本视频展示了如何以互补的方式使用两种神经刺激剂——涕灭威（aldicarb）和戊四氮（pentylenetetrazole, PTZ），研究线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的突触功能。这种互补方法也可用于揭示调控神经元同步性的进化保守机制，并对癫痫及惊厥的研究具有启示意义。
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摘要
摘要
线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）已成为研究神经传递的便捷模型。在动物模型中，秀丽隐杆线虫具有独特优势，因其神经系统的解剖结构和连接性已通过电子显微图像确定，并通过药理学实验进一步完善。在本视频中，我们将介绍两种互补的神经刺激剂——乙酰胆碱酯酶抑制剂涕灭威（aldicarb）和γ-氨基丁酸（GABA）受体拮抗剂戊四氮（pentylenetetrazole, PTZ）——如何被用于特异性表征秀丽隐杆线虫神经肌肉接头（NMJs）处的信号传导，从而促进我们对拮抗性神经回路的理解。
在302个秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中，19个GABA能D型运动神经元支配体壁肌（BWMs），另有4个GABA能神经元（称为RMEs）支配头部肌肉。相反，39个运动神经元表达兴奋性神经递质乙酰胆碱（ACh），并通过拮抗体壁肌神经肌肉接头（NMJs）处的GABA传递来协调运动。GABA能与胆碱能运动神经元在体壁神经肌肉接头处的拮抗作用最初通过激光消融实验确定，随后通过毒扁豆碱（aldicarb）处理得到进一步证实。急性毒扁豆碱暴露会导致野生型线虫出现时间依赖性或剂量依赖性的麻痹。然而，兴奋性ACh传递的缺失会使线虫对毒扁豆碱产生抗性，因为ACh在神经肌肉接头处积累减少，从而对体壁肌的刺激减弱。在特异性影响ACh功能或普遍影响突触功能的突变体中均可观察到对毒扁豆碱的抗性。与GABA和ACh传递的拮抗关系一致，GABA传递的缺失或无法负向调控ACh释放会导致线虫对毒扁豆碱高度敏感。尽管毒扁豆碱处理已帮助鉴定出大量与神经传递相关的线虫同源基因，但单靠毒扁豆碱处理无法有效确定特定基因或通路在C. elegans特定运动神经元中的主导作用。为此，我们引入了一种互补的实验方法，即使用戊四氮（PTZ）。
神经传递突变体在响应PTZ时表现出明显的表型，且与涕灭威诱导的麻痹表型明显不同。野生型线虫以及乙酰胆碱（ACh）释放或接收功能特异性缺陷的突变体对PTZ无明显敏感性。然而，GABA突变体以及一般突触功能缺陷的突变体则表现出时间依赖性或剂量依赖性的前部痉挛。无法负向调控一般神经递质释放、因而向体壁肌（BWMs）过度分泌ACh的突变体，在PTZ处理下会发生麻痹。不同突变体类别在PTZ诱导下产生的表型表明，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中结合使用涕灭威和PTZ暴露的互补方法，可能加速我们对神经传递机制的理解。此外，展示我们如何进行药理学实验的视频将为秀丽隐杆线虫研究建立一致的方法体系。
方案
Aldicarb 暴露实验方案
- 第一天，确保每种基因型和每个重复组至少有三十条年轻成虫期的线虫，以便在第二天进行涕灭威（aldicarb）检测。最好由实验人员挑选五十条或更多的L4期线虫，转移到新鲜的NGM平板上（最好不含制霉菌素），平板上需含有大肠杆菌（E. coli，推荐使用OP50菌株）作为食物来源，并在恒定且适宜的温度下培养12–24小时（最佳温度为20°C至22°C，25°C也可接受）。
- 第二天，使用70%乙醇（EtOH）和30%去离子水（ddH2O）配制100 mM的涕灭威储备液。将适量的涕灭威溶液均匀涂布于不含制霉菌素的NGM平板上，通过精确控制体积以达到所需的涕灭威浓度。我们通常在7.5 mL的NGM平板上加入37.5 μL的100 mM涕灭威溶液，以获得0.5 mM的终浓度。将涕灭威平板在室温下晾干约30–60分钟，无需打开皿盖通风。或者，也可将涕灭威直接加入NGM培养基中，4°C保存一周。
- 晾干后，在每个涕灭威平板的中央涂布等量的大肠杆菌（E. coli，推荐使用OP50菌株），并在室温下再次晾干30–60分钟。我们通常涂布25 μL的OP50菌液，以形成大小适中的食物菌苔，使线虫集中在较小区域而不至于过度拥挤。
