体外调节性T细胞功能分析：聚焦增殖与分化

摘要

本方案提供了一种 体外 研究调节性T细胞对效应T细胞增殖与分化影响的共培养策略

摘要

调节性T（Treg）细胞在维持免疫稳态中发挥关键作用。Treg细胞功能异常与多种疾病相关，包括自身免疫病、器官移植排斥、感染和癌症。调控Treg细胞被认为是治疗炎症性疾病的潜在治疗策略，包括自身免疫性疾病、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病和过敏性疾病。经典 体外 调节性T细胞（Treg）抑制实验主要用于评估Treg细胞对效应T细胞（Teff）增殖的抑制作用。然而，除增殖外，T细胞的分化对其发挥免疫功能同样具有重要意义。因此，本方案提供了一种改良的 体外 调节性T细胞抑制实验，用于研究调节性T细胞（Treg细胞）对效应T细胞（Teff细胞）增殖与分化的影响。本方案首先介绍小鼠Treg细胞和初始T细胞的制备方法，随后阐述通过共培养体系研究Treg细胞对Teff细胞（包括Th1细胞和Th17细胞）增殖与分化的调控作用，最后介绍共培养后用于流式细胞术的染色策略。 体外 Treg细胞的功能分析可用于研究Treg细胞对T细胞增殖和极化的影响。

引言

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 调节性T（Treg）细胞在免疫稳态中发挥重要的调节作用¹。Treg细胞可主动抑制过度的免疫反应，并维持自身免疫耐受，从而防止免疫反应对正常组织和器官造成损伤²。调控Treg细胞被认为是治疗自身免疫性疾病、实体器官移植排斥反应、移植物抗宿主病以及过敏性疾病等炎症性疾病的潜在治疗策略^3,4,5。同时，抑制Treg细胞的功能被视为激活抗肿瘤免疫的有效策略^6,7。临床研究已探索了过继性调节性T细胞治疗或低剂量IL-2治疗在自身免疫性疾病、实体器官移植以及移植物抗宿主病中的应用^8,9,10。此外，工程化Treg细胞的研究也日益受到关注，包括嵌合抗原受体（CAR）-Treg细胞和T细胞受体（TCR）-Treg细胞^11,12。

迄今为止，调节性T细胞（Treg）疗法尚未在常规临床治疗中广泛应用。为了推动Treg细胞疗法的临床应用，系统性地研究和评估其功能至关重要。体外评估调节性T细胞功能的常用策略是体外Treg抑制试验¹³，该方法可检测Treg细胞对效应T细胞（Teff）增殖的抑制功能。然而，标准的体外 Treg抑制试验并未评估Teff细胞的分化情况。若能同时评估效应T细胞的增殖与分化，则可获得关于调节性T细胞功能的更全面信息。

此处，我们介绍一种改良的 体外 Treg细胞抑制实验，称为“体外 Treg细胞的功能分析”（图1）。本方案提供了一种 体外 研究调节性T细胞对效应T细胞增殖与分化影响的共培养策略

方案

所有小鼠实验均经四川大学华西医院动物伦理委员会批准（批准号：20250814006、20211212A）。本实验所用小鼠均为C57BL/6遗传背景。

1. 溶液的配制

1. 配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的1× PBS。
2. 配制磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液：含0.5% BSA和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1× PBS。
3. 配制细胞培养基：RPMI 1640培养基，含10%胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、55 µM β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。

2. C57BL/6小鼠淋巴细胞的制备

1. 在无菌条件下取一只6–8周龄的C57BL/6小鼠（雄性或雌性）的脾脏和外周淋巴结，放入含有5 mL FACS缓冲液的50 mL离心管中。
   注意：脾脏和淋巴结的解剖应按照标准操作程序进行。
2. 将70 µm细胞筛置于50 mL离心管上，然后将脾脏和淋巴结放在筛网上，使用5 mL注射器活塞轻轻研磨组织1分钟。研磨过程中，用FACS缓冲液冲洗筛网3次。确保将所有组织完全研磨，并将细胞冲洗至离心管中。研磨完成后，移除细胞筛。
3. 在4 °C下以350 × g离心7分钟。
4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于3 mL红细胞裂解缓冲液中，在室温下静置3–5分钟。
5. 立即向离心管中加入FACS缓冲液至总体积达15–20 mL，以终止裂解反应，然后在4 °C下以350 × g离心7分钟。
6. 弃去上清液，加入10 mL FACS缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀。
7. 取10 µL细胞悬液，使用台盼蓝染色法计数总活淋巴细胞数。
   注意：这些细胞为CD45.2⁺淋巴细胞。

