利用自动液滴微流控平台高通量筛选L-乳酸高产 芽孢杆菌凝血蛋白 突变体

摘要

该方案为工业微生物提供了标准的高通量筛选流程。该方法包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动微流控进行阳性滴滴筛查，随后验证结果。通过筛选高产 的B. coagulans 菌株验证了工作流程的可靠性。

摘要

工业生物制造依赖微生物在工程条件下高效合成靶产品。然而，野生型菌株由于其原生代谢网络的限制，往往缺乏实现这一能力。因此，快速且准确地筛选大型突变体文库中的高性能菌株，是工业微生物育种中的关键一步。近年来，液滴微流控技术因其高通量、低消耗和单细胞隔室化能力而备受关注，促使众多单细胞分选系统的发展。本研究介绍了利用自动液滴微流控平台进行工业微生物菌株高通量筛选方案。该集成工作流程包括四个关键阶段：通过大气和室温等离子体（ARTP）诱变构建突变体库;高效单细胞包裹和在皮科里特级液滴中的受控微培养;精确注射荧光生物传感器，随后进行荧光激活液滴分选（FADS），以分离含有高产变体的液滴;并通过微板和摇瓶发酵验证选出的候选菌株。一个完整且集成的筛选流程旨在作为标准化模板，并通过分离高产率的L-乳酸产B . cogagulan突 变体作为具体例子，验证其验证。这一自动化高通量筛选平台提供了强大的技术解决方案，具有极大潜力加速高性能品系的工业育种。

引言

工业生物技术利用微生物和酶作为生物催化剂，大规模生产有价值的产品。这种方法被认为比传统化学制造更环保且高效。然而，微生物的自然代谢网络已进化出优先考虑自身生存和繁殖，而非高效合成人类期望的产物。因此，满足工业生产环境要求的^{严格条件1、2、3}，常常需要高通量微生物育种。该过程包括通过物理或化学诱变快速构建大规模微生物突变体文库，随后培养并检测具有不同基因型的突变体。随后只选出极少数优良菌株。然而，传统的板基和微板筛查技术因繁琐的程序、低通量和高成本而受限。这一瓶颈，加上消耗品和试剂的大量消耗，导致微生物育种的整体效率较低 ^4,5。

液滴微流控技术最近成为这一挑战的变革性解决方案。与荧光激活细胞分选（FACS）不同，FACS因分子迅速扩散而不适合筛选分泌产物，荧光激活液滴分选（FADS）则封装在皮科里特级、区室化微反应器^6,7,8中。这种物理隔离防止了菌株竞争，使分泌代谢物能够局部积累，并通过荧光生物传感器定量检测。因此，FADS已被证明是多种细胞外产物（包括氨基酸、有机酸和酶）高通量筛选的理想平台。一个团队开发了基因编码的荧光生物传感器GECFINDER，并与FADS结合，成功筛查了高苯丙氨酸产株，并将筛查效率提高了1000^倍以上。另一组建立了荧光激活液滴分选平台，结合基因编码生物传感器，用于高通量筛选大肠杆菌中产生3-脱氢即干酸菌株，优化后的FADS系统大幅提升筛选效率，并实现了显著提升产能的突变株的分离能力¹⁰.一些研究人员将FADS技术应用于Bst DNA聚合酶的工程设计，获得了具有显著增强热稳定性和链置换活性的突变体进一步应用于LAMP检测，使反应时间从40分钟缩短至10分钟¹¹分钟。

然而，将这些技术进步转化为常规工业应变开发工作流程仍具挑战。许多商业液滴微流控系统，尽管硬件先进，但缺乏完整、直观且可重复的标准操作程序，专门用于微生物表型筛选。为弥补这一空白，采用了集成模块化流体控制、用户友好软件和标准化芯片设计的自动化液滴微流控平台，为建立完全集成的筛选工作流程奠定了理想的技术基础。本研究以高产L-乳酸的B . coagulans 的高通量筛选为验证案例。基于液滴微流控平台，建立了以下工作流程，包括四个关键连续步骤：（1）通过大气和室温等离子体（ARTP）诱变构建多样化突变体文库;（2）在优化B . coagulans 生长和L-乳酸生成条件下，实现高效单细胞封装和液滴内受控微培养;（3）精确注射L乳酸特异性荧光生物传感器，随后高速分选包裹优质生产者的液滴;以及（4）通过摇瓶发酵对分选候选物进行严格验证，以确认产量增强和遗传稳定性。该方案面向从事工业微生物育种、需要高通量筛查细胞外产物的研究人员和工程师。它特别适合分泌小分子代谢物或酶的培养细菌。筛选平台必须配备与液滴微环境兼容的传感器，以实现目标代谢物的特异性检测。对于具有特殊培养要求的菌株（如严格厌氧菌），培养参数可以调整以优化并建立专门的培养策略。通过建立这一闭环、标准化筛选流程，本研究旨在为加速工业化菌株育种提供强大且可迁移的解决方案。

方案

本研究无需伦理审批。所有实验均使用纯微生物培养进行，未涉及人体受试者或实验动物。有关以下协议中使用的所有材料，请参见 材料表 。

1. 准备工作

注意：遵守生物安全规范。 凝血B. 是生物安全等级1的生物。戴手套和实验服。所有开放式操作均在层流罩内进行。所有接触活细胞的材料在121°C下高压灭菌20分钟后再弃置。

