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新生鼠中脑多巴胺能细胞原代分离培养

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DOI：

10.3791/820

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2008年11月5日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Tufts University

本文内容

摘要

原代分离的中脑多巴胺细胞培养可用于研究多巴胺神经元的突触前特性。这些培养细胞可用于实时监测多巴胺释放动力学，以及多巴胺胞吐作用调控因子的蛋白质/mRNA水平。本文中，我们将展示如何从啮齿类动物新生个体中建立此类细胞培养。

摘要

建立多巴胺能神经元的原代细胞培养体系，可使研究者在排除脑内其他系统性输入干扰的情况下，独立研究多巴胺能神经元的突触前特性。在本实验室中，我们利用这些神经元通过碳纤维安培法评估多巴胺释放动力学，并通过定量PCR和免疫细胞化学方法检测与多巴胺相关的基因和蛋白质表达水平。在本视频中，我们将向您展示如何从啮齿类动物新生个体中建立此类细胞培养体系。

该过程包括多个步骤，如皮层胶质星形细胞的铺板、胶质基质对神经元细胞培养基的条件化处理、新生幼鼠中脑的解剖、多巴胺能神经元的消化、提取与铺板，以及添加神经营养因子以确保细胞存活。

适用于此类制备的应用包括电生理学、免疫细胞化学、定量PCR、视频显微镜（例如，囊泡与质膜实时融合的观察）、细胞活力检测以及其他毒理学筛选。

方案

培养前的准备工作

注意：** 胶质细胞必须提前足够时间接种，以便有充足时间增殖并覆盖培养皿底部  培养皿。对于具有非典型或实验性遗传背景的小鼠，需确保胶质细胞与神经元培养物在基因型上相匹配。

注意：** 在解剖前 1-7 天，准备新鲜的神经元培养基，并用 2 ml 更换培养皿中的胶质细胞培养基。

注意：** 在解剖前一天，以下物品需在紫外线下照射过夜：

  • 4 个解剖用培养皿
  • 2 个含微型磁力搅拌子的分离管
  • 2 个管盖（顶部扎两个小孔）
  • 展开载玻片环（并用 70% 乙醇涂布）——同时保持包装盒打开
  • 至少 2 整盒黄色（10–200 μL）移液器吸头
  • 1 盒蓝色（100–1000 μL）移液器吸头

培养当天

注意：* 切勿触碰任何经紫外线过夜照射的物品！

在超净台内维持无菌环境非常重要。

1）准备工作：

注意：** 预先取出所有冷冻的试剂以配制木瓜蛋白酶溶液。

  1. 用70%乙醇清洁镊子。用无菌黄色移液器吸头套住每个尖端。用于将无菌载玻片环放入其盒中。
  2. 热板：
    1. 在通风橱下放置一个微型磁力/加热板，上面放一个1000 ml烧杯，内盛500–600 ml去离子水2O 和一个大型磁力搅拌子。
    2. 将一块聚苯乙烯泡沫圆盘置于烧杯内，使其刚好位于水面之上。
    3. 将温度计插入泡沫塑料圆盘上的小孔中。加热旋钮需调至略高于2的位置（对应温度为 34°C）且搅拌旋钮应调至约 5-6。
  3. PBS：
    1. 准备无菌 PBS，并向 15 个无菌 15 ml 离心管中各加入 4–6 ml（注意保持无菌操作）
      技术
    2. 将试管和储备瓶放在冰上，置于超净台旁。
  4. 碳合气：
    1. 将一支5 ml的移液管从中间折断，然后将其穿过橡胶塞，使移液管的尖端从橡胶塞的宽端伸出。
    2. 将塞子放入盛有 400–500 ml dH₂O 的 500 ml 三角瓶中2O（移液管末端断裂部分应位于 dH₂O 内）2O).
    3. 在烧瓶的侧孔上连接一根导管。
    4. 剪去黄色移液器吸头的尖端，并将该吸头连接到管子的末端（切口朝外）。

      将碳酰气罐连接到5ml移液管的尖端。

  5. 配制木瓜蛋白酶溶液：
    1. * 采用严格的无菌操作技术。
    2. 在无菌的50 ml离心管中混合。
  6. 将木瓜蛋白酶溶液过滤至解离管中：
    1. 使用 Steriflip 过滤装置，并通过 25 ml 移液管转移至解离管（或放置一个新的 0.2μm 20毫升注射器针筒末端连接注射器滤器，
      移除注射器活塞，使用移液管（25 mL）将所有木瓜蛋白酶溶液转移至注射器中。
    2. 过滤至解离小瓶中。
    3. 盖上瓶盖，将无菌注射器穿过瓶盖上的孔，并连接无菌 0.2μm 将注射器滤器连接至注射器底部。
    4. 将碳氧混合气体连接至滤器，并用帕拉膜密封固定。将小瓶置于泡沫塑料圆盘/支架中。

      *微型磁力搅拌棒必须保持转动。
      *气体必须进入小瓶中。
      *温度必须稳定在 34°C.