3. CD45.1 小鼠淋巴细胞的制备

1. 在无菌条件下取一只6–8周龄CD45.1小鼠（无论雄性或雌性）的脾脏和淋巴结，并将其放入含有5 mL FACS缓冲液的50 mL离心管中。
2. 按照上述相同步骤制备CD45.1小鼠的淋巴细胞。
   注意：这些细胞为CD45.1⁺淋巴细胞。

4. CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 初始T细胞的制备

注意：整个过程使用MACS的CD4⁺CD62L⁺ T细胞分离试剂盒。MACS缓冲液预先冷却至4 °C，所有离心条件均为4 °C、350 × g 离心7分钟。

1. 收集来自 C57BL/6 小鼠的细胞悬液，离心并弃去上清液，每 1 × 10⁸ 初始总细胞向离心管中加入 400 µL MACS 缓冲液和 100 µL CD4⁺ T 细胞生物素标记抗体混合物。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 5 分钟。
2. 每 1 × 10⁸ 初始总细胞，向第 4.1 步的离心管中加入 300 µL MACS 缓冲液和 200 µL 抗生物素微珠。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。
3. 加入 10 mL MACS 缓冲液，离心并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 2 mL MACS 缓冲液中。
4. 将 LS 柱置于相应的 MACS 分选磁性分离器上。用 3 mL MACS 缓冲液冲洗柱子。等待柱内缓冲液完全流尽后，再进行下一步操作。
   注意：LS 柱的最大细胞载量为 2 × 10⁹ 个细胞（包括阳性与阴性细胞），其可捕获的阳性细胞最大数量为 1 × 10⁸ 个。通常，单只小鼠在此步骤中仅需使用一个 LS 柱。
5. 将第 4.3 步获得的细胞悬液加载到 LS 柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用 3 mL MACS 缓冲液洗涤柱子。将所有穿流液收集至一个新的 15 mL 离心管中。
   注意：这些为总 CD4⁺CD25^– T 细胞。
6. 对第 4.5 步获得的总 CD4⁺CD25^– T 细胞进行离心，弃去上清液，获得细胞沉淀。
7. 每 1 × 10⁸ 初始总细胞，向细胞沉淀中加入 800 µL MACS 缓冲液和 200 µL CD62L 微珠。轻轻混匀，在 4 °C 避光孵育 10 分钟。
8. 向离心管中加入 10 mL MACS 缓冲液，离心并弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 500 µL MACS 缓冲液中。
9. 将 MS 柱置于相应的 MACS 分选磁性分离器上，并用 1 mL MACS 缓冲液冲洗柱子。
10. 将细胞悬液加载到 MS 柱上。当悬液完全流入柱内后，用 1 mL MACS 缓冲液洗涤柱子两次。
11. 将 MS 柱从磁性分离器上取下，置于一个新的 15 mL 离心管上。向柱中加入 1 mL MACS 缓冲液，并立即用力推动推杆，以洗脱被磁珠标记的细胞。
12. 计数细胞，离心并弃去上清液，将细胞重悬于适量培养基中，并将离心管置于冰上。
    注意：这些细胞为 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 初始 T 细胞。通常，每只小鼠可纯化获得约 8 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个 CD4⁺CD25^–CD62L⁺ 初始 T 细胞；若包含外周淋巴结，可提高得率。
13. 测定分离细胞的纯度：取 5 × 10⁴ 个分离得到的 CD4⁺CD62L⁺ T 细胞，重悬于 1.5 mL 离心管中的 50 µL 抗体溶液中。
    注意：通过将抗小鼠 CD4 PerCP-Cy5.5 抗体、抗小鼠 CD62L FITC 抗体和抗小鼠 CD25 PE 抗体以 1:100 的比例加入 FACS 缓冲液中，制备抗体溶液。
14. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟后，加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 µL FACS 缓冲液中。
15. 通过流式细胞术检测样品纯度。
    注意：有关流式细胞仪分析的详细信息，请参阅仪器用户手册或先前报道的实验方案¹⁴。分离的 T 细胞样品中 CD4⁺CD25^–CD62L⁺ 初始 T 细胞的纯度应高于 95%（图 2）。

5. CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ 调节性T细胞富集细胞与抗原提呈细胞富集的非CD4⁺细胞的制备

注意：整个过程使用MACS用CD4⁺CD25⁺调节性T细胞分离试剂盒，该试剂盒的说明书已优化，可同时获得富含抗原呈递细胞（APC）的非CD4⁺细胞和富含CD4⁺CD25⁺ Treg的细胞。MACS缓冲液预先冷却至4 °C，所有离心条件均为4 °C、350 × g离心7分钟。

1. 收集来自CD45.1小鼠的细胞悬液，离心后弃去上清液，按每1 × 10⁸个初始总细胞加入400 µL预冷的MACS缓冲液和100 µL CD4⁺CD25⁺调节性T细胞生物素抗体混合液至离心管中。轻轻混匀，于4 °C避光孵育10分钟。
2. 无需洗涤，直接向第5.1步的离心管中按每1 × 10⁸个初始总细胞加入380 µL预冷的MACS缓冲液、200 µL抗生物素微珠和20 µL CD25-PE抗体。轻轻混匀，于4 °C避光孵育15分钟。
3. 向离心管中加入10 mL MACS缓冲液，离心后弃去上清液，然后按每1 × 10⁸个初始总细胞将细胞沉淀重悬于500 µL MACS缓冲液中。
4. 将LD柱置于相应的MACS分选磁性分离器上，用2 mL MACS缓冲液冲洗柱子。待柱内缓冲液完全流尽后再进行下一步操作。
5. 将第5.3步所得细胞悬液缓慢加至LD柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用2 mL MACS缓冲液洗涤柱子2次。将所有穿流液收集至一个新的15 mL离心管中。
6. 从磁性分离器上取下LD柱，置于一个新的15 mL离心管上。向LD柱中加入3 mL MACS缓冲液，立即用力推动柱塞，以挤出被微珠标记的非CD4⁺细胞。计数细胞，离心后将细胞沉淀重悬于适量细胞培养基中，使细胞浓度达到1 × 10⁷ cells/mL，并将离心管置于冰上。
   注：这些非CD4⁺细胞主要由巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等抗原呈递细胞（APC）组成。在本实验方案中，这些细胞作为APC富集的非CD4⁺组分使用。
7. 将第5.5步收集的全部CD4⁺ T细胞离心，弃去上清液，获得细胞沉淀。
8. 按每1 × 10⁸个初始总细胞向细胞沉淀中加入900 µL MACS缓冲液和100 µL抗PE微珠。轻轻混匀，于4 °C避光孵育15分钟。
9. 将MS柱置于相应的MACS分选磁性分离器上，用500 µL预冷的MACS缓冲液冲洗柱子。待柱内缓冲液完全流尽后再进行下一步操作。
10. 将第5.8步所得细胞悬液缓慢加至MS柱上。当细胞悬液完全流入柱内后，用1 mL MACS缓冲液洗涤柱子2次。将穿流液收集至一个新的15 mL离心管中。
    注：此时穿流液中的细胞为CD4⁺CD25^– T细胞。
11. 将MS柱从磁性分离器上取下，置于一个新的15 mL离心管上方。向柱中加入1 mL MACS缓冲液，然后迅速下压柱塞，以回收被磁珠标记的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞富集组分。
12. 计数细胞后，离心细胞悬液并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于适量培养基中，使最终细胞浓度为2 × 10⁶ cells/mL，并将离心管置于冰上。
    注：这些细胞为CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺调节性T细胞富集组分。通常，每只小鼠可纯化获得约8 × 10⁵至1 × 10⁶个CD4⁺CD25⁺细胞；若加入外周淋巴结，可提高得率。
13. 测定分离所得CD4⁺CD25⁺调节性T细胞富集组分的纯度：分别取5 × 10⁴个分离的CD4⁺CD25⁺调节性T细胞富集细胞和5 × 10⁴个分离的APC富集非CD4⁺细胞，重悬于50 µL抗体溶液中。
    注：通过将抗小鼠CD4 PerCP-Cy5.5抗体和抗小鼠CD25 PE抗体按1:100比例加入FACS缓冲液中配制抗体溶液。此处使用相同的抗小鼠CD25 PE抗体以确认CD4⁺CD25⁺细胞已充分标记，且非CD4⁺组分中无CD4⁺CD25⁺ T细胞残留。如需更严格地鉴定调节性T细胞，还可进行抗小鼠Foxp3 PB抗体的细胞内染色。
14. 于4 °C避光孵育20分钟后，加入2 mL FACS缓冲液洗涤细胞。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中。
15. 通过流式细胞术检测样品纯度。
    注：CD4⁺CD25⁺细胞的比例应≥ 95%，以确保调节性T细胞富集群体的纯度满足实验要求（图2）。作为APC富集组分使用的非CD4⁺细胞中，CD4⁺ T细胞比例不应超过5%（图2）。