1. 应变源与维护
   1. 从商业培养收集中心购买 B. coagulans ATCC 7050，作为第二代斜向培养物。
   2. 将斜向培养液一圈划入种子培养基琼脂，并在50°C下孵育24小时。选取一个菌落，将其接种到液态种子培养基中，在50°C、200转/分钟下生长12小时。
   3. 将所得培养液与无菌40%甘油混合至最终浓度25%（v/v），并在–80°C下冷冻保存。 每次实验时，解冻新鲜的铝箔，划线到种子中质琼脂上，并在50°C下孵育24小时。
   4. 然后选取单个菌落，将其接种到液态种子培养基中，并在50°C、200转/分钟下培养12小时，然后用于诱变和筛选（补充图1）。
2. 乳酸传感器
   1. 如补充材料¹² （补充图2）中描述的，表达并纯化eLACCO1.1传感器。
   2. 在纯化后的传感器中补充5%（v/v）甘油，并储存在–80°C。 每次实验中，先在冰上解冻一个分量，并立即用无菌10 mM PBS（pH 7.4）稀释至最终工作浓度0.1 mg/mL。
3. 培养基的制备
   1. 种子培养基（g/L：葡萄糖20，酵母提取物5，色酮10，醋酸钠2，柠檬酸钠2，K2 HPO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.2，MnSO₄·H₂O 0.05，FeSO₄·7H₂O 0.01）。将葡萄糖单独以200克/升高汤形式在115°C下消毒20分钟。
      1. 将剩余部件在121°C高压釜釜消毒15分钟。冷却后，加入无菌葡萄糖库存至最终浓度20克/升，然后过滤灭菌微量元素。
      2. 将整个培养基在4°C下保存最长一周。用于夜间激活和接种制备。
   2. 筛选介质（克/升：葡萄糖20，酵母提取物6.66，氯化钠0.333，NH4氯0.665，KH2氯气4，氯化氢4，氯化氢4_{，高压氧4}，氯化氢4，氯化钙20.074）。
      1. 将葡萄糖单独消毒，115°C20分钟。将盐/酵母提取物混合物在121°C下高压灭菌15分钟。
      2. 冷却后，将无菌葡萄糖高汤加入20克/升。以4°C保存，最多一周。作为液滴生成的水相，并在10小时培养过程中作为液滴内培养基。
   3. 发酵培养基（克/升：葡萄糖90，色酮13.33，酵母提取物13.33，醋酸钠0.67，NaCl 0.0133，MgSO₄·7H₂O 0.0133，MnSO₄·H₂O 0.0133，FeSO₄·7H₂O 0.0133）。
      1. 将葡萄糖作为500克/升的保鲜液在115°C下消毒20分钟。将其他组分在121°C高压灭菌15分钟。
      2. 冷却后，将无菌葡萄糖高汤加入90克/升。接种前加入无菌_CaCO3 粉末（4% w/v）以缓冲pH值。每天新鲜准备。用于微板初级筛选和摇瓶验证。
         注意：所有培养基均用蒸馏水准备至最终体积为1升。将pH值调整至6.5，含1百万盐酸。

2. 使用 ARTP 构建突变体库

注意：ARTP操作涉及高频等离子体和紫外线灯。紫外线辐射可能导致眼睛和皮肤受伤。等离子体排放会产生臭氧和高温。等离子体开启时，务必关闭舱门。穿上实验服和防紫外线护目镜。仅使用99.999%纯氦;确保通风充足。每次诱变操作后，用浸有75%乙醇的无绒布擦拭工作台和诱变室内壁。75%的乙醇高度易燃。远离明火、火花和高温表面。

1. 建立一条标准曲线，将OD₆₀₀ 与可活细胞浓度相关联。
   1. 将单一群 凝血B. coagulans 接种到种子培养基中，并在50°C、200转/分钟下孵育12小时，直到培养达到对数中期。
   2. 准备细菌悬浮液的连续稀释，梯度为10、⁴、10、⁵和106^。
   3. 移液器取每种稀释液100微升，均匀地三份均匀涂抹在种子培养基琼脂板上。
   4. 将所有镀金琼脂平板在50°C下孵育24小时。
   5. 计算每种稀释的菌落形成单位（CFU）。
      注：校准显示OD₆₀₀ = 0.5约对应1×10⁸ CFU/mL。利用该关系确定液滴包裹的初始细胞密度（补充图3）。
2. 培养B . cogullan 至中后对数阶段，然后在新鲜种子培养基中稀释至OD₆₀₀ = 0.05。
3. 在层流罩内，准备八个无菌小金属盘和一个大金属盘。将这八个小圆盘放在酒精炉上燃烧1分钟，然后放在无菌的大圆盘上，冷却10分钟。
4. 使用微量移液器均匀将10微升稀释的细菌悬浮液均匀涂抹在八个冷却小圆盘上。
5. 将携带接种小椎间盘的大椎间盘转移到无菌培养皿中。
6. 打开ARTP仪表，启动主控屏。打开诱变室里的紫外线灯。启动冷水机并预冷20分钟，直到温度稳定在20°C。
7. 迅速打开诱变室门，把小圆盘放进去。
8. 使用无菌产钳，依次将每个小盘转移到ARTP采样台上。
   注：射频功率、氦气流量、喷嘴到样品距离和氦气纯度分别固定为120瓦、10 SLM、2毫米和99.999%。氦气照射时间分别设定为5、10、15、20、25和30秒。
9. 根据设定参数对每个小椎间盘进行ARTP诱变。照射后，将所有椎间盘转移到一个50毫升的离心管中，管内有10毫升的回收介质。在50°C下孵育，摇晃200转/分钟，4小时以促进细胞恢复和生长。
10. 致死率的确定。
    1. 将回收的培养物连续稀释至^10-2 到^10-6的梯度。
    2. 将每种稀释液100微升涂抹在种子培养基琼脂平板上，并每次稀释准备三次复制品。
    3. 将所有平板在50°C下孵育24小时。
    4. 计数菌落数，计算相应的CFU/mL。
    5. 使用以下公式计算致死率：
       （1）
       注意：对每个时间点进行三份实验。在这种情况下，ARTP的最佳诱变时间为20秒（补充图4）。

3. 自动液滴微流控平台及消耗品的组成

1. 执行系统（图1）
   注意：它由3个高精度压力控制器组成，压力范围为0–1000毫巴，压力响应时间为<50毫秒（见图1A）。
2. 成像系统
   注：高速CMOS显微成像具备≥2 GB/s的高速图像采集，帧率为0–20,000 fps，最大分辨率为1280 x 860。该系统具备自动对焦功能，可实时观察水滴运动，并支持录制图像和视频，这些视频可导出多种格式，包括BMP、AVI、MP4和TIF。
3. 检测系统
   注意：它支持2个激光器（488 nm和633 nm）以及两个探测通道的荧光信号检测。
4. 主机控制系统
   注意：该系统由自动液滴微流控平台软件控制，集成多个模块，包括流体驱动、显微成像、激发与检测、液滴生成、微型注入和分选。它还支持实验数据的采集、记录、存储、显示和导出。自动液滴微流控平台的部分操作单元（图1B）显示。
5. 消耗品
   注意：本协议中使用的消耗品包括：油相、样品和试剂注射管（图2A）;用于液滴孵育的收集管（图2B）;液滴生成芯片（图2C）;液滴微粒注射芯片（图2D）;以及液滴分选芯片（见图2E）。

