本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时演示了通过免疫荧光显微镜检测在无饲养层细胞条件下培养的hESCs多能性的方法。共3部分，此为第2部分。
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本文内容
摘要
摘要
本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs），以及如何将hESCs从MEF培养板传代至无饲养层细胞的Matrigel培养板。
方案
hESC 培养的日常维护
- 人胚胎干细胞（hESC）培养基必须每24小时更换一次。从4°C保存的ES培养基原液瓶中取出所需体积的溶液（约每6孔板20 ml），放入50 ml离心管中，并在水浴中加热至37°C。待培养基升温后，加入4°C保存的bFGF，使其终浓度为10 ng/ml。使用后请立即将bFGF原液放回4°C保存！
- 从6孔板中吸出培养基，仅保留约500 µl。务必轻轻晃动培养皿，使残留碎片悬浮以便彻底移除。确保hESC培养基中的bFGF充分混匀，然后向6孔板的每个孔中加入3 ml新鲜培养基。将培养板放回培养箱中继续培养。
将人胚胎干细胞从饲养层细胞传代至基质胶包被培养皿
通常，一个在MEF上汇合的hESC六孔板可以以1:2至1:3的比例传代至Matrigel包被的六孔板中，传代后4-5天孔内细胞再次达到汇合状态。
- 在将hESCs接种到Matrigel上时，使用MEF条件培养基（CM）以维持其多能性。MEF条件培养基需提前制备。第1天，将1.5×107个γ射线灭活的MEF细胞接种至T75培养瓶中。第2天，用室温的1×PBS（pH 7.4）洗涤MEF细胞一次，然后向培养瓶中加入15 ml添加了5 ng/ml bFGF的ES培养基。（注意：MEF细胞可接种于更小或更大的培养瓶中，但细胞密度与ES培养基体积之间的比例应保持恒定。....
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讨论
本视频演示了如何将人胚胎干细胞（hESCs）从饲养层MEF板传代至无饲养细胞的Matrigel板。请注意，Matrigel板上的克隆密度高于在MEF上常规传代时的克隆密度。需要通过免疫荧光染色与显微镜观察或流式细胞术检测人胚胎干细胞多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认在无饲养细胞培养条件下hESCs仍维持未分化状态。
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致谢
Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究得到了加州再生医学研究所（CIRM）种子基金 RS1-00313 的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）再生医学和干细胞研究 Broad 中心的成员，特别是 Amander Clark 博士、Jerome Zack 博士以及 UCLA Broad Institute 干细胞核心设施的工作人员，对本研究工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout血清替代物（KSR） | 试剂 | GIBCO，Life Technologies 公司品牌 | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11330-057 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | 试剂 | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | 试剂 | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | 试剂 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 胶原酶IV | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | 试剂 | 干细胞技术 | 17105-041 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15140-122 | |
| 明胶 | 试剂 | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | 试剂 | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 抗体 | 试剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| 抗人/小鼠SSEA-4 藻红蛋白–rythrin 偶联小鼠 IgG3 | 试剂 | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG | 试剂 | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-095-152 |
参考文献
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
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