本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时演示了通过免疫荧光显微镜检测在无饲养层细胞条件下培养的hESCs多能性的方法。本视频为共3部分中的第3部分。
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摘要
摘要
本视频展示了如何在无饲养层细胞的条件下维持人类胚胎干细胞（hESCs）的生长，以及如何在无饲养层细胞的条件下对hESCs进行连续传代。同时，还通过免疫荧光显微镜检测验证了在无饲养层细胞条件下培养的hESCs的多能性。
方案
将人胚胎干细胞从基质胶转移至基质胶
通常，一个在Matrigel上生长至融合的6孔板人胚胎干细胞可按1:3至1:5的比例传代至另一个Matrigel板，传代后4-5天孔内细胞再次达到融合状态。
- 在传代前，按照上述方法准备 CM 和 Matrigel 培养板。
- 传代当天，用 1×PBS（pH 7.4）清洗每个待传代的孔，每孔加入 1 ml 浓度为 1 mg/ml 的 Dispase（用 DMEM/F12 培养基将 5 mg/ml 储存液稀释），在 37°C 下孵育 3 分钟。
- 用 1×PBS（pH 7.4）清洗每个孔三次，每孔加入 1 ml 不含 bFGF 的 ES 培养基，使用细胞刮刀将细胞集落从孔底刮下，收集悬浮的 hESC 细胞至 50 ml 离心管中，在室温下以 200g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。
- 将 hESC 细胞重铺至 Matrigel 培养板时，先用 DMEM/F12 清洗 Matrigel 培养板，每孔加入 2.5 ml 添加了 10 ng/ml bFGF 的 CM 培养基。用适量添加了 10 ng/ml bFGF 的 CM 培养基重悬 hESC 细胞沉淀，轻轻吹打细胞悬液 3 次。（注意：当用于传代的 hESC 来自 Matrigel 培养板时，细胞团块非常容易分散，因此吹打 3 次已足够，过多吹打可能导致集落过度破碎，产生单细胞。）将 0.5 ml hESC 细胞团悬液分装至 6 孔 Matrigel 培养板的每孔中，使最终体积达到每孔 3 ml。将培养板放入 37°C 培养箱中培养。
通过免疫荧光显微镜检测多能性标志物
采用免疫荧光显微镜检测人胚胎干细胞在培养过程中多能性标志物 Oct-4 和 SSEA-4 的表达情况。
- 吸去一个孔中的培养基，用 1×PBS（pH 7.4）洗涤一次。向孔中加入 2 ml 3.7% 多聚甲醛，室温固定 10 分钟。
- 用 1×PBS（pH 7.4）冲洗一次，向孔中加入 2 ml 甲醇，置于 -20°C 处理 2 分钟。
- 用 1×PBS（pH 7.4）冲洗一次，加入 1 ml 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温封闭 5 分钟。
- 加入 1 ml Oct-4 或抗人/鼠 SSEA-4 抗体（以 0.2% BSA 按 1:200 稀释），室温孵育 1 小时或 4°C 过夜。（注意：若进行 SSEA-4 染色，可直接进入第 6 步）
- 用 1×PBS（pH 7.4）洗涤三次，加入 1 ml FITC 标记的兔 IgG 二抗（以 0.2% BSA 按 1:500 稀释），室温避光孵育 1 小时。
- 用 1×PBS（pH 7.4）洗涤三次，在孔中央滴加一滴封片液（如需观察细胞核，可选用含 DAPI 的封片液）。将盖玻片覆盖于细胞上，用指甲油封边，通过免疫荧光显微镜观察结果。
人类胚胎干细胞接收
ES 培养基（胚胎干细胞培养基）：
DMEM/F12 - 400ml
Knockout 血清替代物 - 100ml
非必需氨基酸 - 5ml
200mM GlutaMax / BME 溶液 - 5ml
青霉素 / 链霉素 - 5ml
充分混匀，并将最终的hESC培养基分装至500 ml瓶中，4°C保存。最多可保存两周。
MEF 培养基：
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
非必需氨基酸 - 10ml
谷氨酰胺 - 10ml
青霉素/链霉素 - 10ml
充分混匀，并将最终的MEF培养基在4°C下保存。
200 mM 谷氨酰胺 / BME 溶液：
Glutamax - 100 ml
β-巯基乙醇（14.3 M 储存液）- 140 µl
将两种溶液充分混合，然后分装为每份 10 ml。将分装液保存于 -20°C。
bFGF 溶液（储存液终浓度：10 微克/毫升）：
bFGF（FGF2）- 50 µg
含 0.1% BSA 的 1×PBS 缓冲液，pH 7.4 - 5 ml
将50微克bFGF溶解于5毫升0.1% BSA中，配制成10 µg/ml的储存液。分装为500 µl每份，于-80°C保存。
IV型胶原酶溶液（1毫克/毫升）：
胶原酶IV - 50mg
DMEM/F12培养基 - 50ml