4. 液滴生成

注意：清洁自动液滴微流控平台。每次实验结束后，用无绒布湿巾用75%乙醇擦拭舞台、芯片架及任何溢出区域。去除残留的氟化油、电池悬浮液或传感器溶液。

1. 单单元封装。要获得λ = 0.1,14个pL液滴中，将细菌悬浮液稀释为OD₆₀₀ ≈0.04（OD₆₀₀=0.5对应1 ×^{10 8} CFU/mL）。根据泊松分布：
   (2)
   当λ = 0.1时，90.5%的液滴为空，9.1%含有单个细胞，0.4%含有多个细胞。
   注：在此案例中，测得的单细胞封装效率为11.2%（补充图5）。每个液滴的细胞数可以通过DAPI染色确定。当λ = 0.1且多细胞包裹速率超过1%时，应降低OD₆₀₀以降低含有多细胞的液滴比例。
2. 将300微升氟化油移液器注入油相入口瓶。移液器将500微升细菌悬浮液注入水相入口小瓶。
3. 撕下覆盖液滴生成芯片表面的胶带。将油瓶、样品瓶和采集瓶依次连接到芯片对应的油井。
4. 把芯片放在舞台上并固定好。根据气体路径标签，将气管逐个连接到进气瓶。
5. 打开自动液滴微流控平台软件。根据芯片上的箭头方向调整舞台移动旋钮，将视场移动到液滴生成点。
6. 在自动液滴微流控平台软件的“液滴生成”界面中点击“开始”（见图3A）。在成像界面中，拖动“Z轴”和光源亮度滑块以调整图像清晰度和亮度。
7. 点击“液滴速度”和“液滴大小”中的“+”和“-”按钮，以调整生成速度和液滴大小。
   注意：在这种情况下，液滴生成的油相压力和样品相压力分别自动设置为300 mbar和400 mbar，以实现1500 Hz的生成速率。在这些设置下，液滴体积为14 pL，液滴直径的CV保持在5%以下，确保液滴大小一致并实现下游运行的可靠。
8. 等待1分钟，直到设备稳定且液滴生成状态保持稳定。迅速更换采集瓶以开始液滴收集。
   注意：在新收集管中预先加入少量氟化油，覆盖特氟龙管的下端口，确保液滴不会直接接触管壁导致熔融。
9. 操作30分钟后停止飞沫收集。点击弹窗中的“停止”以确认停止飞沫生成。
10. 轻轻地将收集管从芯片中取出。将管子和收集瓶垂直放置，等待管内的滴子进入采集瓶。
11. 将芯片、油相入口瓶和水相入口瓶从阶段取出。用75%酒精擦拭舞台表面。随后完成液滴生成阶段。

5. 液滴培养

1. 向收集管加入1毫升矿物油。
   注意：矿物油层覆盖液滴悬浮液，以减少蒸发和氧气暴露，同时允许兼性厌氧菌 B. coagulans有足够的气体交换。
2. 将收集管竖立放入装有无菌水的15毫升离心管中。保持采集管松盖，在45°C下孵育10小时。
   注意：培养后，确保液滴直径的CV为<10%，且未观察到液滴聚合。如果不符合这些条件，请丢弃批次。

6. 微滴注射

注意：在微型注入过程中，通过仪器连接向芯片电极施加高压。电场可能导致严重的电击。高压激活时，不要用金属工具或徒手触摸电极或芯片表面。在处理芯片之前，务必关闭高压输出。请戴绝缘手套并使用不导电工具。

1. 准备油相入口小瓶。在层流罩内，将300微升氟化油移液器注入油相入口瓶。
2. 准备样品入口小瓶。取下装有液滴的收集管上的进瓶盖。换个新盖子。
3. 修剪新入口小瓶的尖端。从新入口瓶的前端切下一小块，使尖端低于样品瓶中液滴的液位。
4. 拧紧盖子。把盖子拧紧，防止漏水。
5. 准备试剂入口小瓶。将500微升乳酸传感器移液器移入试剂入口小瓶。
6. 在试剂入口瓶中加入PBS。同时，向同一试剂入口小瓶加入500微升无菌PBS缓冲液。
   注意：本实验中加入了PBS缓冲液以平衡液滴的pH值。乳酸传感器的最终工作浓度为0.1 mg/mL，乳酸传感器的负载容积为500微升。
7. 用刀片切开覆盖电极阱的胶带，露出电极。将万用表设置为连续模式，测试电路连接和芯片短路状态。
   注意：如果万用表显示芯片电极的电路连接正常，请继续下一步。如果电路断开，更换注入芯片再测试一次。
8. 确认万用表电路连接正常后，撕下芯片表面的磁带。将油瓶、样品瓶、试剂瓶和收集瓶依次连接到芯片对应的井口。
9. 把芯片放在舞台上并固定好。根据气体路径标签，将气管逐个连接到进气瓶。
10. 打开自动液滴微流控平台软件。根据芯片上的箭头方向调整舞台移动旋钮，将视场移至液滴芯片的电极区域。
11. 在自动液滴微流控平台软件的“液滴Pico注入”界面中点击“开始”（见图3B）。在成像界面中，拖动“Z轴”和光源亮度滑块以调整图像清晰度和亮度。
    注意：此时，仪器会自动将油相泵压力调整为400毫巴，样品相泵压力调整至420毫巴，试剂注入相泵压力调整为450毫巴。
12. 手术初期，导管内的一段空气会被排出到芯片内，这是一种正常现象，持续几分钟。
13. 等待水滴进入视野。点击“开始Pico注射”。此时，设备的电场将被激活。通过点击“液滴速度”、“液滴间距”和“注射量”中的“+”和“-”按钮，调整液滴生成速度、液滴间距和注射量。
    注意：电场设置为默认的最大档位。如果在聚变过程中液滴在电场区破裂，切换到中低档。在这种情况下，液滴注入速率为200 Hz。
14. 请观看高速图像显示软件。如果液滴能以1：1的比例稳定注入乳酸传感器，等待5分钟设备稳定。迅速更换采集瓶以开始液滴收集。
15. 注射稳定2小时后，点击“停止”以结束微型滴注射。
16. 轻轻地将收集管从芯片中取出。将管子和收集瓶垂直放置，等待管内的滴子进入采集瓶。