6. 使用细胞增殖染料标记初始型 CD4⁺ T 细胞

注意：所有离心条件均为 4 °C、350 × g 离心 7 分钟。使用前将 PBS 缓冲液预平衡至室温。标记过程需避光操作，以避免染料淬灭。

1. 取初始CD4⁺ T细胞悬液，离心后弃去上清液，收集细胞沉淀。
2. 用PBS稀释细胞增殖染料eFluor 450，于室温下配制浓度为20 µM的染料溶液。
3. 每1 × 10⁷个细胞加入0.5 mL PBS。将离心管倾斜约45°，通过上下吹打50次，轻柔重悬细胞。
4. 迅速向细胞悬液中加入等体积的细胞增殖染料溶液，使染料终浓度为10 µM。保持离心管倾斜约45°，通过上下吹打50次混匀细胞，确保细胞与增殖染料充分接触。
5. 立即用铝箔包裹离心管以避光，于室温孵育20分钟。每隔5分钟轻轻涡旋振荡一次，防止细胞聚集。
6. 向离心管中加入10 mL预冷的细胞培养基，轻轻涡旋以终止染色反应，随后离心并弃去上清液。
7. 向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基，离心后弃去上清液，以洗涤细胞。
8. 再次向细胞沉淀中加入5 mL预冷的细胞培养基，并重悬细胞。
9. 计数细胞，离心后弃去上清液，用适量培养基重悬细胞，调整细胞浓度至2 × 10⁶ cells/mL，并将离心管置于冰上保存。

