麻醉深度，确保小鼠在操作过程中无痛且不动。
15. 动物被随机分配到实验组，研究人员在盲目情况下进行影像分析。

3. IPI技术的标准手术程序及显微外科修复

1. 用聚维酮碘溶液消毒颈部区域，并让皮肤完全干燥后再进行（图1D）。
2. 使用无菌手术布覆盖小鼠，仅露出颈部区域（见图1E）。
3. 使用无菌外科剪刀在颈椎中线切口，切口约0.8–1厘米，使用细镊子进行组织回回（见图2A）。
4. 使用细斜镊子钝性剥离浅层筋膜及下层肌肉，露出右侧颈动脉鞘（图2B1， 图2C1）。
5. 将右侧颈动脉（ECA）与颈动脉鞘分离，并结扎右侧ECA，以防止细胞渗漏至颅外分支（图2B2， 图2C2）。
6. 小心地将右侧CCA隔离在颈动脉鞘内，保留位于侧侧和血管下方的迷走神经（见图2C1）。
7. 在隔离的右侧CCA下方放置一小块橡胶手套和一颗盐水湿棉球作为枕头，以抬高并稳定血管。
   注意：抬高CCA可以稳定血管，促进准确穿刺和注入。（图2B4，图2C4）
8. 在棉球远端和近端的CCA上打两个未紧结的开环结，然后将近端结打结（见图2B3，图2C3）。
9. 在远端未紧结处的CCA处使用微血管夹，暂时阻断CCA血流（见图2B4，图2C4）。
10. 癌细胞植入
    1. 联锁穿孔
       1. 用32G针头在斜面朝上时刺穿右侧CCA的高起段。
       2. 在保持穿刺部位的同时取出初始注射器。
       3. 将癌细胞悬浮液进行漩涡混合，吸入100微升液体进入微升注射器，确保不会吸入气泡。
       4. 将微升注射器的针尖插入步骤3.10.1.1中创建的穿刺点，并稳稳握住不注射，以确保细胞释放前位置稳定（见图2B5，图2C5，补充图1）。
          注意：穿刺时使用32克注射器，注射时使用微升注射器，以确保定位稳定并受控输送。 补充图1 显示了两支注射器的参数。32G注射器的外径为0.22毫米，微升注射器针头为0.26毫米，便于安全插入和受控注射。
    2. 脉冲注入（图2C5）
       1. 取下步骤 3.9中施加的微血管夹具。
       2. 开始通过微升注射器将肿瘤细胞悬浮液注入ICA。
       3. 通过脉冲式注射动作来传递悬浮液，以小脉冲轻柔推动注射器柱塞，而非连续施加压力。
       4. 采用以下任一标准施行悬浮液：心动周期标准，每8个心周期注射~1微升细胞悬浮液，并以远端颈内颈动脉的脉动逆行血流引导;或注射速率准则，即在确保速率不超过60 μL/min的前提下，注入速率为~1 μL/s。
       5. 注射时监测血管状况。当悬浮液通过腔内时红色血管暂时变透明，且穿刺部位周围无明显渗出，即可表示成功输送。
       6. 注射完成后，小心取出微升注射器。
       7. 立即以受控方式收紧远端结，以密封血管并减少反流（见图2B6， 图2C6）。
          注意：脉搏注射可减少过度灌注，并降低颅内压升高的风险。
11. 显微外科修复（图2B6， 图2C6）
    1. 使用10-0尼龙显微外科缝线以防水方式闭合穿刺部位，针头入口和出口点紧邻缺损边缘，以减少血管渗漏并保持腔内通畅性。
    2. 将显微外科缝线针在高倍放大镜下穿过血管壁的穿孔，并暂时保持缝线松开。
    3. 用肝素盐水冲洗手术区域。
    4. 用两到三个方结固定缝线。
    5. 将缝线的自由端修剪至约1–2毫米，以防止松动，同时减少异物负担。
       注意：IPI技术的标准手术程序和显微外科修复方法详见 补充视频1。

4. 恢复CCA血流

1. 逐渐松开近端结。
2. 冲洗腔内以去除任何潜在的显微镜下血栓。在手术场放置一个干棉球以监测出血过多情况。
3. 一旦确认穿刺部位无活动性积液，应谨慎松开远端结节以恢复颈动脉血流（见图2B7，图2C7）。

5. 确认修复成功

1. 脉搏恢复
   1. 观察 CCA 是否有强烈的脉搏，表明重新灌注成功。
2. 验证通畅性和血管完整性
   1. 检查修复部位，确保无狭窄，腔腔保持通畅且与近端血管段连续。

6. 伤口灌注与闭合

1. 用 非肝素化生理盐水 彻底冲洗手术部位，以清除杂物和血栓。
2. 用连续缝线闭合皮肤切口。
   注意：保持手术场地湿润，所有操作均温和进行，以减少组织损伤。