  7. 解剖准备：
    1. 将解剖显微镜移至超净工作台内。
    2. 将所有解剖器械置于铝箔上，用70%乙醇喷洒，倒去多余液体，置于通风橱内晾干。
  8. 准备神经元培养基：
    1. 将30 ml新鲜神经元培养基置于培养箱中。
  9. 铺开1张大铝箔和12张小铝箔。将断头剪留在铝箔旁。用一个小泡沫盒装满冰水，并将所有物品置于超净台外。
  10. 准备麻醉剂（0.075 ml 戊巴比妥和 0.075 ml 赛拉嗪）。
  11. 至少准备12只新生幼鼠（P0-P2）以满足100个培养板的需求。对于小鼠，需确保整窝幼鼠基因型一致。若基因型未知，应将每只幼鼠的细胞分别接种于独立的培养皿中，并准确记录小鼠编号，将其与对应的细胞培养皿匹配，同时确保各细胞培养中胶质基质的遗传背景一致。

2）解剖

  1. 通过腹腔注射麻醉第一只动物。当动物出现镇静状态且对尾部弹击测试无反应时，将其置于冰上30秒（直至体温过低）。用70%乙醇冲洗一小块铝箔、断头剪和头部。
  2. 断头，使头部自然落在铝箔上，然后转移至超净台内。小心将脑组织取出并放入含有冰冻PBS的15 ml离心管中。在取出下一个脑组织时，将离心管放回冰上。
  3. 重复上述前三个步骤，直到共有3个脑组织置于冰上。将全部3个脑组织及PBS倒入显微镜下的第一个解剖皿中。分离出脑部适当区域（腹侧被盖区，VTA），用移液管将组织段转移至木瓜蛋白酶溶液中。当第一个组织段放入时启动计时器。
  4. 重复前述三个步骤，直至所有脑组织均进入木瓜蛋白酶中进行消化。平均消化时间应为2小时。当最后一个组织段放入时，第一个组织段已消化约1小时。

    尽量取时间中间值以平衡消化程度。

  5. *消化过程中：
    1. 确保水浴温度保持在34°C。
    2. 组织段最初可能会粘附在搅拌子上，但随着时间推移应逐渐散开。若未散开，可轻敲反应管底部。

3）吹打：

  1. 使用移液管将脑组织片段转移至无菌的15 ml离心管中（尽量避免带入过多木瓜蛋白酶溶液），并用孵育箱中预热的胶质细胞培养基洗涤3次，每次2 ml。加入胶质细胞培养基后，待组织片段沉降，然后小心吸除尽可能多的上清液，避免扰动沉淀的组织片段。每次更换移液管以防止污染！

    **弃去所去除的溶液，不得保留。

  2. 使用新的移液管，在2 ml胶质细胞培养基中开始吹打。吹打25次（避免引入气泡），然后将离心管静置3分钟，直至未完全解离的组织片段沉降。用移液管小心吸出上清液，并尽可能多地保留，避免扰动管底的组织片段。将上清液转移至新的（无菌）15 ml离心管中保存。
  3. 依次使用1000 μl和200 μl移液器重复上一步操作，直至组织完全解离。
  4. 使用移液管吹打10次，或直至细胞在溶液中完全重悬。

4）细胞接种

  1. 使用无菌的黄色移液器吸头覆盖镊子的每个尖端，小心地将载玻片环尽可能居中放置于各培养皿内的玻璃表面。
  2. 放置 10μl 在血细胞计数板上滴加细胞悬液并进行计数。（排除碎片团块）。
  3. 将细胞数量乘以10。此即为每微升的细胞数/μl. 将1,000,000–1,500,000（或所需密度）除以该数值，所得结果即为 μl 每皿添加。
  4. 使用移液枪头在向每孔板的中心小室加入适量溶液时，将环状物滑入其中心小室 μl/dish轻轻接种，每个培养皿均需更换移液枪头。
  5. 添加 100μl （稀释后）GDNF 溶液加入每孔玻片环内。
  6. 此时，将培养皿放入培养箱，并将神经元培养基带入冷室。
  7. 让细胞静置过夜。
  8. 次日：移除环状物（每次更换培养皿时均使用新的无菌移液器吸头覆盖镊子尖端）