7. 设置 体外 Treg细胞的功能分析

1. 计算细胞培养所需的样本数量，准备适量含有 2.5 µg/mL 抗小鼠 CD3 抗体或指定诱导细胞因子的细胞培养基，并轻轻涡旋混匀已制备的 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 初始 T 细胞、CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ 富集的调节性 T 细胞（Treg）以及富集的非 CD4⁺ 抗原呈递细胞（APC）。
   注意：使用 CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ 初始 T 细胞作为反应性 T 细胞（Tresp）。本示例实验旨在研究 Treg 细胞对 Th1 和 Th17 细胞分化与增殖的影响。因此，细胞培养共设四个样本：在 Th1 或 Th17 诱导条件下培养的 Tresp 细胞，分别在有或无 Treg 富集细胞存在的情况下进行培养。
2. 向 48 孔板中每孔加入 100 µL CD45.2⁺CD4⁺ 初始 T 细胞（每孔 2 × 10⁵ 个细胞）。
3. 向 48 孔板中每孔加入 100 µL CD45.1⁺ 富集的非 CD4⁺ APC 细胞（每孔 1 × 10⁶ 个细胞）。
4. 向实验孔中加入 100 µL CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ 富集的 Treg 细胞（每孔 2 × 10⁵ 个细胞），向对照孔中加入 100 µL 细胞培养基。实验样本中 Treg 富集细胞与 Tresp 细胞的比例为 1:1。
   注意：可根据需要设定 Treg 细胞与 Tresp 细胞的比例，或设计多个不同比例的实验组。共培养体系中 Tresp 细胞数量固定，Treg 细胞数量可根据需要调整。通常实验样本中 Treg 与 Tresp 的比例包括 1:1、1:2、1:4、1:8、1:16 和 0:1。 此外，每个实验条件可设置三个重复孔，以减少随机实验误差。 此处为清晰起见，基于既往研究经验^15,16，以 1:1 比例为例进行说明。
5. 向每孔加入 100 µL 含 2.5 µg/mL 抗小鼠 CD3 抗体的细胞培养基。
   注意：抗小鼠 CD3 抗体的终浓度为 0.5 µg/mL。除实验样本外，需设置不含抗小鼠 CD3 抗体的空白对照样本。在该样本中加入 100 µL 不含抗小鼠 CD3 抗体的 T 细胞培养基，用于测定未增殖 T 细胞的荧光强度，或峰 0 的强度，从而准确校准增殖分布情况。
6. 向每孔加入含指定细胞因子的细胞培养基 100 µL，使每孔终体积为 500 µL。
   注意：本实验中，使用终浓度为 10 ng/mL 的重组小鼠 IL-12 p70 诱导 Th1 细胞，使用终浓度为 2 ng/mL 的重组人 TGF-β1 和 50 ng/mL 的重组小鼠 IL-6 诱导 Th17 细胞。
7. 向其余空孔中加入 PBS（每孔 500 µL），以维持培养板内湿度，减少边缘效应。
8. 将 48 孔板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养 3 天。
   注意：在此共培养体系中，可溶性抗小鼠 CD3 抗体提供 T 细胞活化的初始 T 细胞受体（TCR）信号，而富集的非 CD4⁺ APC 细胞提供共刺激信号，以实现 T 细胞的完全活化。TCR 与共刺激信号也可通过包被于培养板的抗小鼠 CD3 抗体及可溶性抗小鼠 CD28 抗体触发。研究人员可根据需要选择合适的刺激方式。

