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人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

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DOI：

10.3791/780

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2008年7月22日

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of California - Riverside

本文内容

摘要

ESC的分化伴随着染色质结构和组成的细胞类型特异性变化。检测这些变化可为定义干细胞特性及细胞分化的机制提供重要见解。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有价值的手段，可用于解析干细胞分化背后的分子机制。

摘要

后生动物体内多种多样细胞的功能与结构复杂性源于少量的干细胞。干细胞具有两个基本特性：自我更新能力以及多能性，后者使干细胞几乎能够分化为任何类型的细胞1。干细胞向分化细胞的发育过程伴随着多能性的丧失、结构与形态的变化，以及转录因子和信号分子的层级化活性，这些分子的活动建立并维持了细胞类型特异性的基因表达模式。在分子水平上，细胞分化涉及染色质结构与组成的动态变化，对这些动态变化的检测可为干细胞的功能特征及细胞分化过程提供有价值的见解2,3。染色质是一种高度压缩的DNA-蛋白质复合物，当细胞将染色体DNA与蛋白质（主要是组蛋白）包装在一起时形成4。干细胞特性与细胞分化已被证实与特定调控蛋白阵列的存在相关，这些蛋白包括表观遗传因子、组蛋白变体以及转录因子2,3,5。


染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于检测染色质中RNA、蛋白质及蛋白质修饰存在的有效方法6,7。比较不同类型细胞的染色质，可揭示细胞分化过程中蛋白质与染色质相互作用的动态变化。

染色质免疫沉淀涉及对染色质的纯化 体内 交联的染色质。分离得到的染色质通过酶消化或机械力被剪切为较小的片段。利用特异性抗体对目标蛋白或蛋白与DNA的修饰进行免疫沉淀，以富集染色质片段。沉淀的DNA或RNA经纯化后，可作为PCR或基于DNA微阵列分析的模板。成功的染色质免疫沉淀（ChIP）实验的前提是使用高质量的针对目标抗原的抗体，以及获取来自不表达目标分子的对照细胞的染色质。ChIP技术能够将蛋白、蛋白与RNA的修饰以及RNA的存在情况与特定的目标DNA序列相关联；根据所选用的下游检测工具，该技术可检测目标分子在特定基因上的结合情况，或在整个基因组范围内的分布状况。通过比较不同分化阶段细胞中蛋白质在染色质上的分布，可揭示伴随细胞谱系进展过程中染色质组成发生的动态变化。

方案

解冻胚胎干细胞（视频中未展示）

ES 细胞在含有 10% DMSO 的培养基中冻存。由于 DMSO 可能诱导 ES 细胞发生分化，因此建议在当天较晚时解冻细胞，并于次日早晨更换培养基，以尽量减少残留 DMSO 的影响。

  1. 用0.1%明胶包被6孔组织培养板，至少孵育15分钟，接种细胞前立即吸除明胶溶液。
  2. 在37°C水浴中解冻ES细胞（约5×106个细胞，相当于一个汇合度达到100%的6孔板），并加入10 ml预热的ES细胞培养基中稀释。
  3. 在台式临床离心机中以1000 rpm离心10分钟，沉淀细胞。
  4. 吸除上清液，并将细胞轻轻重悬于10 ml 37°C预热的培养基中。
  5. 将细胞悬液转移至6孔板中，在37°C、含5% CO2的湿化培养箱中培养。
  6. 次日更换培养基，以去除死细胞和残留的DMSO。

ES 细胞培养物的传代与扩增

胚胎干细胞通常每2至3天传代一次，培养基每隔一天更换一次。因此，胚胎干细胞需要每天进行观察和处理。根据我们的经验，无饲养层培养的胚胎干细胞增殖迅速，会快速酸化培养基，使其变为黄色。若任由细胞酸化培养基（例如未每天更换培养基或传代时稀释度过低），将导致细胞进入危机状态，引发过度分化和细胞死亡，此后其全能性将无法保证。接种细胞密度过低、传代过程中细胞分散不充分或接种不均匀也会引起类似问题，因为细胞在达到汇合前会形成大团聚集体，而这些聚集体内部的细胞将发生分化或死亡。即使细胞在注射时外观正常，其若曾受到不当处理，也会显著降低生殖系传递能力。

