利用拟南芥eceriferum突变体研究植物角质层生物合成

摘要

植物角质层是植物表面的蜡质外层，主要功能是减少水分流失，同时也是阻止病原微生物侵入的重要屏障。在本视频中，我们展示了通过正向和反向遗传学方法鉴定出的植物角质层突变体的分析过程。

摘要

植物角质层是覆盖在植物表面的蜡质外层，主要功能是减少水分流失，同时也是防止病原微生物侵入的重要屏障。角质层由一种坚韧的交联聚合物“角质”（cutin）和一层封闭植物表面的保护性蜡质组成。许多植物的角质层蜡质层十分明显，例如常春藤叶片上呈现的光泽薄膜，或葡萄与卷心菜叶片表面因蜡质中存在光散射晶体而形成的粉状覆盖物。由于角质层是植物适应陆地环境的关键适应性结构，研究参与植物角质层形成的基因在农业和林业领域具有重要应用价值。今天，我们将展示通过正向遗传学和反向遗传学方法鉴定出的植物角质层突变体的分析过程。 关键词：植物角质层，角质，蜡质层，水分保持，病原微生物屏障，正向遗传学，反向遗传学，突变体分析

方案

一、通过视觉筛选和反向遗传学方法鉴定表皮突变体

模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的角质层突变体被称为“eceriferum”突变体，意为“不产生蜡质”。这类突变体可通过视觉筛选发现，即仅通过观察即可看出：野生型植株的花序茎呈灰白色，而突变体的茎则为深绿色且具光泽。  通过此类视觉筛选所分离出的突变体之一便是这个被称为 eceriferum4 或 cer4 的突变体。 

发现重要角质层突变体的另一种方法是反向遗传学策略：选择感兴趣的候选基因，然后研究该基因被破坏的植物株系。 这些突变体中含有T-DNA插入，打断了目标基因，在本例中为一种我们现在称为MAH1的细胞色素P450基因。

PCR结果（如视频中所示）可证实T-DNA插入位于目标基因内。当使用两个基因特异性引物扩增野生型DNA时，可观察到扩增产物；但如果T-DNA插入打断了该基因，如本突变体中所示，则无扩增产物出现。 相反，若使用针对T-DNA和目标基因的特异性引物，则仅在突变体中能观察到扩增产物。 我们筛选纯合突变株系，即基因的母本和父本拷贝均被破坏的植株。 若基因的一个拷贝被T-DNA打断，而另一个拷贝仍为野生型，则PCR结果呈混合状态。

II.  利用气相色谱法测定表皮蜡质的化学成分。 

我们使用气相色谱法分析蜡质的化学成分。 首先，通过将植物表面浸入氯仿中，去除可溶性蜡质化合物。

然后，将样品注入气相色谱柱中，在载气流中被加热并携带通过色谱柱。 不同化合物在柱壁上的吸附程度不同，从而实现化合物的分离，并依次从色谱柱的另一端流出。 当化合物通过火焰离子化检测器时，我们观察到相应的峰信号。 每个峰的保留时间具有化合物特异性，结合质谱分析，我们已鉴定出拟南芥蜡质中的各个组分。 主要峰对应的是C29烷烃、C29酮和C29仲醇。 次要峰则对应仲醇、脂肪酸、醛和酯。峰面积相对于标准品的比值可反映每种化合物的相对含量。

观察这些角质层突变体的气相色谱图时，可以发现cer4突变体缺失了伯醇和酯类，而mah1突变体则缺失了仲醇和酮类。 这些表型特征有助于我们深入了解目标基因在植物中的功能。 例如，在明确cer4突变体中哪个基因发生突变之前，其表型已提示我们在生物合成途径的伯醇分支中存在缺陷。 在Kunst实验室对该基因的分子特性进行研究后，发现它属于脂肪酰基还原酶基因家族，这一结果与该化学表型高度吻合。

三、利用冷冻扫描电镜确定表皮晶体结构

在研究拟南芥角质层突变体时，我们可以观察它们的茎是否呈现深绿色、有光泽的表型，或是野生型的灰白色外观。 我们使用扫描电子显微镜观察植物表面的角质层，以确定其视觉表型的结构基础。 我们采用冷冻扫描电镜（cryo-SEM）技术，将植物样品快速冷冻，并在液氮温度下进行观察，以保持角质层的完整结构，因为扫描电镜需要在真空条件下运行，若不保持样品冷冻状态，样品会脱水塌陷。

此处，cer4 和 mah1 样品连同野生型对照一起被解剖并固定在电镜样品 stub 上。 当样品被转移至显微镜的低温载台后，可以看到野生型拟南芥茎的角质层表面覆盖有晶体。 正是这些晶体对光的散射作用，使茎呈现灰白色外观。 这是 cer4 突变体的茎；还记得它看起来有光泽吗？ 其表面缺乏晶体。

已有研究通过实验从植物角质层中分离出纯蜡质化合物，并在实验室中使其重结晶，结果发现所形成的晶体形态与植物体表的晶体一致。在拟南芥中，我们认为这些晶体由多种化合物混合组成，情况更为复杂。 例如，化学分析表明，在 cer4 突变体中，仅缺失了作为次要组分的伯醇及其衍生物酯类，但其茎表面的晶体却完全消失。 而在 mah1 突变体中，由于细胞色素 P450 酶发生突变，导致蜡质中的两种主要成分——仲醇和酮类——缺失，但 mah1 植株表面的晶体仍能正常形成。

欲了解有关拟南芥角质层突变体的更多信息，请访问 Annual Review of Plant Biology。