8. 体外 Treg细胞的功能分析

注意：所有离心条件均为 4 °C、350 × g 离心 7 分钟。

1. 轻轻吹打培养的细胞使其重悬，并将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。离心后弃去上清液。
2. 向每管中加入500 µL含有5 ng/mL PMA、1 µg/mL离子霉素和1:1,000稀释的GolgiPlug蛋白转运抑制剂的细胞培养基，轻轻涡旋混匀以重悬细胞，然后在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育3小时。
3. 离心后弃去上清液，向每个样本中加入50 µL含一测试量Zombie Yellow染料和1:100稀释的抗小鼠CD16/32抗体的PBS溶液，涡旋混匀，并在室温避光条件下孵育15分钟，以标记死细胞并阻断Fc受体。
4. 离心后弃去上清液，加入50 µL表面抗体混合液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育20分钟。
   注：将抗CD4 PerCP-Cy5.5抗体、抗CD45.1 FITC抗体和抗CD45.2 APC-eFluor 780抗体按1:200比例加入FACS缓冲液中，配制表面抗体混合液。
5. 向每根离心管中加入1 mL FACS缓冲液，离心后弃去上清液。
6. 向每根离心管中加入300 µL固定和破膜溶液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育20分钟。
7. 向每根离心管中加入1 mL 1×破膜/洗涤（Perm/Wash）缓冲液，离心后弃去上清液；重复此洗涤步骤一次，以确保彻底去除残留的固定剂。
8. 向每管中加入50 µL细胞因子抗体混合液，涡旋混匀，并在4 °C避光条件下孵育40分钟。
   注：将抗IFN-γ PE抗体和抗IL-17A PE-Cy7抗体按1:100比例加入Perm/Wash缓冲液中，配制细胞因子抗体混合液。
9. 用1 mL Perm/Wash缓冲液洗涤每个样本，离心后弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中。
10. 通过流式细胞术检测Tresp细胞的增殖与分化情况。采用以下设门策略（图3）：首先，在总细胞中圈选淋巴细胞群体，排除细胞碎片和杂质；其次，根据散射光信号在淋巴细胞中圈选单细胞群体；第三，在单细胞中圈选活细胞群体；第四，在活细胞中圈选CD4⁺ T细胞群体；第五，在CD4⁺ T细胞中分别圈选CD45.1⁺ Treg富集细胞群体和CD45.2⁺ Teff细胞群体；第六，在CD45.2⁺ T细胞中进一步圈选CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1细胞、CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17细胞以及未增殖的CD45.2⁺CD4⁺ T细胞。
11. 进行流式细胞术数据采集并分析结果。
    1. 使用标记了细胞增殖染料eFluor 450的培养T细胞作为细胞增殖染料单染对照。使用未标记细胞增殖染料的培养T细胞制备Zombie Yellow染料单染对照。其余每种荧光染料的单染对照均使用补偿微珠制备。
    2. 使用标记了细胞增殖染料eFluor 450但未添加抗小鼠CD3抗体进行培养的T细胞，定义未增殖细胞的设门范围。
    3. 使用标记了细胞增殖染料并经Zombie Yellow染料染色、所有表面抗体染色，以及抗小鼠IFN-γ PE抗体和抗小鼠IL-17A PE-Cy7抗体同型对照染色的培养T细胞，定义IFN-γ⁺CD4⁺和IL-17A⁺CD4⁺ T细胞的设门范围。

结果

在代表性实验中，使用初始T细胞作为Tresp细胞，以研究富含Treg的细胞对Th1和Th17细胞增殖与分化的影响。在该实验中，Tresp细胞通过抗小鼠CD3抗体和富含APC的非CD4⁺细胞激活，随后在IL-12 p70诱导下分化为Th1细胞，或在TGF-β1和IL-6诱导下分化为Th17细胞。在这两种诱导条件下，研究了以1:1比例加入富含Treg的细胞后，Tresp细胞增殖与分化的改变情况。

当CD45.2⁺CD4⁺ Tresp细胞与CD45.1⁺CD4⁺ Treg富集细胞共培养时，在Th1和Th17诱导条件下，未增殖Tresp细胞的比例均显著增加（图4A、B），表明Tresp细胞的增殖在Treg富集细胞存在下受到抑制。此外，在与Treg富集细胞共培养后，CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ T（Th1）细胞的分化受到...

讨论

本研究中，在Th1诱导条件下共培养的结果与既往报道一致，即Treg细胞可抑制Th1细胞的增殖和分化^17,18。在Th17诱导条件下，富集的Treg细胞同样抑制了Tresp细胞的增殖。然而，在本实验所采用的Th17极化条件下，IL-17A⁺ Tresp细胞的比例在Treg富集细胞存在时反而增加，这与以往报道中Treg细胞可抑制Th17细胞分化的结论不同^19,20。这些数据表明，Treg细胞对Tresp细胞的作用可能因诱导条件和检测指标的不同而有所差异。该检测方法可为研究基因修饰或功能改变的Treg细胞功能提供一种体外模型。

