支气管镜细胞学与宏基因组测序鉴别癌症治疗相关性与感染性肺损伤

摘要

本文介绍了一种通过支气管镜引导采集、细胞学分析和宏基因组高通量测序（mNGS）相结合的方法来评估支气管肺泡灌洗液（BALF）的实验方案。该综合流程可准确区分肿瘤治疗相关性肺损伤与肺部感染，有助于实现精准且及时的临床决策。

摘要

癌症治疗相关性肺损伤（CTLI）患者常表现为非特异性的呼吸道症状和影像学改变，与感染性肺炎或肿瘤进展极为相似，给明确诊断带来重大挑战。传统的诊断方法主要依赖血液生物标志物和常规微生物培养，通常难以做出明确诊断且耗时较长。本文介绍了一种结合支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞学分析与宏基因组二代测序（mNGS）的综合诊断方案。该操作流程包括三个主要阶段：首先，通过标准化支气管镜检查获取高质量的BALF样本；其次，对获得的BALF样本进行细胞学分析，以反映肺部微环境的状况，识别炎症特征，并筛查恶性细胞以排除肿瘤进展；最后，采用mNGS技术识别或排除活动性感染病因。这一先进的基因组学技术可实现快速、高灵敏度且无偏倚的病原体检测，成功克服了传统培养方法的局限性。采用本方法的代表性结果表明，该策略能够有效区分免疫相关性肺炎与活动性肺部感染或肿瘤进展。与传统诊断方法相比，该方案在快速、准确地区分CTLI与感染性病因及隐匿性恶性肿瘤方面具有显著优势。最终，这一标准化操作流程有助于明确临床诊断，指导关键治疗决策，并改善患者预后。

引言

抗肿瘤治疗的进展，如免疫检查点抑制剂和靶向治疗，已显著改善患者的生存率，但也增加了非感染性肺毒性的发生率，这类肺损伤统称为癌症治疗相关性肺损伤（cancer treatment-related lung injury, CTLI）^{1,2,3,4,5,6,7}。其中，检查点抑制剂相关性肺炎（checkpoint inhibitor pneumonitis, CIP）已成为一种致命的免疫相关不良事件，总体发生率为2–19%，死亡率高达35%^8,9,10。CTLI的诊断面临重大临床挑战，因其非特异性的呼吸道症状和影像学表现——如磨玻璃影、实变或网状影——与感染性肺炎或肿瘤进展极为相似^11,1....

方案

本方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，并已获得我院机构审查委员会的批准。在操作前，已从所有参与者处获得知情同意。

1. 术前准备

1. 支气管镜检查后1周内进行的患者评估
   1. 获取近期的实验室检查结果，包括全血细胞计数和凝血功能谱，以确保侵入性操作的安全性 （补充文件1）
   2. 进行12导联心电图检查。
   3. 评估生命体征并确保血流动力学稳定。
   4. 在室内空气中测量患者的静息血氧饱和度，以评估肺功能。
      注意：如果血氧饱和度（SpO₂）较低或患者存在呼吸功能受损，应考虑进行动脉血气分析以获取基线 PaO₂/PaCO₂。
   5. 筛查所有禁忌证。
   6. 指导患者在操作前至少禁食6小时，并在操作前2小时内避免饮水，以降低误吸风险。
   7. 在操作前立即进行口腔和鼻腔吸痰及清洁，以尽量减少上呼吸道污染。
2. 设备与人员准备
   1. 准备所有必需的支气管镜检查设备和监护仪器。根据患者的气道解剖结构选择合适尺寸的支气管镜。确认支气管镜的吸引功能正常。
      注意：操作室内必须立即可获取急救复苏设备，包括辅助供氧装置和吸引设备，以应对可能发生的气道并发症。任何具有标准培训背景的支气管镜医师均可独立执行该操作，无需....