7. 液滴分选

注意：脱乳剂具有刺激性，可能引起皮肤和眼睛刺激。吸入或吞咽也有害。请始终佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。将去乳剂置于通风良好的区域或排气柜中。将废物脱乳剂收集到一个单独且标明标签的容器中。不要往水槽里倒。

1. 在层流罩中，取出300微升含氟油，加入油相入口瓶。更换含有微注射液滴的收集管入口瓶盖。
   注意：在进行液滴分类实验前，取5微升液滴，并在荧光显微镜下观察。测量至少200个水滴的直径;只有当简历<10%时才继续。
2. 用刀片切开覆盖电极阱的胶带，露出电极。将万用表设置为连续模式，测试电路连接和芯片短路状态。
3. 确认万用表电路连接正常后，撕下芯片表面的磁带。将油瓶、样品瓶和分选收集瓶依次连接到芯片对应的井。
4. 把芯片放在舞台上并固定好。根据气体路径标签，将气管逐个连接到进气瓶。
5. 打开高速成像软件。根据芯片上的箭头方向调整舞台移动旋钮，将视场移至液滴芯片的电极区域。
6. 在自动液滴微流控平台软件的“液滴分拣”界面中点击“开始”。在成像界面中，拖动“Z轴”和光源亮度滑块以调整图像清晰度和亮度。
   注意：点击“开始”后，仪器会自动将油泵压力调整为300毫巴，样品泵压力调整至190毫巴，导致液滴通量为100赫兹。
7. 在手术初期，导管内的一段空气会被排出到芯片内，这一过程持续数分钟，属于正常现象。
8. 点击选择“激光”，选择488纳米检测通道。
   注意：实验人员可根据实验探测设计选择488纳米激光、633纳米激光或两者组合。激光功率：20毫瓦。
9. 点击“数据记录”。仪器将开始获取液滴荧光信号（见图3C）。
   注意：收集5万至10万滴的荧光信号;仪器会自动排序信号值并生成荧光信号直方图。
10. 基于生成的荧光信号直方图，将排序阈值设为总荧光信号的顶端0.1%，并收集高于该阈值的液滴。
    注：本例中，分选门设置为收集荧光>强度为2750（a.u.）的液滴，对应于液滴的前0.1%。
11. 再次点击“数据记录”。仪器将重新记录剩余液滴的荧光信号，并根据第7.10节设定的阈值对目标液滴进行分类。
    注意：剩余的液滴信号也将被自动排序并绘制为荧光直方图。
12. 选中目标液滴区域后，打开“排序开关”并设置“偏转力”值。设备会开始分拣水滴。
    注意：该仪器提供三种可选电场强度等级（高、中、低）。对于大于30微米的液滴，选择高;对于小于25微米的液滴，选择中等或低。这确保了稳定的偏转和最佳的分拣效率。
13. 设备稳定5分钟后，更换采集瓶以收集阳性液滴。
    注意：在分选过程中，仪器会实时持续测量每个液滴的荧光强度，并与预设阈值进行比较。只有荧光强度高于阈值的液滴会被偏转并收集到正极收集管中。如果仪器显示的荧光信号超过分选阈值，并且同时在成像界面中观察到液滴偏转，确认液滴已成功导入正收集通道，则该液滴被视为阳性。
14. 稳定运行4小时后停止液滴分拣。在“液滴分类”界面点击“停止”。
15. 轻轻地将收集管从芯片中取出。将管子和收集瓶垂直放置，确保管内的液滴进入采集瓶。
16. 液滴收集完成后，点击散射图以保存实验散射图、已排序的正性液滴的荧光信号值以及所有液滴的荧光信号值。
17. 将芯片、油相入口瓶、样品瓶和试剂瓶从阶段取出。关闭软件。
18. 液滴去乳化。在液滴收集管中加入500微升1H、1H、2H、2H-全氟奥辛醇。等待5分钟，然后加入500微升新鲜筛选培养基以恢复。
    注意：添加除乳剂后不要剧烈摇晃收集管;轻轻搅拌。液滴去乳后，水相和油相之间会形成清晰的界面。
19. 取20微升脱垢细菌悬浮液，稀释10倍，涂抹在两块琼脂板上。在50°C下孵育2天。
    注意：稀释因子可能会根据收集的液滴数量进行调整。本例中，从这两块板块中获得了约400个单一菌落。

8. 数据导出

1. 点击软件排序界面空白区域的荧光信号图。选择保存液滴荧光信号散射图、荧光信号直方图和Excel电子表格，这些表格包含总液滴数的荧光强度值以及筛查过的正性液滴的荧光强度值。

9. 微板初级筛查

1. 随机选择单个殖民地。
2. 接种24孔深井板以进行膨胀培养。选取每个选定的菌落，并将其接种到一个24孔深孔板的一个孔中，该板内有2毫升发酵培养基。使用接种环。
3. 用不可透气膜密封24孔深井板。
   注意：不要使用透气膜。它会导致培养基蒸发。
4. 孵化扩张文化。将密封的24孔深孔板放入摇晃培养箱中，温度为50°C，转速200转/分钟，保存24小时。
5. 用于发酵验证的亚文化。24小时后，将每个孔中200微升的培养液转移到一个新的24孔深孔板中，该板内含有1.8毫升发酵培养基（10% v/v接种量）。在接种前将无菌_CaCO3 加入最终浓度为4%（w/v）的每个井中以缓冲pH值。
6. 包含控制措施。在每个新鲜的24孔深孔板中，随机填充三个随机选取的孔，反对株ATCC 7050为负对照。处理时要与候选菌株完全相同。
7. 用不可透气膜密封24孔深井板。
8. 孵化24孔深井板。将密封的平板放入50°C、200转/分钟的摇晃培养箱中，浸泡24小时。
9. 准备乳酸检测样本。用5842× 克 离心机加热板10分钟。将10微升上清液转移到96孔黑板，并用990微升超纯水稀释。搅拌均匀。
10. 加装乳酸传感器。将稀释样品100微升加入新96孔黑板的每个孔。然后加入100微升乳酸传感器。轻轻搅拌。
11. 测量荧光。将培养皿置于室温下孵育5分钟（避免光照照射）。使用微板读器测量荧光，激发波长为485 nm，发射波长为515 nm。
12. 设置命中选择阈值。计算三组亲对照井的平均荧光（母基）和标准差（SD_parent）。定义阈值为F_parent + 3 × SD_parent。
13. 识别主要命中点。如果候选菌株的荧光信号超过阈值，则视为初级命中。记录主命中次数以供下游验证。