这 体外 Treg细胞的功能分析可用于研究Treg细胞对T细胞增殖和极化的影响。相关的共培养方法已被应用于Treg细胞功能的研究中。例如，有研究报道，Treg细胞中的TGF-β信号通路会削弱其...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Thermo Fisher Scientific	3457IW	或同类产品
12.5 μL 滤芯吸头	Thermo Fisher Scientific	94420043	或同类产品
1250 μL 滤芯吸头	Thermo Fisher Scientific	94420813	或同类产品
15 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339650	或同类产品
200 μL 滤芯吸头	Thermo Fisher Scientific	94420318	或同类产品
48 孔板	Corning Incorporated	3548	或同类产品
5 mL 注射器活塞	Shifeng Medical	SB2-061(A)	或同类产品
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Fisher Scientific	339652	或同类产品
50 μL 滤芯吸头	Thermo Fisher Scientific	94420258	或同类产品
70 μm 细胞滤网	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	或同类产品
抗小鼠 CD28 抗体	BioXcell	BE0015-1	或同类产品
抗小鼠 CD3 抗体	BioXcell	BE0001-1	或同类产品
抗小鼠 CD4 PerCP-Cy5.5（RM4-5）	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	或同类产品
抗小鼠 Foxp3 PB（FJK-16s）	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	或同类产品
抗小鼠 IFN-γ PE（XMG1.2）	BioLegend	505808	或同类产品
抗小鼠 IL-17A PE-Cy7（eBio17B7）	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	或同类产品
Beckman CytoFLEX S 流式细胞仪	Beckman Coulter	N/A	用于免疫细胞样本的流式细胞数据采集
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	B2064	或同类产品
C57BL/6 小鼠	上海模型生物研究中心有限公司	SM-001	用于原代淋巴细胞及 T 细胞亚群的分离
CD25 单克隆抗体（PC61.5），PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	或同类产品
CD4+CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒（小鼠）	Miltenyi Biotec	130-091-041	用于细胞分选
CD4+CD62L+ T 细胞分离试剂盒（小鼠）	Miltenyi Biotec	130-106-643	用于细胞分选
CD45.1 小鼠	上海模型生物研究中心有限公司	NM-KI-210226	用于原代淋巴细胞及 T 细胞亚群的分离
CD45.1 单克隆抗体（A20），FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	或同类产品
CD45.2 单克隆抗体（104），APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	或同类产品
CD62L（L-选择素）单克隆抗体（MEL-14），FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	或同类产品
Cytofix/Cytoperm 固定/通透溶液试剂盒	BD Biosciences	554714	或同类产品
eBioscience 细胞增殖染料 eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	或同类产品
乙二胺四乙酸（EDTA）	Solarbio Life Sciences	E1170	或同类产品
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	A5669701	或同类产品
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	用于流式细胞术数据分析的软件
Golgi-Plug 蛋白转运抑制剂	BD Biosciences	555029	或同类产品
HEPES（1 M）	Thermo Fisher Scientific	15630080	或同类产品
人 TGF-β1	PEPROTECH	100-21C	或同类产品
钙离子霉素钙盐	Millipore Sigma	I3909	或同类产品
LD 柱	Miltenyi Biotec	130-042-901	用于细胞分选
L-谷氨酰胺（200 mM）	Thermo Fisher Scientific	25030081	或同类产品
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于细胞分选
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec	130-042-303	用于细胞分选
MS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-201	用于细胞分选
OctoMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-109	用于细胞分选
PBS，pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	或同类产品
PE 大鼠 IgG1，κ 同型对照抗体	BioLegend	400408	或同类产品
PE/Cyanine7 大鼠 IgG2a κ 同型对照抗体	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	或同类产品
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	或同类产品
PMA	Millipore Sigma	P8139	或同类产品
纯化抗小鼠 CD16/32 抗体	BioLegend	101302	或同类产品
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-090-976	用于细胞分选
重组小鼠 IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	或同类产品
重组小鼠 IL-6	R&D Systems	406-ML	或同类产品
红细胞裂解缓冲液（ACK 裂解缓冲液）	Thermo Fisher Scientific	A1049201	或同类产品
RPMI 1640 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875093	或同类产品
丙酮酸钠（100 mM）	Thermo Fisher Scientific	11360070	或同类产品
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061	或同类产品
UltraComp eBeads 补偿微球	Thermo Fisher Scientific	01-2222-42	或同类产品
Zombie Yellow 可固定活力检测试剂盒	BioLegend	423104	或同类产品
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148	或同类产品