  1. 对于已长满的6孔板细胞，吸去培养基，并用2-3 ml预热至37°C的PBS洗涤细胞，移液时避免直接冲击细胞。
  2. 加入1 ml 1×胰蛋白酶溶液覆盖细胞，消化3-4分钟，或直至细胞均匀分散成小团块。
  3. 加入1 ml培养基以中和胰蛋白酶活性。
  4. 收集消化后的细胞，将细胞（通常为原孔的2/5）接种至新制备的明胶包被的6孔板中。

冻存 ES 细胞

  1. 按照上述方法对一个汇合的6孔板（约1 × 107 个细胞）进行胰蛋白酶消化。
  2. 用9 ml培养基收集消化后的细胞，并在1,000 rpm下离心5分钟，形成细胞沉淀。
  3. 吸除上清培养基，将细胞沉淀重悬于1 ml新鲜配制的冻存液中。将0.5 ml细胞悬液分装至两个冻存管中。
  4. 将冻存管于-80°C过夜冷冻，随后转移至液氮中进行长期保存。

ChIP-on-chip 实验流程

免疫沉淀

  1. 甲醛交联细胞（适用于悬浮细胞）
    1. 每次免疫沉淀使用 5 × 107 – 1 × 108 个细胞。
    2. 向细胞悬液中加入新鲜甲醛，使其终浓度为 1%。
    3. 室温下用甲醛溶液孵育细胞 10 分钟。
    4. 加入 1/10 体积的 1.25 M 甘氨酸以淬灭甲醛。
    5. 用 10 ml 1× PBS 洗涤细胞两次。
    6. 将细胞收集至 50 ml 锥形管中，在 4°C 下以 700 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1.5 ml 裂解缓冲液中，并转移至 1.5 ml 微量离心管中。
  2. 将细胞在液氮中快速冻融三次，并使用组织研磨器破碎细胞。细胞交联完成后，可长期保存于 -80°C 冻存。

准备磁珠（所有步骤均在 4°C 下进行）

  1. 向1.5 ml低吸附微量离心管中加入50 µl Dynal磁珠。每个免疫沉淀反应准备一管磁珠。加入1 ml封闭液。
  2. 使用Dynal磁力架收集磁珠。将离心管置于磁力架上，静置约15秒，使磁珠吸附至管壁一侧。将磁力架翻转两次以促进磁珠完全聚集，随后用移液器吸除上清液。
  3. 加入1 ml封闭液，并通过从磁力架上取下磁条并反复翻转磁力架（保持离心管在位）的方式轻柔重悬磁珠，重复10–20次，或直至磁珠均匀分散。参照步骤2方法收集磁珠，随后用移液器吸除上清液。
  4. 按照步骤3所述方法，再用1.5 ml封闭液洗涤磁珠一次。
  5. 将磁珠重悬于750 µl封闭液中，并加入10 µg抗体。在旋转仪上于4°C孵育至少6小时，或过夜。
  6. 按照步骤3所述方法，用1 ml封闭液洗涤磁珠三次。

细胞超声处理

  1. 从 -80°C 取出冷冻的细胞沉淀，转移至用于超声处理的离心管中。目前我们倾向于使用标准聚丙烯15 ml锥形管的底部进行超声处理。在5 ml刻度处将管子切成两段，丢弃上半部分。在准备过程中，可用封口膜或管盖覆盖管口。
  2. 将离心管置于微量离心管架上，调整位置，使超声探头距离管底约0.5–1.0 cm。注意确保探头居中，不接触管壁。（探头位置可能影响超声过程中溶液是否产生泡沫。通常，泡沫的出现表明DNA剪切效果不佳。）
  3. 对悬浮液进行6次超声处理，每次20秒。超声过程中应将样品置于冰水浴中。为减少泡沫产生，首次脉冲时先将输出功率设为0，再手动逐渐增加至最终功率。（若出现明显泡沫，可通过20,000g离心去除所有气泡，随后轻轻重悬全部沉淀物，确保无泡沫残留。）
  4. 在4°C下以20,000g离心10分钟，沉淀碎片，收集上清液至1.5 ml离心管中。
  5. 从每个样品中保留50 µl细胞裂解液作为输入DNA，储存于-20°C。每批超声处理的裂解液应至少保留一份输入DNA样品。请注意，超声处理的效果以及DNA片段大小的分布情况，只有在交联逆转并纯化DNA后才能进行检测。

染色质免疫沉淀

  1. 将超声处理细胞步骤（Cell sonication）第 4 步中相当于 5 × 107 – 1 × 108 个细胞的染色质加入到“磁珠制备”（Preparing magnetic beads）第 6 步 获得的 50 µl 抗体/磁珠混合液中，终体积为 1 ml（如有需要，可用裂解缓冲液调整）。在 4°C 条件下于旋转仪上孵育过夜。