5）有丝分裂抑制：第二天

  1. 将1000倍浓缩的FDU储存液按1:10稀释，即取200μl FDU储存液加入1.8 ml无菌MEM中。
  2. 向每皿外圈加入20μl稀释后的FDU溶液。频繁更换移液器吸头。盖好后放回培养箱。

    *接下来的7-10天内尽量减少对培养皿的扰动。检查是否有污染，并在发现污染迹象时立即移除受感染的培养皿。培养物在3周内即可用于检测。

 

培养基/溶液

神经元培养基

（配制 200 mL）

**最好在使用前一整夜用培养瓶中的胶质细胞对溶液进行条件化处理，用于洗涤/吹打

成分用量备注
BSA 5%0.5 g第五组分
MEM 液体94.0 mlSigma
DMEM 液体80.0 mlSigma
F-12 液体20.0 mlSigma
葡萄糖 45% 液体1.50 mlSigma 溶液
谷氨酰胺 200 mM0.5 ml分装的 Sigma 溶液
Diporzio 浓缩液2.0 mlSigma 溶液
液体过氧化氢酶0.1 ml 
犬尿烯酸 0.5 M200 μl溶于 1 N NaOH
HCl 5 N50 μl 
  1. 将成分（BSA 最后加入）混合至 250 ml 塑料瓶中。
  2. 过滤、标记并冷藏。

 

犬尿喹酸
(分子量 = 189.2)
0.5M = 94.6mg/ml
配制8ml 储存液：将756.8mg KA溶于8ml 1N NaOH中，分装至无菌的200μl离心管中



DiPorzio 培养基

A) DiPorzio 浓缩储备液：

所需混合分装
添加剂 溶剂 管材 量 ml ml/管 浓度 每份量 分装份数
胰岛素20 mM HCl (1)塑料250 mg 瓶装10125 mg/ml25 mg10
转铁蛋白Hank’s 液 500 mg 瓶装51100 mg/ml100 mg5
超氧化物歧化酶（SOD）Hank’s 液 70 mg 瓶装1415 mg/ml5 mg14
腐胺Hank’s 液 50 mg30.1220 mg/ml2.4 mg21
Na2SeO3Hank’s 液 0.104 mg100.510 μg/ml5.2 μg20
T310 mM NaOH 2 mg100.10.20 mg/ml0 mg100
孕酮 100% EtOH玻璃12.5 mg100.051.25 mg/ml使用移液器 
皮质醇100% EtOH玻璃20 mg100.022.00 mg/ml使用移液器 

  1. 20 mM HCl = 41.5 μl 浓 HCl/25 ml。
  2. 配制 1 mg/ml 储存液，并取 104 μl 加入 10 ml 中。



B) DiPorzio 培养基储备液：

添加剂 体积 (ml) 体积 (ml) X2 终浓度 μg/ml终浓度 摩尔浓度
Progesterone0.050.10.06200nM
Cortisol0.020.040.04125nM
Hank’s BSS6.2112.42  
Insulin1225 
Na2SeO30.510.0130nM
T30.10.20.0230nM
SOD125 
Putrescine0.120.242.415nM
Transferrin12100 
  1. 使用一个15 ml聚丙烯无菌管加入孕酮和皮质醇。使用 使用移液管和真空泵以加快乙醇（EtOH）的蒸发：（取一支5 ml的移液管，折成两半，将其中一半插入管中至中部位置，注意不要吸入乙醇液体。用Kimwipes将移液管固定稳妥，然后将管尖缓慢降至液面附近） 500μl 标记位于管子的侧面。
  2. 按照上述图表中所示的顺序添加后续等分试样。
  3. 加入胰岛素后溶液会变浑浊，随后添加 20μl 加入1N NaOH以中和pH值。溶液颜色应由黄色变为粉红色，并立即变澄清。此外，在加入转铁蛋白后，应立即添加 20μl 加入1N NaOH，以中和pH值并防止沉淀物形成。
  4. 用移液管吸取10 ml，分装为5份等量样品（一批）。
  5. 储存于 -20°C.
  6. 可同时制备两批。

 