10. 高产量菌株的二次验证

注意：流动相含有稀硫酸（5 mM），具有腐蚀性。避免皮肤接触和吸入。请佩戴适当的个人防护装备（手套、实验服、护目镜）。在通风良好的区域或排气柜中准备并处理流动相。将所有含酸废弃物收集到专用的酸废弃物容器中，以便妥善处理。不要往水槽里倒。

1. 准备种子培养物。初级刺染的菌株在种子培养基琼脂板上。在50°C下孵育24小时。从每个培养皿中选取一个菌落，并将其接种到30毫升液态种子培养基中，装入250毫升的摇瓶中。在50°C、200转/分钟下孵育12小时。
2. 准备发酵。准备发酵培养基，加入无菌的CaCO3粉末，最终浓度为4%（w/v），作为pH中和剂。将5毫升种子培养物转移到45毫升该培养基中，装入250毫升Erlenmeyer瓶（10% v/v接种剂;最终工作量50毫升）。
   注意：每个候选菌株使用三个独立瓶，亲本菌株ATCC 7050作为对照。
3. 孵化瓶子。将瓶子放入摇晃的孵育箱中，温度为50°C，200转/分钟。发酵24小时。
4. 采集样本。24小时后，从每个瓶中取1毫升培养液。离心机压力为13,800× 克 ，持续2分钟。将上清液用超纯水稀释100倍，然后用0.22微米注射器过滤器过滤。
5. 设置高效液相色谱（HPLC）条件。使用Aminex HPX-87H色谱柱。制备流动相：5 mM H₂SO₄ 在超纯水中，通过0.22微米膜过滤，通过超声波脱气。将柱温设定为40°C，流量为0.6 mL/min，注射体积为20 μL，每个样品运行时间为20分钟（乳酸洗脱时间为~12,600分钟）。使用折射率探测器（RID）。
6. 准备标准曲线。将乳酸钙溶解于超纯水中，制备0、0.4、0.8、1.2和1.6 g/L的标准溶液（以L-乳酸钙表示）。将每种标准品三份注射。
   注意：绘制峰值面积与浓度的关系，得到线性回归方程（R² > 0.999）。在每批样品的开始和结束时运行标准样品以纠正漂移。
7. 注射样本。将过滤后的发酵上清液（20微升）注入HPLC系统。记录钙L-乳酸峰的峰值面积。
   注意：每10个样品注射一个质量控制样品（1克/升钙L-乳酸），以监测系统稳定性。可接受的保留时间偏移为<0.2分钟，峰值面积变化<5%，相较初始校准标准。
8. 计算L-乳酸产额。将每个样品的峰值面积插值到标准曲线中，得到钙L-乳酸浓度（g/L）。
   注意：使用分子量比转换为L-乳酸浓度：
   (3)
   计算改进百分比：
   (4)
9. 确定最终的高产品株。选择那些持续表现出高于亲本菌株L-乳酸产额的菌株作为经过验证的突变体。选择表现最佳的演员进行进一步的刻画。

11. 高产量品系的遗传稳定性评估

1. 将选定的突变株划线到种子介质琼脂板上。在50°C下孵育24小时。这是第一代。
2. 从第一代培养基中选取一个菌落，并将其接种到50毫升液态种子培养基中，装入50毫升管内。在50°C、200转/分钟下孵育12小时，获得F1种子培养。
3. 将10%（v/v）第一代种子培养液转移到50毫升发酵培养基（含4% w/v无菌CaCO₃）中，装在250毫升摇瓶中。在50°C、200转/分钟下孵育24小时。
4. 发酵后采集1毫升培养液。在13,800 × g 离心2分钟，将上清液用超纯水稀释100倍，然后用高效液相色谱（HPLC）测量L-乳酸浓度。每代使用三个独立的烧瓶。
5. 要获得下一代，可以将第一代菌株的循环条线条划到新鲜种子培养基琼脂平板上。在50°C下孵育24小时。第二代重复步骤11.2和11.3。
6. 重复亚培养过程以获得第三代和第四代。每代准备三个摇瓶，并用高效液相色谱测量乳酸的产生。
7. 使用单向方差分析（Student t检验）比较四代（1–4代）的产率。如果在不同世代间乳酸产量上没有显著差异（p > 0.05），则该菌株被认为是遗传稳定的。

结果

基于自动液滴微流控平台，建立了高通量筛选模型。通过ARTP诱变构建了一个由B . coagulans 突变组成的突变文库，最佳辐照时间为20秒，致死率约为90%（见图4A）。突变细胞随后被封装成直径约30微米、14 pL的液滴，生成率为1500 Hz（见图4B）。在45°C下潜伏10小时后，传感器以200 Hz速率微型注入每个液滴（见图4C）。使用488纳米激光器在100赫兹频率下进行了荧光激活液滴分选（见图4D）。分选出的阳性液滴被去乳化，并选取单一菌落进行验证。采摘的菌落最初在24孔深井板中培养，内含50°C、200转/分钟发酵介质，培养24小时。每个阱的荧光通过微板读器在激发波长分别为485 nm和515 nm时测量。选取了荧光高于亲本株平均值及三个标准差的克隆。这些候选物进一步转移到250毫升的摇瓶中，接种量为10%，并在相同条件下发酵24小时。L-乳酸浓度最终通过高性能液相色谱法确定（图4E）。