7. 术后护理

1. 输液支持：术后立即皮下注射0.5–1毫升温热无菌生理盐水，以补偿围手术期液体流失。
2. 感染预防：如手术时间超过40分钟，连续3天服用恩诺沙星（5 mg/kg，每日一次）。如果手术时间少于40分钟，则无需使用抗生素。
3. 营养与水分：术后至少一周内提供水凝胶或软化食品，以确保充足的水分和营养。
4. 每日监测：进行每日健康评估，观察圈状行为、神经功能缺陷、伤口感染和体重减轻。
5. 术后预期疗程：在前48小时内，小鼠可能表现出活动减少、轻度毛发竖起和体重减轻，达到术前基线的15%，随后逐渐恢复。
6. 镇痛：每天一次美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射），持续2–3天，以缓解疼痛并促进康复。

8. 成功建立动物模型的评估标准

1. 体重监测
   1. 每天称老鼠体重并记录体重。
2. 临床评估
   1. 每天评估临床体征，包括姿势和绕圈行为。
3. 生物发光成像
   1. 打开成像仪器和电脑的电源开关。
   2. 启动生物发光成像分析软件（版本4.7.2），点击“初始化”以初始化生物发光成像系统。
   3. 初始化过程中，成像系统控制面板上的温度状态灯将显示为红色。只有在温度状态灯变绿后才进行成像。
   4. 在影像检查前6小时内不给小鼠食物和饮水，以防止麻醉期间吸入。
   5. 准备成像基材时，将浓度为10 mg/mL，在整个过程中保持光线保护。计算10微升/克体重时的注射体积。
   6. 用束缚鼠标进行成像检查。用75%医用酒精清洁左下腹部注射部位。
   7. 使用棉签轻柔刺激注射部位的腹壁，以降低针头进入肠道的风险。
   8. 穿刺腹壁后，轻轻抽吸确认无血，然后缓慢注射 体内成像底 片。
   9. 注射底物后4分30秒，将小鼠转移到麻醉诱导腔。
   10. 使用3%异氟醚诱导麻醉。一旦失去了正直和捏合反射，将异氟醚浓度降至2%以维持。
   11. 将麻醉小鼠放入成像腔，确保鼻锥完全覆盖口鼻。把成像舱门牢牢关上。
   12. 在成像系统控制面板中，选择“荧光”作为成像模式。手动将曝光时间设置为60秒。选择“摄影”、“叠加”和“对齐网格”。
   13. 将视场设置为D，以便拍摄三只老鼠。将成像高度调整为1.5厘米。选择“阻挡”作为激发滤波器，选择“打开”作为发射滤波器。
   14. 注入底物10分钟后，点击“获取”以捕捉图像。
   15. 图像采集完成后，进入工具面板，选择“ROI 工具”。使用“Circle”工具划定感兴趣区域（ROI），然后点击“衡量ROI”以获取定量数据。
4. 组织学分析
   1. 在实验终点采集脑组织并进行组织学分析。
   2. 通过赤木精和伊红（H&E）染色识别并确认转移性病灶。

9. 人道终点

1. 为确保动物福利和伦理标准合规，已设定预先确定的人道终点作为立即安乐死的标准。
2. 小鼠通过吸入二氧化碳（CO₂）安乐死，随后通过宫颈脱位作为确认死亡的第二物理方法。
3. 如果出现以下任何情况，应立即实施安乐死。
   1. 神经功能缺损
      1. 运动功能障碍：共济失调（步态不稳、摇晃）、绕圈、瘫痪、偏瘫或震颤。
      2. 行为或意识变化：嗜睡、昏迷或昏迷。
      3. 颅内压升高的迹象：异常姿势（如背部驼背表示痛苦）或头部倾斜。
      4. 癫痫发作：全身性或局灶性抽搐。
   2. 体重与生理功能的变化
      1. 体重下降超过20%，或因肿瘤负荷或严重虚弱而无法独立进食或饮水。
      2. 呼吸困难（喘息或气喘）或尿失禁/粪便失禁。
   3. 肿瘤状况
      1. 如果检测到肿瘤相关的溃疡、感染或坏死，应立即终止实验。
   4. 最大耐受肿瘤负荷
      1. 小鼠每周接受两次生物发光成像。
      2. 一旦颅内肿瘤信号进入指数增长阶段（例如连续两次影像检查间加倍），神经监测频率增加至每日两次。
      3. 安乐死应在共济失调或癫痫发作发生时立即执行，无论生物发光信号值如何。

结果

生物发光成像与定量分析
遵循标准化手术方案，优化的脑转移小鼠模型在术后 连续体内影像 显示出稳定的颅内生物发光信号。颈内接种后4周的 持续体内 生物发光成像（见图3A）和定量分析（见图3B）显示，转移性B16F10细胞在脑微环境中增殖。术后体重监测显示，携带肿瘤的小鼠与PBS对照组相比体重下降进展（见图3C）。Kaplan–Meier生存分析进一步显示，B16F10注射组的生存率降低（见图3D）。

脑样本的粗略形态学检查
图 3E展示了B16F10小鼠脑转移模型中福马林固定、石蜡嵌入脑组织块的粗略形态学检查...