将胶原酶IV粉末加入一个50 ml Falcon离心管中。在生物安全柜中，加入50 ml无菌DMEM/F12培养基。涡旋混匀溶液 < 1 分钟，确保粉末完全溶解。在通风橱中，使用 0.22 µm 滤器过滤溶液至新的无菌 50 ml Falcon 管中。该溶液在 4°C 保存条件下最多可稳定存放 2 周。
Dispase 溶液（1 mg/ml）：
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 培养基 - 8ml
将市售的 5mg/ml Dispase 溶液分装，并于 -20°C 保存。使用 DMEM/F12 将 Dispase 稀释至 1mg/ml。该溶液可在 4°C 保存 1 周。
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讨论
本系列共3个视频，演示了如何在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞上培养人类胚胎干细胞（hESCs）（视频1），如何将细胞传代至不含饲养层细胞的Matrigel培养板（视频2），以及如何在无饲养层细胞的Matrigel条件下维持hESCs的培养（视频3）。大量先前研究表明，为了维持存活且未分化的hESCs，需将其培养在失活的MEF饲养层细胞上。然而，在许多实验中，需要获得完全不含饲养层细胞污染的纯hESC群体。为实现这一目标，我们展示了如何将hESCs从MEF饲养层培养板传代至无饲养层细胞的Matrigel培养板，以及如何在无饲养层条件下维持并连续传代hESC克隆。按照本方案操作，在Matrigel培养板的第一代传代中可能仍存在少量MEF饲养层细胞污染，但此类污染通常易于观察识别。自Matrigel第二代传代起，通常不再检测到MEF污染，从而获得可用于实验的纯hESC群体。需要通过免疫荧光染色与显微镜检查，或流式细胞术检测hESC多能性标志物（如Oct-4和SSEA-4），以确认hESCs在培养过程中维持于未分化状态。
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致谢
Teitell 实验室的人类胚胎干细胞研究得到了加州再生医学研究所（CIRM）种子基金 RS1-00313 的资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）再生医学与干细胞研究Broad中心的成员，特别是 Amander Clark 博士、Jerome Zack 博士，以及UCLA Broad研究所干细胞核心设施的工作人员对本研究工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| Knockout血清替代物（KSR） | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11330-057 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | 试剂 | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-谷氨酰胺 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030-081 | |
| 生物医学工程 | 试剂 | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | 试剂 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 胶原酶IV | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | 试剂 | 干细胞技术 | 17105-041 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 15140-122 | |
| 明胶 | 试剂 | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | 试剂 | BD 生物科学 | 354277 | |
| Oct-4 抗体 | 试剂 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| 抗-h/mSSEA-4 藻红蛋白–rythrin 标记的小鼠 IgG3 | 试剂 | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC标记的抗兔IgG | 试剂 | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-095-152 |
参考文献
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
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重印与许可