结果

通过遵循上述标准化方案，临床医生可重复性地获取高质量的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本，并利用细胞学和基因组学分析来区分免疫治疗相关性肺炎（CTLI）与其类似疾病。以下展示我们病例中的一个代表性结果，以说明典型发现。一名68岁女性患者，患有IV期低分化肺癌（原发肿瘤位于右胸膜区），正在接受帕博利珠单抗（pembrolizumab）免疫治疗，本案例用于展示BALF细胞学联合宏基因组下一代测序（mNGS）的方法(图1)。该患者已接受六周期化疗联合帕博利珠单抗治疗，随后进行了一周期的帕博利珠单抗维持治疗。在第7周期治疗后三周，患者出现干咳和进行性呼吸困难。体格检查显示无发热（体温：36.6 °C），但存在低氧血症（室内空气下血氧饱和度SpO₂为86%，吸氧后改善至93%）。实验室检查显示炎症标志物升高（白细胞计数：11.3 × 10⁹/L，以中性粒细胞为主；C反应蛋白：77.9 mg/L），但降钙素原正常（<0.05 ng/mL），提示存在炎症反应而无明显细菌感染.......

讨论

在当前癌症治疗时代，治疗相关性器官损伤（如免疫检查点抑制剂（ICIs）所诱发的损伤）仍然是一个主要的临床问题，可能限制治疗进程，甚至危及生命^3,4。在ICIs诱导的免疫相关不良事件（irAEs）中，肺炎（pneumonitis）因其是导致死亡的主要原因而受到广泛关注¹⁰，占接受ICIs治疗患者中irAE相关死亡病例的79%⁴⁹。因此，在肿瘤学临床实践中，识别免疫检查点抑制剂相关性肺炎（CTLI）并将其与其他疾病相鉴别具有极其重要的意义。本研究方案结合支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞学检查与宏基因组下一代测序（mNGS），显著提升了对疑似CTLI患者的诊断评估能力，满足了关键的临床需求。该方法相较于传统诊断流程以及无支气管镜检查支持的经验性治疗具有显著优势。

我们的方案结合了支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞学与宏基因组二代测序（mNGS），显著提升了对疑似CTLIs患者诊断.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2% 利多卡因	Hunan Kelun	N/A	用于气道黏膜的局部麻醉剂。
0.5 mm 玻璃珠	Sigma	N/A	用于微生物细胞壁的机械性破碎。
BF-260 电子支气管镜	Olympus	N/A	用于获取肺泡灌洗液。
Burrows-Wheeler 比对算法	开源软件	0.7.17(RRID:SCR_010910)	用于将测序序列比对至人类基因组的算法。
高流量加温湿化氧疗仪	BMC Medical	N/A	为具有自主呼吸的患者提供特定流量、加温加湿的呼吸气体。
涡旋混合器	Scientific Industries	N/A	Scientific Industries
咪达唑仑	江苏恩华	N/A	用于患者镇静以提高舒适度的全身性镇静剂。
Nextseq 550 测序平台	Illumina	N/A	用于对肺泡灌洗液（BALF）中的基因组进行测序。
QIAseq 超低起始量文库构建试剂盒	Tiangen	N/A	用于构建宏基因组文库的试剂盒。
Qubit 4.0 荧光计	Thermo Fisher Scientific	N/A	用于检测肺泡灌洗液（BALF）中核酸含量的仪器。
TIANamp 微量DNA提取试剂盒 DP316	Tiangen	N/A	用于从肺泡灌洗液（BALF）中提取总核酸的DNA提取试剂盒。
台盼蓝	Biosharp	N/A	用于细胞活力评估的染料。
水浴锅	Joan	N/A	用于在 65 °C 下对肺泡灌洗液（BALF）样本进行灭活处理。
瑞氏-吉姆萨染色液	yuanmu	N/A	用于细胞差异染色。
XN-9000 血液分析仪	Sysmex	SN-13699	用于计数肺泡灌洗液（BALF）样本中总有核细胞的血液分析仪。