讨论

能够准确重现脑转移的健全临床前模型对于阐明病理生理机制和评估治疗效果至关重要。传统的颈内注射模型需要颈总动脉结扎（CCA），该结扎以非生理性方式改变脑血流，可能诱发同侧缺血损伤并破坏血脑屏障（BBB）9,11,15,16。该模型存在三大局限性：单注射器注射相关的肿瘤细胞反流，导致肿瘤形成率较低;持续注射导致高术中死亡率;以及颈动脉结扎引起的转移过程的不准确复述。为解决这些局限性，本研究通过结合优化的颈内注射技术与显微外科动脉修复，建立了高保真度、可重复的脑转移模型，从而保持生理性的脑血流动力学和血统平衡。

在传统模型中， 通过 单注射器连续注射方式进行肿瘤细胞递送会导致显著的反流，尽管技术改进，这仍是模型失败的主要原因（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 显微外科缝合针	灵桥	2650798	用于修复颈动脉穿刺部位的显微外科缝合
100 µL 微升注射器	博力格工具	100UL	用于锁定脉动注射时递送肿瘤细胞的微升注射器
100 µL 移液器	艾普多夫	3123-000250	用于手术区盐水冲洗的移液器
32G 1 mL 胰岛素注射器	慈爱	YY0497	用于创建初始动脉穿刺部位的胰岛素注射器
4-0 丝线缝合	艾迪康	W501	用于皮肤切口闭合的缝合材料
4T1 乳腺癌细胞系	获得自中国科学院生物物理研究所盛电王实验室	CRL-2539	用于颈动脉脑转移模型的肿瘤细胞系
75% 乙醇	安杰特	Q/371402AAJ008	用于清洁注射部位的消毒剂
7-8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠	查尔斯河实验室	1.10011E+17	用于 B16F10 脑转移模型的实验动物
8 周龄雌性 BALB/c 小鼠	查尔斯河实验室	1.10011E+17	用于 4T1 脑转移模型的实验动物
尖端钳	科沃工具	—	用于组织解剖和血管操作的显微外科钳
B16F10 黑色素瘤细胞系	获得自中国科学院生物物理研究所盛电王实验室	CRL-6475	用于颈动脉脑转移模型的黑色素瘤细胞系
生物发光成像分析软件	Living Image（版本 4.7.2）	—	用于分析生物发光成像数据的软件
DMEM	西工生物科技	M1805	用于肿瘤细胞维持的细胞培养基
恩诺沙星（抗生素）	MCE	HY-B0502	用于术后感染预防的抗生素
伊红 Y 溶液	贝奥泰姆	E301879	用于伊红染色的组织学染色试剂
眼药膏	百云山	H44023089	用于麻醉期间保护眼睛的眼科软膏
胎牛血清（FBS）	Pan Sera Tech	ST30-3302	细胞培养基的血清补充剂
GraphPad Prism	版本 4.7.2	—	用于生存曲线和定量数据分析的统计分析软件
苏木精溶液	贝奥泰姆	C0105S	用于苏木精染色的组织学染色试剂
异氟烷	H.F.Q. 生物技术	101357015	用于成像过程中的吸入麻醉剂
IVIS Spectrum 体内成像系统	Lumina Series III	—	用于体内生物发光成像的成像系统
美洛昔卡（止痛药）	齐鲁动物保健	150252467	用于术后镇痛的非甾体抗炎药
显微外科剪刀	科沃工具	—	用于组织解剖的显微外科剪刀
小型血管夹	哲勇工具	200521	用于临时闭塞颈动脉的微血管夹
针持钳	江欣工具	1420 20Cr13	用于处理显微外科缝合的手术器械
甲醛（4%）	中升万达科技	20240411	用于组织学分析前脑组织保存的固定剂
青霉素	Gibco	1758-9324	用于细胞培养的抗生素
碘伏溶液	四环牌	Q/PGSHW0009	用于手术皮肤消毒的防腐溶液
RPMI-1640 培养基	西工生物科技	12-115F	用于肿瘤细胞生长的细胞培养基
Scilogex 搅拌器	Scilogex	MX-S	用于均质肿瘤细胞悬液的旋转混合器
蒸汽指示胶带	3M-Comply	1322-24MM	用于高压灭菌手术器械的灭菌指示胶带
立体显微镜	奥林巴斯	SZ61	用于显微外科手术过程中可视化的显微镜
Zeiss Stemi 508 立体显微镜	Zeiss	Stemi 508	用于高放大度手术可视化的立体显微镜
无菌生理盐水（0.9%）	科伦	25M14D07	用于维持手术区湿润的无菌灌洗液
链霉素	Gibco	1758-9319	用于细胞培养的抗生素
手术布	大方	001-2016	用于隔离手术区的无菌布
手术手套	Ansell Medi-grip	210-64005	用于手术过程中的无菌手套
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	MKBH0634V	用于手术过程中的可注射麻醉剂