通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

摘要

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。

摘要

通过病毒转导 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc，可诱导已分化的鼠类细胞重获多能性（Takahashi 和 Yamanaka，2006；Wernig 等，2007；Okita 等，2007；Maherali 等，2007）。我们设计了一种重编程策略，其中这四种转录因子由多西环素（dox）诱导型慢病毒载体表达（Brambrink 等，2008）。利用这些可诱导的构建体，我们能够从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中获得诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。在本视频中，我们演示了生成表达这四种转录因子的可诱导慢病毒的方法，并展示了如何用这些病毒感染 MEFs 以产生 iPS 细胞。通过使用可诱导的慢病毒，可通过向培养基中添加多西环素来精确控制这四种因子的表达。与传统的逆转录病毒感染相比，该系统的优势在于能够开关基因表达，从而可详细分析重编程的动力学过程以及基因表达的需求条件。

方案

步骤 1：

解冻293细胞并接种以进行慢病毒生产。

1. 在15 ml离心管中准备9 ml DMEM+培养基。
2. 从液氮罐中取出一管冷冻保存的293细胞，放入37°C水浴中，直至大部分（但非全部）细胞融化。
3. 将细胞从冻存管中移出，并加入第1步的15 ml离心管中。
4. 以180g离心5分钟，弃去上清液。
5. 用10 ml DMEM+培养基重悬细胞，转移至经明胶包被的100 mm培养皿中。将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中培养，直至细胞融合度达到80–90%。
6. 传代293细胞：用PBS洗涤细胞，吸除PBS，每10 cm培养皿加入4 ml 0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA，于37°C孵育1分钟。
7. 轻敲培养皿使细胞脱落，用10 ml DMEM+培养基重悬，转移至15 ml离心管中。以180g离心5分钟，吸除上清液。
8. 加入适量DMEM+培养基，通过反复吹打数次将细胞团块分散为单细胞悬液。
9. 计数细胞数量，并用FP培养基调整细胞浓度至每毫升8×10⁵个细胞。
10. 按每100 mm培养皿接种8×10⁶个细胞（10 ml）的量接种细胞，于37°C、5% CO₂条件下过夜培养。

步骤 2：

用慢病毒质粒转染293细胞并收集病毒

1. 每个10 cm培养皿使用10 µg的FUW-tetO-cDNA（Oct4、Sox2、Klf4或c-Myc）慢病毒骨架质粒，以及2.5 µg的pMD-G质粒和7.5 µg的pPax2质粒。
2. 将上述三种质粒分装至一个离心管中，同时将30 µl Fugene 6转染试剂加入另一含有500 µl无血清DMEM的离心管中，轻轻弹击管壁混匀，并于室温孵育5分钟。
3. 将DNA混合物逐滴加入含Fugene 6/DMEM的离心管中，轻轻弹击管壁混匀，室温孵育20分钟。
4. 将DNA/Fugene 6复合物逐滴加入293细胞培养皿中，于37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。
5. 次日早晨：吸除含转染试剂的培养基，加入5 ml新鲜的胚胎干细胞（ES细胞）培养基，将细胞放回培养箱继续培养。
6. 转染后48小时和72小时，使用10 ml无菌一次性注射器收集293细胞的培养上清，经0.45 µm孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后，转移至15 ml离心管中。
7. 通过超速离心浓缩病毒上清。将病毒沉淀重悬于所需体积的缓冲液中，并等体积混合含有Oct-3/4、Sox2、Klf4和c-Myc慢病毒的培养基，制成混合病毒液。
8. 在制备病毒的同时，将Oct4-neo/rtTA或Oct4-GFP/rtTA MEF细胞（传代数<3）接种于10 cm培养皿中，使其达到约90%融合度（每皿2×10⁶个细胞）。
9. 吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞一次。
10. 弃去PBS，每皿加入1 ml 0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA溶液，于37°C孵育10分钟。
11. 加入9 ml培养基，将细胞吹打成单细胞悬液，转移至15 ml离心管中。
12. 计数细胞数量，并调整细胞浓度至8×10⁴个细胞/ml。取10 ml细胞悬液（共8×10⁵个细胞）接种于预先用明胶包被的10 cm培养皿中，于37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。
13. 吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，加入10 ml含病毒的培养基，于37°C、5% CO₂条件下孵育4小时至过夜。
14. 24小时后，吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，加入10 ml新鲜ES细胞培养基。
15. 将常规ES细胞培养基更换为含多西环素（Doxycycline）的培养基，以启动四个基因的表达；即启动重编程过程。
16. 若使用Oct4-neo报告系统，则可在第6至第9天之间的任意时间开始药物筛选。
17. 每天更换培养基，直至克隆生长至足够大可进行挑取。克隆通常在重编程启动约一周后首次可见，至第20天左右应可达到适合挑取的大小。