洗涤

  1. 使用 Dynal MPC 收集磁珠。将离心管置于支架上，使磁珠吸附在管壁一侧，此过程约需 20 秒。将支架倒置两次，以帮助收集全部磁珠。用移液器吸除上清液，并在不同样品间更换吸头。
  2. 向每根离心管中加入 1 ml 裂解缓冲液，轻轻重悬磁珠。可通过从支架上取下磁铁条并保持离心管固定于支架中，反复倒置支架 10–20 次，直至磁珠均匀重悬。收集磁珠后，用移液器吸除上清液。更换吸头后，重复此洗涤步骤 5 次。
  3. 按照步骤 2 的方法，用 1 ml IP1 缓冲液洗涤磁珠 6 次。
  4. 按照步骤 2 的方法，用 1 ml IP2 缓冲液洗涤磁珠 6 次。
  5. 按照步骤 2 的方法，用 1 ml TE 8.0 缓冲液洗涤磁珠 6 次。
  6. 在 4°C 下以 960 ×g 离心 3 分钟，去除残留的 TE 缓冲液。

洗脱

  1. 加入 210 µl 洗脱缓冲液，将离心管置于 65°C 水浴中孵育 15 分钟以从磁珠上洗脱产物。每 2 分钟涡旋振荡数秒。此孵育时间可延长至 30 分钟，有助于提高洗脱产物的回收率。
  2. 在室温下以 16,000g 离心 1 分钟，使磁珠沉淀。
  3. 吸取 200 µl 上清液并转移至新离心管中。样品可在 -20°C 冻存过夜。

交联逆转

  1. 将洗脱步骤第 3 步中获得的免疫沉淀 DNA 在 65°C 下孵育至少 6 小时，最多 15 小时，以逆转交联（交联逆转时间过长通常会导致芯片分析中的背景噪音增加）。该孵育可在烘箱中进行，以确保管内受热均匀，并减少冷凝水的形成。
  2. 解冻超声处理后保留的 50 µl 输入 DNA（步骤 13），加入 150 µl（3 倍体积）洗脱缓冲液并混匀。将此输入 DNA 在 65°C 下孵育，进行交联逆转，操作同交联逆转步骤 1。自此之后，每管免疫沉淀 DNA 或输入 DNA 均视为独立的管或样品，用于后续处理步骤。

DNA 纯化

  1. 加入 8 µl 浓度为 10 mg/ml 的 RNaseA（终浓度为 0.2 mg/ml），通过反复倒置离心管混匀，并在 37°C 下孵育 2 小时。
  2. 加入 4 µl 浓度为 20 mg/ml 的蛋白酶 K（终浓度为 0.2 µg/ml），通过反复倒置离心管混匀，并在 55°C 下孵育 2 小时。
  3. 加入 400 µl 苯酚:氯仿:异戊醇（P:C:IA），涡旋振荡，并使用 2 ml Heavy Phaselock 管分离相（遵循 Eppendorf 提供的说明）。
  4. 如果 P:C:IA 溶液陈旧或 pH 值偏低，会导致 DNA 降解，从而在微阵列分析中产生噪声，并导致有效靶标的检测丢失。
  5. 将水相转移至新的离心管中，该管内已含有 16 µl 5M NaCl（终浓度为 200 mM）和 1.5 µl 20 µg/µl 的糖原（共 30 µg）。
  6. 加入 800 µl 乙醇。在 -20°C 下过夜孵育，或在 -80°C 下孵育 30 分钟。
  7. 在 4°C 下以 20,000g 离心 10 分钟以沉淀 DNA。加入 500 µl 80% 乙醇洗涤沉淀，涡旋重悬沉淀后，再次在 4°C 下以 20,000g 离心 5 分钟。
  8. 去除残留的 80% 乙醇。短暂离心以收集残留液体，并用移液器小心吸除液体，避免触碰沉淀。让离心管自然晾干至沉淀刚好干燥：沉淀仍应保持微润外观。将每个沉淀重悬于 70 µl 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。
  9. 沉淀过度干燥可能导致其难以重悬，或易碎裂并从管壁脱落。
  10. 可选步骤：保留 15 µl 免疫沉淀样品以供后续使用。该样品可用于进行基因特异性 PCR，以验证微阵列结果。
  11. 通过紫外吸收法（260 nm）测定浓度。

