在本视频中，我们将向您展示如何利用凝胶内活性检测方法分析人类胚胎干细胞线粒体呼吸链复合物。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体是细胞质中的细胞器，在细胞代谢与稳态、细胞信号网络调控以及程序性细胞死亡中发挥主要作用。线粒体可生成ATP，调控细胞质的氧化还原状态和Ca2+平衡，分解脂肪酸，合成血红素、核苷酸、类固醇激素和氨基酸，并协助蛋白质中铁硫簇的组装。线粒体还在产热过程中具有重要作用。线粒体基因组的突变可导致多种人类疾病。线粒体DNA（mtDNA）突变的累积与衰老相关，且被认为在癌症的发生发展中起重要作用。由于线粒体在所有细胞类型中均具有至关重要的功能，其在干细胞中的功能也必然至关重要。目前在干细胞存活能力、增殖能力及分化潜能方面的研究已取得重要进展，但干细胞的功能活性，尤其是其能量状态，尚未被深入研究。关于人类胚胎干细胞（hESCs）及其分化后的前体细胞的线粒体特性，目前几乎一无所知。要理解并评估线粒体在hESC功能和发育潜能中的作用，一种方法是直接测定线粒体呼吸链复合物的活性。本文中，我们描述了高分辨率天然凝胶电泳结合凝胶内活性显色技术，作为分析hESC中五种呼吸链复合物的方法。
方案
用于线粒体复合物凝胶内活性检测的高分辨率透明天然凝胶电泳（hrCNE）
人类胚胎干细胞（hESCs）在经ɣ射线照射或丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）单层上维持培养，随后在标准条件下，于MEF条件培养基中转移到Matrigel上培养5天。为去除污染的MEFs，将hESCs重新接种于Matrigel上，并在MEF条件培养基中继续培养额外3天。通过免疫荧光显微镜检测多能性标志物Oct-4和SSEA-4，以确认hESCs未发生分化。
- 用预热的 1× PBS（pH 7.4）洗涤细胞，随后进行胰蛋白酶消化（6 孔板中每孔加入 1 ml 1× 胰蛋白酶），消化 5 分钟。
- 加入等体积的新鲜胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml 溶于 1× PBS，pH 7.4）。收集细胞并在室温下以 200g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于 0.8–1.7 ml 冰冷的线粒体分离缓冲液（83 mM 蔗糖；6.6 mM 咪唑/HCl，pH 7.0）中（体积根据细胞沉淀大小确定），并加入新鲜配制的 1× 蛋白酶抑制剂混合物。冰上孵育 10 分钟。
- 使用玻璃匀浆器（Dounce 匀浆器）匀浆细胞（约 40–50 次）。取部分匀浆后的细胞样品用台盼蓝染色，并在光学显微镜下检查匀浆是否完全。
- 在 4°C 下以 20,000g 离心 10 分钟，获得粗制线粒体沉淀，其中还含有细胞核及较大的细胞碎片。倾去并弃除上清液，称量沉淀的粗制线粒体沉淀。若需暂停实验，可将沉淀立即在液氮中速冻后于 -80°C 保存。
注意：可采用差速离心或其他基于梯度的方法分离并收集纯化的线粒体膜组分。详见参考文献 4。该替代方法将提供每毫克线粒体蛋白的线粒体复合物活性，而非每毫克细胞重量或每细胞数量的复合物活性。为进行此类比较，需在纯化后测定线粒体蛋白浓度。此外，该方法可能需要使用不同的分离缓冲液。关于纯化线粒体膜组分的溶解方法，请参见下文第 6 步后的说明。 - 在冰上通过涡旋将粗制线粒体沉淀溶于冰冷的溶解缓冲液（50 mM NaCl，50 mM 咪唑/HCl，pH 7.0，1 mM EDTA，2 mM 6-氨基己酸）。6-氨基己酸可用 1× 蛋白酶抑制剂混合物替代。每 20 mg 沉淀重量使用 35 µl 溶解缓冲液。每 20 mg 沉淀重量加入 20 µl 10% w/v 胆固醇苷（digitonin），并通过轻弹管壁混匀。冰上孵育 5–10 分钟。可使用十二烷基-β-D-麦芽糖苷（dodecyl-β-D-maltoside）或 Triton X-100 替代胆固醇苷以溶解蛋白。去垢剂的种类及其用量可能影响线粒体复合物超复合物或多聚体形式的形成。更多信息请参见参考文献 1。
注意：溶解纯化线粒体膜组分所需的去垢剂用量对应于去垢剂与蛋白的重量比，范围为 2–6 g/g。溶解线粒体膜的最佳比例为：十二烷基-β-D-麦芽糖苷 2.5 g/g，Triton X-100 为 3 g/g，胆固醇苷为 6 g/g。 - 将溶解后的沉淀在 4°C 下以 100,000g 离心 15 分钟，收集澄清的上清液。
- 加入上样缓冲液，使终浓度为 5% w/v 甘油和 0.01% w/v 亮蓝 G（Ponceau S）（可使用 50% w/v 甘油和 0.1% w/v 亮蓝 G 的上样缓冲液储备液）。
- 每泳道上样体积应包含 20–40 mg 粗制线粒体沉淀。使用具有 3.5% 浓缩胶的丙烯酰胺梯度胶（4–13%）。
注意：凝胶制备与电泳条件：
凝胶制备时使用丙烯酰胺/双丙烯酰胺（AA/bisAA）3 混合液，具体如下：48 g 丙烯酰胺和 1.5 g 双丙烯酰胺（49.5% T，3% C；其中 T 表示丙烯酰胺与双丙烯酰胺的总浓度，C 表示交联剂（双丙烯酰胺）占总单体的百分比）。