步骤 3：

挑取iPS细胞集落

挑取前一日：

1. 将经γ射线照射的DR4小鼠胚胎成纤维细胞接种于所需数量的明胶包被的24孔板中

第1天挑取克隆：

1. 在挑取菌落前1-2小时对平板上的菌落进行喂养。
2. 向V型底96孔板的各孔中加入15 μl PBS。
3. 用PBS洗涤待挑取菌落的培养皿一次，并向培养皿中加入10 ml PBS。
4. 使用小型5 μl吸头（将P20移液器设定为4 μl）挑取菌落，将菌落转移至96孔板中的孔内。
5. 使用多通道（12通道）移液器向每个孔中加入20 μl胰蛋白酶，上下吹打3次，于37°C孵育4分钟。
6. 向经胰蛋白酶处理的菌落中加入100 μl ES培养基，上下吹打10次。使用12通道移液器每隔一个位置装一个吸头，每次将6个克隆从96孔板转移至24孔板。
7. 将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中，在24孔板中培养至细胞汇合度达到80–90%，每天用ES细胞培养基喂养一次。细胞通常在3–7天内即可准备扩增。

步骤 4

1. 诱导多能干细胞的扩增
   1. 吸除培养基，并用 1 ml PBS 洗涤细胞。
   2. 完全去除 PBS，加入 0.1 ml 0.25% 胰蛋白酶/1 mM EDTA，于 37°C 孵育 10 分钟。
   3. 加入 0.4 ml ES 培养基，通过反复吹打将细胞悬浮为单细胞悬液。
   4. 将细胞悬液转移至 6 孔板中的一个孔，加入 1.5 ml ES 细胞培养基，在 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育，直至细胞在 6 孔板中达到 80–90% 汇合度。此时，按以下步骤制备细胞冻存液。
2. 冻存液的制备
   1. 吸除培养基，并用 2 ml PBS 洗涤细胞。
   2. 完全去除 PBS，加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶/1 mM EDTA，于 37°C 孵育 10 分钟。
   3. 加入 2 ml ES 培养基，通过反复吹打将细胞悬浮为单细胞悬液。
   4. 将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，计数细胞数量后离心沉淀细胞。
   5. 弃去上清液，用 ES 培养基重悬细胞，调整浓度至每毫升含 2×10⁶ 个细胞。
   6. 配制 2 份 ES 细胞冻存液（含 20% DMSO 的 ES 培养基），按每管 0.5 ml 分装至冻存管中。
   7. 将 0.5 ml 细胞悬液转移至冻存管中，轻轻混匀。
   8. 将冻存管放入细胞冻存盒中，于 -80°C 过夜保存；次日转移至液氮中进行长期储存。

讨论

在本视频中，我们演示如何利用可诱导的慢病毒系统，从来源于 Oct4-GFP/R26-M2rtTA 和 Nanog-GFP/R26-M2rtTA 小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs）生成表达绿色荧光蛋白（GFP）的多能性诱导多能干细胞（iPS 细胞）。该方法在生成 iPS 细胞方面具有实用价值，因为它能够在重编程过程中调控外源基因的表达。尽管在 iPS 细胞生成过程中使用病毒会限制这些细胞在临床环境中的应用，但该方法有助于我们解答目前尚未明确的重编程机制中的一些关键生物学问题。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸多西环素	试剂	Sigma-Aldrich	D9891-100G