为了验证使用乳酸传感器筛查高L-乳酸产菌株的可行性，首先对该传感器进行了表征。为验证乳酸传感器在微板检测中的可行性，在微量滴定板上加入了L-乳酸标准（1、10、100、10000、100000微米），每孔加入100微升乳酸传感器混合物。结果显示，随着乳酸浓度从100微米升至10毫米，荧光强度会增加。传感器对L-乳酸均表现出强烈的荧光响应（见图5A）。尽管如此，它仍然完全适合本研究，原因有二。首先， B. coagaulans ATCC 7050是一种经过充分表征的L-乳酸生产物，其D-乳酸的形成可忽略不计，这一点由其L-LDH主导的代谢谱所证实。其次，通过与高效液相色谱（HPLC）的比较，验证了传感器在实际发酵样品中L-乳酸定量的准确性（见图5B）。因此，尽管体外对D-乳酸有交叉反应，传感器在筛查流程中仍可靠地报告L-乳酸水平。为验证利用乳酸传感器定量检测乳酸的可行性，测量了传感器在水溶液和筛选介质中的回收率。结果显示筛查培养基的恢复率分别为108.81%和水溶液中的98.39%，相对标准差<5%（见图5C）。介质中略微升高在可接受的90–110%范围内，表明基质干扰不显著。在微板测定中，传感器与L-乳酸标准液1：1混合，培养5分钟，在0–0.6 g/L范围内表现出优异的线性度（见图5D）。此外，荧光方法使得在5分钟内检测到96个样品，比HPLC缩短了384倍的总检测时间。为进一步验证乳酸传感器在液滴筛选中的可行性，制造了含有不同浓度L-乳酸的液滴，并将等量乳酸传感器皮可注射至每个液滴中。液滴的荧光强度通过自动微流控平台检测。结果显示，随着L-乳酸浓度的增加，荧光信号显著向右移动（见图5E）。储存时，乳酸传感器补充5%甘油，储存于-80°C，至少维持一个月的检测稳定性（补充图6）。

除了选择适合利用FADS技术育种的传感器外，确定液滴菌株的最佳培养持续时间也至关重要。培养时间不足可能导致L-乳酸分泌不足，导致荧光信号低，难以区分高产和低产菌株。相反，培养时间过长可能导致L-乳酸过多积累，超过乳酸传感器的检测范围。为解决这一问题，通过动态监测液滴的生长状态，优化了品株的培养时间。菌株在液滴培养6小时时进入对数生长阶段，10小时后液滴中的细菌生物量显著增加（见图6A）。相比之下，当培养时间超过12小时时，液滴表现出明显的收缩。这一现象归因于应变生长后期滴体内的渗透压变化，从而引发液滴收缩。这种收缩可能导致后续实验中不同液滴间的皮孔注入体积不一致。为了确定最佳培养时间，将等量的乳酸传感器注入不同培养时间的液滴中。研究发现，培养10小时后，滴子的荧光信号显著增强;因此，10小时被选为液滴菌株的最佳培养时长（见图6B）。

在单轮筛查中，随后用分选芯片以100 Hz速率分选液滴，持续4小时，并收集荧光强度最高0.1%的液滴（见图6C）。阳性液滴被收集到无菌收集管中，并用500微升的去乳剂和500微升的新鲜种子培养基处理。轻轻摇晃5分钟后，取上层水相20微升，稀释10倍，涂抹在两块固体琼脂板上。在50°C下培养2天后，随机选取200个单菌落，并接种到24孔深孔板中进行扩殖培养。在200个培养克隆中，78个突变菌株的乳酸产量高于亲本菌株（补充图7）。这78个突变体随后进行了摇晃瓶验证，最终获得了17个产量优于亲本品的菌株。其中，突变型ADC-17的提升最大，从57.2 g/L提升至67.04 g/L，提升了17.2%（见图6D）。ADC-17的遗传稳定性在连续四代中进行了评估。四代之间未观察到显著差异（p > 0.05），表明ADC-17的高产性状在连续四个亚培养中保持稳定（见图6E）。 这些结果证明了FADS平台的高效性和可靠性，该平台利用乳酸传感器在单次筛选中富集随机突变文库的高产菌株。

图1：自动液滴微流控平台的组成。 （A） 平台内部结构。它由四个核心模块组成：压力驱动流体控制、高速CMOS成像、488 nm/633 nm双激光荧光检测，以及用于液滴操作和数据输出的主机控制系统。（B） 自动液滴微流控平台操作平台。标识组件包括：a. 安装平台，b. 高速摄像机，c. 芯片电极，d. 芯片固定夹，e. 芯片放置槽，f. 金属浴，g.空气泵1：控制油相，h。空气泵2：控制样品。空气泵3：控制试剂注入。图1A使用Biorender制作，并提供了版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：实验性消耗品。 （A）注射管：用于注入油相、样品细菌悬浮液和试剂溶液。（B）收集管：用于收集液滴并进行后续培养。（C）液滴制备芯片：产生14 pL液滴。（D）液滴微注射芯片：将试剂微注射到液滴中。（E）液滴分选芯片：通过电极分选正应变。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：自动液滴微流控平台的关键软件接口。 （A） 液滴生成软件界面介绍。答：点击开始液滴生成。B. 速度：调整液滴生成率。C。尺寸：调整液滴体积。D. 停止：点击以停止飞沫生成。（B）液滴微型注入接口。E. 注射体积：调整试剂注入量。F. 聚变力：三种电压等级（高/中/低）。（C）液滴分选界面介绍。G. 激光。选择激光类型（488 nm或633 nm）。H. 数据记录。一、偏转力：三种电压等级（高/中/低）。J. 分拣开关：点击开始滴分拣。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：基于自动液滴微流控平台的高通量筛选工作流程。 （A）通过ARTP诱变构建突变体库。（B）液滴生成与孵育。单个细胞被分割在微粒液滴中。（C）。微滴注射。每个液滴中都注入一个荧光传感器。（D）液滴分拣。高荧光（表示L-乳酸生成高）的液滴会被FAD富集。（E）在微板和振动瓶中进行积极克隆验证。缩写;FADS = 荧光激活液滴分选。图4使用Biorender制作，并提供了版权许可。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：乳酸传感器体 外表征。 （A）乳酸传感器对L-乳酸的响应范围。激发/发射 = 485/515 nm。三个独立实验的平均±标准差（n=3，每个实验均有三次技术重复）。（B）与HPLC的相关性。乳酸传感器和高效液相色相色谱分别分析了六个发酵样品（不同时间点）。线性回归给出 R² = 0.9927。激发/发射 = 485/515 nm。（C）乳酸回收实验。L-乳酸以0.5 g/L的浓度掺入超纯水和筛选介质。数据均值±为标准差（n=3个独立实验）。康复率为98.39%（水）和108.81%（筛查培养基），性病<5%。激发/发射 = 485/515 nm。（D） 检测时间优化。传感器与L-乳酸标准液（0–0.6 g/L）混合，孵育时间为0、5、10、15、20、25和30分钟。混合5分钟后，最高^R2 = 0.990。数据来自三个独立实验（n = 3）。激发/发射 = 485/515 nm。（E）液滴荧光直方图。分析了至少2000滴每L-乳酸浓度。检测通道：488 nm，直流（V）= 表示液滴荧光强度的电压信号。缩写;STD = 标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：高通量筛选具有高L-乳酸生成的 B.cogagulans。 （A）在0、2、4、6、8和10小时时观察到液滴中的应变形态。比例杆：20微米。暴露时间：100毫秒。（B） 含 凝血杆菌 液滴在不同时间内培养后荧光强度发生变化，并注射乳酸传感器。图像拍摄时曝光时间为2000毫秒，增益为1500%。比例尺：50微米。（C） 液滴的荧光强度分布。筛查阈值：FL强度>2750（a.u.）。检测通道：488 nm （D） L-乳酸产出亲本株（ATCC 7050）的g/L，并代表性为阳性突变体。数据均值为标准差±（n=3个独立摇晃瓶，每个菌株）。与亲本株相比，p < 0.0001。表现最好的突变体ADC-17显示出17.2%的增长。（E）表现最佳 的B. coagulans ADC-17在连续四代（1–4代）中的遗传稳定性。通过HPLC在24小时摇晃瓶发酵后测定L-乳酸产率。数据均值为标准差±（n = 3个瓶子每代）。单因子方差分析显示各代间无显著差异（p > 0.05，ns）。缩写;HPLC = 高效液相色谱;标准差 = 标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：乳酸传感器eLACCO1.1的纯化过程。 该蛋白用500 mM咪达唑洗脱，并与5%甘油一起储存在-80°C。工作浓度为0.1 mg/mL，检测极限为2 mg/L。补充图1由作者仅使用Microsoft PowerPoint中的原生绘图工具（包括基本形状、线条和文本框）完全重建。未使用第三方图标、模板或外部图片源。所有元素均为作者原创创作。因此，这个数字不需要额外的出版许可。请点击这里下载此文件。