解离培养基

A. 木瓜蛋白酶（每瓶）：

**在解剖前立即准备铺板当日所需物品。** 

成分量（注意事项）终浓度
半胱氨酸水7.8 mL1 mM 半胱氨酸 
木瓜蛋白酶视情况而定（*190μl 用于瓶子的
44.0 mg/ml		20 单位/毫升（总共 400 单位）
用于20 ml溶液体积
H&B 浓度2 mL 
碳合气95% O2 + 5% CO2 
HCl 5N10μl 
0.5% 酚红20μl0.001% 
Kynurenate 0.5 M10μl（在 1N NaOH 中）0.5 mM

  1. 先将半胱氨酸水加入木瓜蛋白酶。
  2. 加入H&B浓缩液、犬尿氨酸、盐酸和酚红。
  3. 过滤至解离小瓶（按设置说明所述），并连接至碳氧混合气体。


B. H&B 浓缩液（100ml，5倍浓度）：

成分   分子量    粉末/50 ml H2O 浓度 (M)  混合体积 (ml)   终浓度 (mM) 
NaCl58.44 11.699 g414.5  116
KCl74.563.728 g12.75.4
NaHCO384.014.2 g11326
NaH2PO4*H2O137.996.90 g112
MgSO4120.386.019 g10.51 
EDTA (ED2- SS)
292Sigma 5% (配制
5 g/100 ml 储存液)		0.1340.37220.5 
葡萄糖180Sigma 45%2.5525
TC H2O   62.93 
  1. 从储备液中取相应体积混合。
  2. 分装为每份 4 ml 的等分试样。
  3. 加入木瓜蛋白酶后，将等分试样加入半胱氨酸水溶液中。

C. 半胱氨酸水溶液（157.5 ml，1X）：

成分 分子量  组分
粉末（mg）		H2O（ml） 储存液浓度（mM） 混合体积（ml）终浓度（mM）
CaCl2147.2736105000.61.9mM
半胱氨酸121.7(1.5)24  20mM (0.02M)101.27mM
(0.88)
TC 水    146.9 
  1. 配制0.5M CaCl2储备液，并于4°C保存
  2. 配制一次性使用的半胱氨酸溶液，并与其他成分混合
  3. 分装为10份，每份15.75 ml，于4°C保存


GDNF 的配制

  1. 分装准备：
    1. 用 2.4 mL 无菌去离子水溶解 5 μg 无菌冻干 GDNF 小球。所得 GDNF 溶液浓度为 2.08 μg/mL。
    2. 将 2.08 μg/mL 的 GDNF 溶液分装至无菌冻存管中，每管 76.9 μL，即每管含 160 ng。
    3. 于 -20°C 保存。
  2. 加入培养物：
    1. 每 8 个培养皿使用 1 份解冻的分装液。
    2. 每份分装液加入 723.1 μL 神经元培养基进行稀释，得到 160 ng/800 μL 的 GDNF 溶液。
    3. 向每个培养皿中的 2 mL 培养基中加入 100 μL 该溶液，使 GDNF 的终浓度为 10 ng/mL。


FDU 溶液配制

FDU 储存液（1000×）：

成分用量（备注）终浓度
尿苷（Uridine）247 mg16.5 mg/ml
5-FDU（5-氟脱氧尿苷，5-fluorodeoxyuridine）100 mg（瓶装）6.7 mg/ml
TC 水15 ml 

  1. 配制略多于 15 ml 的 16.5 mg/ml 尿苷溶液。
  2. 取 15 ml 尿苷溶液加入 100 mg 的 FDU 瓶中，制成 6.7 mg/ml 的 FDU 溶液。
  3. 分装为每份 200 μl，于 -20°C 冻存。

稀释后使用：

  1. 抑制非神经元细胞的生长。将1000倍浓缩储备液按1:10稀释，即取200μl储备液加入1.8 ml MEM中。
  2. 向每皿的外环中加入20μl稀释后的FDU。频繁更换移液器吸头。盖好后放回培养箱。

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讨论

本文所述方法能够精细解析中枢多巴胺神经元的形态学和神经化学特征，而这些特征在系统性或体内研究方法中通常无法获得。

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致谢

本工作由 DK065872（ENP）、Smith Family Foundation 生物医学研究卓越奖（ENP）、F31 DA023760（BMG, ENP）和 P30 NS047243（塔夫茨神经科学研究中心）资助。

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材料

本文使用的材料清单
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材料已包含在实验方案正文中。

参考文献

  1. Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
  2. Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
  3. Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
  4. Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
  5. Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).

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PCR GDNF FDU

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