注意：以下步骤包括文库构建和扩增，使用经过修改的 GenomePLex WGA 试剂盒，并采用 Sigma 公司不含 dNTPs 的 10X Amp Mix：

文库构建

可从 Sigma 公司的 GenomePLex WGA 试剂盒中获取含 10X Amp Mix 的组分

  1. 在 PCR 管中，向来自纯化 DNA第 11 步的 10 µl DNA 样本中加入 2 µl 1X 文库制备缓冲液。
  2. 加入 1 µl 文库稳定溶液。
  3. 充分涡旋混匀，离心集液后，将样本置于 95°C 热循环仪中孵育 2 分钟。
  4. 将样本在冰上冷却，再次离心集液，然后放回冰上。
  5. 加入 1 µl 文库制备酶，充分涡旋混匀，随后短暂离心。
  6. 将样本放入热循环仪中，按以下条件孵育：
    • 16°C 孵育 20 分钟
    • 24°C 孵育 20 分钟
    • 37°C 孵育 20 分钟
    • 75°C 孵育 5 分钟
    • 4°C 保存
  7. 从热循环仪中取出样本，短暂离心。样本可立即进行扩增，或在 20°C 保存三天。

扩增

可从 Sigma 公司的 GenomePLex WGA 试剂盒（含 10X 扩增混合液）中获得

  1. 将以下试剂加入第3步的15 µl反应体系中，配制主混合液：
    • 7.5 µl 10X 扩增混合液（不含 dNTPs）
    • 5.0 µl WGA DNA聚合酶
    • 3.0 µl 的 10 mM dNTP（每种）贮存液（终浓度 0.4 mM）
    • 用无核酸酶水将终反应体积补至75 µl
  2. 充分涡旋混匀。短暂离心后，开始热循环反应。
    • 初始变性：95°C，3分钟
    • 进行14个循环，步骤如下：
    • 94°C 变性 15 秒
    • 65°C 退火/延伸 5 分钟
    循环结束后，将反应物在4°C下保存，或在-20°C下储存，直至进行分析或纯化。
  3. 使用Qiagen公司的PCR Purification®试剂盒按照制造商说明书纯化DNA，并通过紫外吸收法（260 nm）测定浓度。
  4. 再次进行一轮扩增循环 文库构建, 步骤 1 通过 扩增，步骤2， 并作如下调整。

    • 关于步骤中所需 DNA 的量 3，上图 启动片段化过程：若DNA浓度约为200–300 µg/ml，取2.5 µl样品，加水调整至终体积为10 µl。
    如果DNA浓度约为50-60 µg/ml，则取5 µl样品，加水调整至终体积为10 µl。


    • 在第二次扩增过程中，将主混合液中的dNTPs（含dTTPs）替换为含有10 mM dATP、10 mM dGTP、10 mM dCTP、8 mM dTTP和2 mM dUTP的混合液，其总体浓度与前一混合液相同。

  5. 使用紫外-可见分光光度计（260 nm）测定DNA含量。通常，每个反应可获得超过9 µg的扩增DNA。

    注意：DNA靶标的标记使用Affymetrix公司的GeneChip® WT Double-Stranded DNA Terminal Labelling Kit，按照制造商提供的说明书进行，具体步骤如下：

扩增的片段目标

  1. 根据目标样本将要杂交的芯片类型，使用下表中相应的方案对样本进行片段化。

    表 1. 单芯片的片段化反应体系
    组分 每次反应的体积/用量
    双链 DNA 7.5 µg
    10X cDNA 片段化缓冲液 4.8 µl
    UDG, 10 U/µl 1.5 µl
    APE 1, 100 U/µl 2.25 µl
    无核酸酶水 加至 48 µl
    来自 Affymetrix 的 GeneChip® WT 双链 DNA 末端标记试剂盒

    表 2. 多芯片组合的片段化反应体系
    组分 每次反应的体积/用量
    双链 DNA 9 µg
    10X cDNA 片段化缓冲液 4.8 µl
    UDG, 10 U/µl 1.5 µl
    APE 1, 100 U/µl 2.25 µl
    无核酸酶水 加至 48 µl
    来自 Affymetrix 的 GeneChip® WT 双链 DNA 末端标记试剂盒
  2. 根据上述任一表格配制片段化反应体系。轻弹混匀，离心收集至管底。
  3. 将反应体系置于以下条件孵育：
    • 37°C 孵育 1 小时。
    • 93°C 孵育 2 分钟。
    • 4°C 孵育至少 2 分钟。
  4. 轻弹混匀，离心收集，将 45 µl 反应产物转移至新管中。
  5. 从每个样本中取出 2 µl 用于凝胶迁移分析。