补充图2： B. coagulans ATCC 7050的生长曲线。 该菌株在50°C的种子培养基中培养，摇匀速度为200转每分钟。数据以平均值（n=3个独立培养）表示，均值±标准差。培养过程在约12小时时达到晚对数阶段，这一时间点被用于后续实验中的接种制备。请点击这里下载此文件。

补充图3：B. coagulans ATCC 7050 OD₆₀₀与可存活细胞浓度的校准曲线。制备中期对数阶段培养的连续稀释，并测量OD₆₀₀。通过将100微升适当稀释物涂抹在种子培养基琼脂板上，并在50°C下培养24小时，确定对应的形成菌落单位（CFU/mL）。数据以平均值±表示标准差（SD）（n = 3个独立实验）。根据该曲线，OD₆₀₀ = 0.5 约对应 1 ×^{10 8} CFU/mL。该校准用于确定液滴包裹的初始细胞密度。请点击这里下载此文件。

补充图4： B. coagulans ATCC 7050在ARTP诱变条件下的致死曲线。 细胞暴露于氦浆下的时间不同（5、10、15、20、25、30秒）。照射后，细胞被置于种子培养基琼脂上，并在50°C下孵育24小时后计数CFU。 致死率（%）根据方程（2）计算。数据以平均值 ± 标准差（n = 3 个独立重复）呈现。箭头表示选定的诱变时间（20秒），致死率约为90%。请点击这里下载此文件。

补充图5：通过DAPI染色测定单细胞封装效率。 B. 凝血虫ATCC 7050细胞用DAPI染色，并以λ = 0.1的液滴包裹。共用荧光显微镜观察了2000个小滴，并统计了含有0、1或≥2细胞的微滴数量。观察到的单胞封装效率为11.2%，略高于理论上的泊松预期（λ = 0.1时为9.0%）。这种偏差归因于活性细胞分散、受损细胞的非特异性DAPI染色，以及滴状形成过程中剪切诱导的小团块破裂等因素。比例尺：30微米。至少分析了2000个微小滴。图像拍摄时曝光时间为2000毫秒，增益为1500%。缩写;DAPI = 4′，6-二酰胺-2-苯吲哆。请点击这里下载此文件。

补充图6：传感器存储稳定性。 显示传感器在-80°C下与5%甘油保存四周的荧光响应。未观察到显著信号损失，确认存储稳定性良好（p > 0.05）。请点击这里下载此文件。

补充图7：78个菌株的初级筛查结果显示深孔板中乳酸生成高于对照组。 本次初级筛选共鉴定出78种L-乳酸产值超过母株的突变菌株。所有突变株数据均为单点筛选结果，无生物复制。母株（对照组）作为参考随机分布在24个深孔板上，其数据以三个独立24孔板复制的平均±标准差（n=3）呈现。纵轴显示每个菌株的L-乳酸产额（g/L）;误差条仅显示在父应变控制时。请点击这里下载此文件。

讨论

该方案基于自动液滴微流控平台，为工业微生物筛查提供了标准化工作流程。集成工作流程涵盖突变文库构建、液滴生成与单细胞封装、微反应器培养、生物传感器注入、荧光激活液滴分选以及目标菌株的最终验证。以高产率L-乳酸产生凝血链的高通量筛选为验证案例，该工作流程在改善凝血酵母菌株方面展示了多项优于传统微板和琼脂板方法的优势。在筛选通量和效率方面，该平台利用微流控芯片并行生成和处理数千至数万滴，单轮筛查吞吐量比传统微^{板方法提升}约10.4倍。对于凝血B菌，工作流程可在4小时内筛查10个⁶滴，从而将菌株的发展周期从数周缩短到仅几天，并显著加快繁殖过程。FADS系统的筛查效率约为板式筛分系统的3×10-3倍，同时显著降低了基础设施、人工和消耗品的成本¹³。然而，由于不同微生物的固有特性，需要对该标准工作流程进行有针对性的优化。例如，酵母培养36小时后，渗透压变化导致滴液体积减少，因此需要调整培养时间以确保注射和分^选操作的稳定性。对于丝状真菌，通常需要增加液滴体积，以防止菌丝体生长导致液滴界面断裂或融合^15,16。