凝胶缓冲液（3×）：1.5 M 6-氨基己酸；75 mM 咪唑，pH 7.0
| 梯度胶： | 4% | 13% | 浓缩胶： | 3.5% |
| AA/bisAA 3 混合液 | 2 ml | 6.5 ml | 0.6 ml | |
| 胶缓冲液 3´ | 8.3 ml | 8.3 ml | 2.7 ml | |
| 甘油 | 5 g | |||
| H2O | 14.7 ml | 5 ml | 4.7 ml | |
| 总体积 | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| 10% APS | 139 µl | 125 µl | 67 µl | |
| TEMED | 14 µl | 12.5 µl | 6.7 µl |
阳极缓冲液：25 mM 咪唑/HCl，pH 7.0
阴极缓冲液：50 mM 三羟甲基氨基甲烷丙酸（Tricine），7.5 mM 咪唑/HCl，0.02% w/v 十二烷基-β-D-麦芽糖苷，0.05% w/v 脱氧胆酸盐，pH 7.0
在低温室（4–7 °C）中灌胶和电泳。初始电压为 100 V。当样品进入浓缩胶后，将电压升至 500 V，同时将电流限制在 15 mA（适用于 0.15 × 14 × 14 cm 的凝胶）。当清晰的红色 Ponceau S 染料条带接近凝胶前沿时，电泳结束，通常需 3–4 小时。或者，也可在 70–100 V 恒定电压下过夜运行凝胶。
- 凝胶内活性测定。每种测定的孵育时间取决于蛋白质溶解效率和每孔上样量。复合物 I、IV 和 V 通常产生的信号强于复合物 II 和 III。
复合物 I (CI)
将凝胶切片在CI缓冲液（5 mM Tris-HCl，pH 7.4；0.1 mg/ml NADH；2.5 mg/ml NBT）中室温孵育数小时。
复合物 I 缓冲液：每 100 ml 添加 5 mM Tris-HCl，pH 7.4：
0.01 g NADH
0.25 g NBT
将凝胶置于50%甲醇和10%乙酸中固定15-45分钟。固定后的凝胶保存在10%乙酸中。
复合体 II (CII)
将凝胶切片与CII缓冲液（20 mM琥珀酸钠；0.2 mM吩嗪硫酸甲酯；2.5 mg/ml NBT；5 mM Tris-HCl，pH 7.4）在室温下孵育数小时。
CII 缓冲液：每 100 ml 添加 5 mM Tris-HCl，pH 7.4：
200µl 1M 溶液琥珀酸钠
80 µl 苯嗪硫酸甲酯（250 mM PMS 溶于 DMSO）
0.25 g NBT
按照复合物 I 的方法固定凝胶
复合物 III (CIII)
将凝胶切片在室温下用CIII缓冲液（50 mM磷酸钠，pH 7.2；0.05% 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB））孵育数小时。
CIII 缓冲液：每 100 ml 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中加入：
50 mg 二氨基联苯胺四盐酸盐
按照复合物 I 的方法固定凝胶
复合体 IV (CIV)
将凝胶切片与CIV缓冲液（50 mM磷酸钠，pH 7.2；0.05% 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）；50 µM马心细胞色素c）在室温下孵育数小时。
CIV 缓冲液：每 100 ml 50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中加入：
50 mg 四盐酸二氨基联苯胺
0.1 g 马心细胞色素 c
按照复合物 I 的方法固定凝胶
复合物 V (CV)
将凝胶切片在室温下用CV缓冲液（35 mM Tris碱，270 mM甘氨酸，pH 8.3（25°C时），14 mM MgSO4，0.2% w/v Pb(NO3)2，8 mM ATP）孵育数小时。
CV 缓冲液：每 100 ml 溶液中加入：
| Tris-base | 0.424g |
| 甘氨酸 | 2.026g |
| MgSO4 | 0.345g |
| Pb(NO3)2 | 0.29g |
无需调节pH值（应为8.3）—禁止使用酸或碱。过滤后加入
| ATP | 0.441g |
将凝胶置于50%甲醇中固定30分钟，然后转移至水中。
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讨论
在本视频中，我们介绍了从人类胚胎干细胞中提取线粒体蛋白复合物，通过高分辨率透明天然凝胶电泳（hrCNE）进行分离，以及随后通过凝胶内催化活性检测进行分析的方法。hrCNE 分离线粒体膜蛋白复合物的分辨率与蓝色天然凝胶电泳相当，并且更适用于凝胶内活性检测。该技术不仅可用于定量分析线粒体呼吸链复合物 I-V，还可用于分析人胚胎干细胞及其分化后代中任何线粒体膜蛋白复合物的亚基组成。
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致谢
Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究目前由加州再生医学研究所（CIRM）的种子基金 RS1-00313 资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）的 Carla Koehler 博士及 Koehler 实验室成员在本研究及其他相关研究中提供的建议与指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | 用 NaOH 调节 pH 至 8.0 |
| 1 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M 丁二酸钠 | Fisher Scientific | S413-500 | |
| 0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.2 | Fisher Scientific | BP332-1 和 BP329-1 | 将68.4 ml的1M Na₂HPO₄与31.6 ml的1M NaH₂PO₄混合，配制25 °C下pH为7.2的0.1M磷酸钠缓冲液 |
| 1 M Tricine，pH 7.0（用 NaOH 调节） | EMD Millipore | 9010 | 4 °C 保存 |
| 1 M 咪唑/HCl，pH 7.0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | 4 °C 保存 |
| 1 M Tris-HCl，pH 7.4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (wt/vol) 十二烷基-β-D-麦芽糖苷 (DDM) | Fluka | 44205-500MG | 溶于水。将1 ml等分试样储存于 –20 C |
| 10%（wt/vol）digitonin（>50% 纯度，未经重结晶直接使用 | Fluka | 37008-1G | 溶于水。储存 0.1–1 ml 等分试样 –20 ℃。使用前应预热至 95 ℃。 |
| 2M 6-氨基己酸 | Fluka | 07260-100G | 4 °C 保存 |
| 10倍Ponceau S/甘油储存液 | Sigma-Aldrich | P-3504 和 G6279-1L | 0.1% Ponceau S，50% 甘油（wt/vol），溶于水。 |
| 10% w/v 脱氧胆酸钠 | Fluka | 30970-25G | 溶于水。需避光保存。用 HCl 调节 pH 至 7.0，过滤后室温储存。 |
| 250 mM 酚嗪甲基硫酸盐（PMS） | TCI America | P0083 | 溶于DMSO并分装。储存于 –20 C |
| 氮蓝四唑（NBT） | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’四盐酸3,3'-二氨基联苯胺（DAB） | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris 碱 | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | G45-212 | |
| 腺苷5′’三磷酸腺苷二钠盐（ATP） | Sigma-Aldrich | A2383-5G | 1级，纯度不低于99% |
| β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型（NADH） | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| 来自马心脏的细胞色素c | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100倍蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | 储存于 – 20 C |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher Scientific | D128-500 | |
| 0.4% 台盼蓝染色液 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x 胰蛋白酶（0.5%） | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15400-054 | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 17075-029 |
参考文献
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
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