标记片段化的双链DNA

  1. 按照下表所述配制双链 DNA 标记混合液：

    表 3. 双链 DNA 标记混合液的组成
    组分 每次反应的体积/用量
    5X TdT 缓冲液 12 µl
    TdT 2 µl
    DNA 标记试剂，5 mM 1 µl
    总体积 15 µl
    该试剂可从 Affymetrix 的 GeneChip® WT 双链 DNA 末端标记试剂盒中获得
  2. 向 DNA 样品中加入 15 µl 双链 DNA 标记混合液，轻轻弹动混匀，并短暂离心。
  3. 将反应体系在以下条件下孵育：
    • 37°C 孵育 60 分钟。
    • 70°C 孵育 10 分钟。
    • 4°C 孵育至少 2 分钟。
  4. 从每个样品中取出 2 µl 用于凝胶迁移分析。

凝胶迁移分析

  1. 制备 4% 琼脂糖凝胶。
  2. 将扩增片段目标产物步骤 5 和标记片段化的双链 DNA步骤 4 中的样品在 65°C 下孵育 2 分钟。
  3. 加入 10 µl 链霉亲和素（1 mg/ml），并在室温下孵育样品 5 分钟。
  4. 将步骤 3 的样品在 4% 琼脂糖凝胶上电泳（凝胶迁移分析，步骤 1），以检测标记产物的迁移偏移情况。

芯片杂交与芯片洗涤

由加利福尼亚大学河滨分校基因组中心完成。

阵列分析

通过计算分析完成。

缓冲液成分：

封闭液：PBS + 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）。

裂解缓冲液：50 mM HEPES-KOH，pH 7.5
140 mM NaCl
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
1 mM PMSF
最终 pH 7.5

IP1：裂解缓冲液 + 500 mM NaCl

IP2：10 mM Tris-HCl
250 mM LiCl
1 mM EDTA
0.5% NP-40
0.5% 脱氧胆酸钠
终末 pH 8.0

TE：10 mM Tris，pH 7.4
1 mM EDTA

最终 pH 为 8.0
洗脱缓冲液：TE 缓冲液 + 1% SDS。

讨论

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于解析细胞分化过程中染色质相关事件的有价值技术。该方法成功的关键前提是拥有高质量的抗体，以及能够获得缺乏目标抗原的对照细胞或组织来源的染色质。将ChIP与DNA微阵列技术相结合，可获取大量信息。ChIP结果的验证依赖于合适的测试系统的可用性，这些系统能够将蛋白质的动态结合、蛋白质修饰和/或RNA与细胞发育过程中生物学功能的执行联系起来。

致谢

本研究工作由加州再生医学研究所（CIRM）向 F.S. 提供的资助（项目编号：RS1-00477-1）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蛋白酶K试剂Roche Group#EO0491
RNase-A试剂Fermentas#EN0531
甲醛 37%试剂EMD MilliporeFX040-13
氯仿试剂EMD Millipore3150
乙醇试剂Goldshield
苯酚:氯仿:异戊醇试剂Invitrogen15593-031
SA, 第V组分试剂EMD Millipore2930
Dubecco’s 磷酸盐缓冲液试剂GIBCO, by Life Technologies14190
HEPES试剂EMD Millipore5330
氯化钠试剂Fisher ScientificS271-10
EDTA试剂EMD Millipore4050
Triton X-100试剂EMD Millipore9410
十二烷基硫酸钠试剂JT Baker4095-02
氯化锂试剂EMD Millipore5910
Tris-HCl试剂EMD Millipore9230
NP-40试剂Calbiochem492015
脱氧胆酸钠试剂Fisher ScientificBP349-100
乙酸铵试剂Applichem631-61-8
甘氨酸试剂EMD Millipore4840
甘氨酸试剂EMD Millipore4840
dynalbeads, 蛋白A试剂Invitrogen100.02D
dynalbeads, 蛋白G试剂Invitrogen100.04D
1.5 ml 低吸附微量离心管, Xtreme其他Phenix Research ProductsMAX-815S
相锁凝胶轻型, 2.0 ml试剂Eppendorf955154037

参考文献

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
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  3. Lee, T. I., et al. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell. 125, 301-313 (2006).
  4. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  5. Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).
  6. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).
  7. Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax. Science. 311, 1118-1123 (2006).

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标签

TE DNA DNA

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