此外，由于皮科隆级液滴体积极小，开发针对每个目标产品的定制荧光生物传感器至关重要。多种经典的蛋白酶和小分子代谢物荧光检测试剂已商业化，如过氧化氢¹⁷、糖苷酶¹⁸、乙醇¹⁹和葡萄糖²⁰。然而，化学合成的荧光探针种类有限，且容易从液滴中泄漏到相邻的空液滴中，导致背景荧光升高。这主要归因于疏水性荧光分子能够轻易穿透油-水界面²¹。

近年来，生物传感器主要包括两种类型：基因编码生物传感器和基于转录因子（TF）的生物传感器。基因编码荧光生物传感器指的是可以在细胞内表达并被工程化作为监测体内信号转导传感器的嵌合蛋白。由于其卓越的稳定性、快速的荧光响应和高特异性，遗传编码的荧光生物传感器已被应用于多种情境。一个团队在微流控液滴分选系统中采用基于强度的谷氨酸感测荧光报告器（iGluSnFR），建立了高通量的筛选流程，用于筛选具有增强谷氨酰胺酶产生的淀粉菌突变体。该基于生物传感器的平台实现了56倍富集比，并最终从10个⁵成员全基因组突变体文库中分离出谷氨酰胺酶产生增加超过47%的变异株²³。

基于转录因子（TF）的全细胞生物传感器是一类重要的全细胞生物传感器，围绕转录因子构建。转录因子是一类通过结合特定DNA序列来调控基因表达的蛋白质¹⁴。某些转录因子在与代谢物或外源化合物结合时被激活;这些被称为变构转录因子（aTFs）。一旦激活，aTFs会发生构象变化，进而导致其与目标基因上游的DNA序列解离或结合，从而激活或抑制这些基因的表达。转录因子可以与合成生物学中常用的其他DNA元素（如启动子、核糖体结合位点、终止基因和报告基因）结合，构建基于转录因子的生物传感器遗传回路。这些遗传元件能够感知细胞或环境中各种配体的浓度，并据此做出反应²⁴。赤藓糖醇的检测已成功实现，采用基于转录因子的生物传感器与FADS平台集成，从而分离出具有显著改善赤藓糖醇产能的突变株¹⁴。这两种生物传感器的开发具有极大潜力，推动FADS平台在微生物育种中的应用，克服传统化学探针的局限，扩大可筛选的目标产品范围。

总之，已提出了工业微生物的高通量筛选流程标准。该工作流程的可靠性通过其成功应用于高产L-乳酸产B . coagulans 菌株的筛选得到了验证。该工作流程为未来进行高通量筛选的研究人员提供了宝贵参考。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Agar	贝克顿、狄金森公司	214030	用于固体平板制备
无水乙醇	华药化学试剂有限公司	10009218	擦拭和消毒实验室台面和器具
大气和室温等离子体（ARTP）	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	CP-002	ARTP  用于构建菌株诱变的突变体库。
凝固乳酸芽孢杆菌	北京微生物文化收集中心，BMCC	1511C0004000002355	凝固乳酸芽孢杆菌ATCC 7050被用作诱变的起始菌株和高通量液滴筛选的目标。
黑色微板（96孔）	康宁	3925	96孔黑色微板用于乳酸传感器测定和乳酸浓度的测定。
碳酸钙	华药化学试剂有限公司	20011062	用于分离L-乳酸高产生物。
氯化钙	华药	10005819	氯化钙用于微生物培养基的制备，为微生物生长提供必要的营养。
L-乳酸钙	华药化学试剂有限公司	69027528	用于检测过程中的标准曲线制备样品。
离心管（15 mL）	北京新恒燕科技有限公司	HB53397	用于细菌液稀释
采集管	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	DREMcell-CL	用于收集液滴和随后的培养
计算机	联想	E450	软件安装和DREM Cell控制。
DAPI	索莱宝	c0065	用于细胞染色。
深孔板（24孔）	BKMAMLAB	110424008	用于深孔板对凝固乳酸芽孢杆菌突变体的初步产量验证
乳化破乳剂（1H,1H,2H,2H-全氟辛醇）	麦克林	H817022	液滴破乳剂用于破坏水包油微滴并释放内部细胞、菌株或上清液，以便进行后续检测和分析。
D-葡萄糖	索莱宝	G8150-1000	D-葡萄糖用于微生物培养基的制备，为微生物生长提供必要的营养。
氢氧化铵柠檬酸盐	索莱宝	D9950	氢氧化铵柠檬酸盐用于微生物培养基的制备，为微生物生长提供必要的营养。
无水氢氧化二钾磷酸盐	Sigma-Aldrich	P8281	无水氢氧化二钾磷酸盐用于微生物培养基的制备，为微生物生长提供必要的营养。
DREM软件版本	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	DREMcell v02.01.18	用于控制DREM cell仪器。DREM软件是江苏TMAXTREE生物科技有限公司为DREM Cell仪器开发的专有商业程序。它没有公开的官方访问或下载URL，只在授权下随仪器分发。
液滴捕获微流体细胞分选器（DREM Cell）	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	CP-027	用于高通量单细胞封装和分选，以快速筛选出突变体库中的高产菌株。
液滴生成芯片	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	HC-03-009	液滴生成芯片用于生产单分散皮升（pL）级液滴，用于单细胞封装。
液滴注射芯片	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	HC-03-003	液滴微量注射芯片用于实现精确和痕量试剂注射到预成的液滴中，以进行后续生化反应。
液滴分选芯片	江苏TMAXTREE生物科技有限公司	HC-03-002	液滴分选芯片用于根据荧光信号对包含高产细胞的目标液滴进行分选。
Erlenmeyer摇瓶（250 mL）	四川顺牛玻璃仪器有限公司	B-001006	用于深孔板初筛后凝固乳酸芽孢杆菌突变菌株的扩大培养验证，以确认高产菌株的稳定性和重复性。
滤膜（0.22 μm）	默克	SLGPR33RB	用于发酵液过滤。
荧光倒置显微镜	奥林巴斯	IX73	奥林巴斯IX73荧光倒置显微镜用于观察液滴内的细菌形态
氟化油	Bio-Rad	1864006	氟化油作为水包油微流体技术的连续相，生成稳定、单分散和非干扰的水包油微滴，支持单细胞培养和筛选。
高效液相色谱柱	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	用于根据发酵液中乳酸和其他成分的不同保留特性，将乳酸与其他成分分离，以实现乳酸的准确定量检测。
高效液相色谱	日本丰田	228-34001-02	HPLC用于发酵样品中L-乳酸的定量检测和分析。