从 MEF 到 Matrigel 2：将 hESC 从 MEF 分离并接种到 Matrigel 上

摘要

本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时演示了通过免疫荧光显微镜检测在无饲养层细胞条件下培养的hESCs多能性的方法。共3部分，此为第2部分。

摘要

本视频演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs），以及如何将hESCs从MEF培养板传代至无饲养层细胞的Matrigel培养板。

方案

hESC 培养的日常维护

1. 人胚胎干细胞（hESC）培养基必须每24小时更换一次。从4°C保存的ES培养基原液瓶中取出所需体积的溶液（约每6孔板20 ml），放入50 ml离心管中，并在水浴中加热至37°C。待培养基升温后，加入4°C保存的bFGF，使其终浓度为10 ng/ml。使用后请立即将bFGF原液放回4°C保存！
2. 从6孔板中吸出培养基，仅保留约500 µl。务必轻轻晃动培养皿，使残留碎片悬浮以便彻底移除。确保hESC培养基中的bFGF充分混匀，然后向6孔板的每个孔中加入3 ml新鲜培养基。将培养板放回培养箱中继续培养。

将人胚胎干细胞从饲养层细胞传代至基质胶包被培养皿

通常，一个在MEF上汇合的hESC六孔板可以以1:2至1:3的比例传代至Matrigel包被的六孔板中，传代后4-5天孔内细胞再次达到汇合状态。

1. 在将hESCs接种到Matrigel上时，使用MEF条件培养基（CM）以维持其多能性。MEF条件培养基需提前制备。第1天，将1.5×10⁷个γ射线灭活的MEF细胞接种至T75培养瓶中。第2天，用室温的1×PBS（pH 7.4）洗涤MEF细胞一次，然后向培养瓶中加入15 ml添加了5 ng/ml bFGF的ES培养基。（注意：MEF细胞可接种于更小或更大的培养瓶中，但细胞密度与ES培养基体积之间的比例应保持恒定。）将培养瓶在37°C下继续孵育24小时。第3天，收集条件培养基，并更换为15 ml新鲜的含5 ng/ml bFGF的ES培养基。收集的条件培养基储存于4°C。连续七天每日收集一次MEF条件培养基，共获得15 × 7 = 105 ml。七天后，将所有条件培养基组分混合，经无菌过滤后分装，并储存于-20°C。按上述方法制备的条件培养基可在一个月内储存并使用。
2. 在hESC传代前一天，将Matrigel分装液置于EP管中，于4°C过夜解冻（每管含76.2 mg Matrigel，恰好用于一个6孔板）。传代当天，取一个已解冻的Matrigel冻存管，与6 ml冷的DMEM/F12培养基一同置于冰上。将Matrigel转移至DMEM/F12培养基中并充分混匀。向6孔板的每个孔中加入1 ml该溶液。轻轻摇晃培养板使Matrigel均匀覆盖表面，然后在室温下孵育至少1小时，之后再进行hESC传代。
3. 用1×PBS（pH 7.4）洗涤生长在MEF上的hESC一次。随后向6孔板每孔加入1 ml预热的IV型胶原酶（1 mg/ml），并将培养板在37°C孵育5–10分钟。
4. 向每孔加入1 ml不含bFGF的ES培养基。使用1 ml移液器反复吹打，使干细胞从培养皿表面脱落。将含有hESC细胞团及死亡MEF细胞的全部培养基收集至50 ml离心管中。静置5–10分钟，使较大的细胞团沉淀，hESC团块沉降至管底形成沉淀，而MEF细胞则保留在上清液中。弃去上清液，用不含bFGF的ES培养基重悬hESC沉淀进行洗涤，随后在室温下以200g离心5分钟。
5. 将干细胞接种至Matrigel包被的培养板时，首先用室温的DMEM/F12培养基（每孔1 ml）洗涤Matrigel板，然后每孔加入2.5 ml添加了10 ng/ml bFGF的条件培养基。将细胞沉淀用适量添加了10 ng/ml bFGF的条件培养基重悬，反复吹打数次，直至细胞团块大小均匀且较小。将细胞悬液以每孔0.5 ml分装至Matrigel板中。注意，Matrigel板上的克隆密度高于常规在MEF上传代时的密度。将培养板置于37°C细胞培养箱中孵育。
6. 为在Matrigel上维持hESC的生长，需每24小时更换一次添加了10 ng/ml bFGF的条件培养基，可持续培养4–5天。

讨论

本视频演示了如何将人胚胎干细胞（hESCs）从饲养层MEF板传代至无饲养细胞的Matrigel板。请注意，Matrigel板上的克隆密度高于在MEF上常规传代时的克隆密度。需要通过免疫荧光染色与显微镜观察或流式细胞术检测人胚胎干细胞多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认在无饲养细胞培养条件下hESCs仍维持未分化状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Knockout血清替代物（KSR）	试剂	GIBCO，Life Technologies 公司品牌	10828-028
DMEM/F12	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11330-057
非必需氨基酸	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11140-050
GlutaMax	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	35050-061
DMEM	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11995-065
FBS	试剂	Clontech Laboratories	631107
L-谷氨酰胺	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	25030-081
BME	试剂	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	试剂	R&D Systems	233-FB-025
胶原酶IV	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	17104-019
Dispase	试剂	干细胞技术	17105-041
青霉素/链霉素	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	15140-122
明胶	试剂	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	试剂	BD Biosciences	354277
Oct-4 抗体	试剂	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
抗人/小鼠SSEA-4 藻红蛋白–rythrin 偶联小鼠 IgG3	试剂	R&D Systems	FAB1435P
FITC标记的山羊抗兔IgG	试剂	杰克逊免疫研究实验室	715-095-152