- 当食物菌苔完全干燥后，即可开始涕灭威检测。由于涕灭威检测具有一定的主观性，强烈建议实验以“盲法”方式进行。可由主要实验者的同事对用于检测的原始线虫平板重新编号；同样，该同事也可在启动计时前，将线虫从原始平板转移至编码后的涕灭威平板。若实验者预期检测的某种线虫品系具有特定表型（如运动不协调），则应同时设置具有相似表型的对照组，以减少偏倚。此外，最好在每次实验中平行检测野生型品系、抗性品系和超敏品系，以帮助标准化实验条件。实验者应尽量保证每个重复组分析的线虫数量一致。我们通常每个重复组分析单一基因型的三十条线虫，并对每项实验至少进行三次重复。经验丰富的实验者应能同时处理至少六个品系。
- 使用铂金丝以一致的方式逐条触碰线虫，统计瘫痪线虫的数量。我们通常每隔30分钟对每条线虫头部触碰两次、尾部触碰两次，持续三小时。咽部泵动停止也可作为定义瘫痪的标准，但前提是实验者在整个检测过程中采用一致的瘫痪判定标准。此外，值得注意的是，某些线虫（尤其是对涕灭威具有抗性的品系）可能会试图爬离平板。在此情况下，实验者可在涕灭威平板周围涂布一定量的棕榈酸（palmitic acid），形成阻碍线虫移动的物理屏障。我们通常使用25 μL浓度为10 mg棕榈酸/mL EtOH的溶液进行涂布。
PTZ 暴露范式
- 在第一天，确保每种基因型及每个重复组至少有三十条年轻成虫期的线虫可在第二天用于PTZ实验。最好由实验人员挑选五十条或更多的L4期线虫转移到新鲜的NGM平板上（最好不含制霉菌素），平板上应含有作为食物来源的E. coli（推荐使用OP50），并在恒定且适宜的温度下（最佳为20°C至22°C，25°C也可接受）培养12-24小时。
- 在第二天，配制0.5 g PTZ/mL ddH2O的PTZ母液。将适量PTZ溶液以确定体积均匀涂布于不含制霉菌素的NGM平板上，以达到所需的PTZ浓度。由于我们倾向于进行PTZ的剂量-反应实验，因此通常将不同量的PTZ涂布于7.5 mL NGM平板上。例如，可在7.5 mL NGM平板上涂布37.5 μL PTZ母液，以获得5 mg PTZ/mL的终浓度。将涂有PTZ的平板在室温下晾干约60-120分钟。无需打开皿盖通风。或者，也可将PTZ直接加入NGM培养基中，但必须在培养基凝固后立即用于实验。PTZ的稳定性远低于aldicarb，因此使用存放时间较长的PTZ平板进行实验结果可靠性较低。PTZ应在使用前保存于-20°C干燥器中并配有干燥剂。为保证稳定性，我们建议在开启后约两个月内弃用PTZ。
- 晾干后，在每块PTZ平板中央涂布等量的E. coli（推荐使用OP50），并在室温下再干燥30-60分钟。我们通常涂布25 μL OP50，以形成大小适中的食物菌苔，使线虫集中于小范围区域而不至于过度拥挤。
- 当食物菌苔完全干燥后，即可开始PTZ实验。尽管PTZ实验比aldicarb实验主观性较低，但仍强烈建议以“盲法”方式进行实验。可由主要实验人员的同事对原始线虫平板重新编号，同样，该同事可在启动计时前将线虫从原始平板转移至编码后的PTZ平板。若实验人员预期某种具有特定表型（如运动失调）的线虫品系将参与实验，则应同时设置具有相似表型的对照组以减少偏差。此外，最好在实验中平行检测野生型品系以及表现出头部抽搐或全身性抽搐的品系，以帮助标准化实验条件。实验人员应力求对每个重复组分析数量一致的线虫。我们通常对每个重复组分析三十条同一基因型的线虫，并对每项实验至少进行三次重复。有经验的实验人员应能同时处理至少三个品系。然而，PTZ诱导的抽搐频率和强度通常在暴露后15-30分钟达到峰值，随后随着线虫出现麻痹或在某些情况下对药物产生适应而减弱。
- 在整个一小时内，每30分钟记录一次发生“癫痫样”抽搐的线虫数量。最好将出现前段抽搐（我们称之为“点头”）的线虫数量与出现全身性抽搐、全身强直性麻痹（我们称之为“强直”）或前段抽搐合并体壁肌麻痹（我们称之为“强直-阵挛”）的线虫数量分别计分。同一基因型的大多数线虫通常仅表现出一种类型的抽搐。然而，强直-阵挛型线虫常会转变为完全强直状态，因此即使所有线虫均已出现抽搐，也应继续实验超过30分钟。此外，值得注意的是，部分线虫可能试图爬离平板。此时，实验人员可在PTZ平板周围均匀涂布一定量的棕榈酸。我们通常使用25 μL浓度为10 mg/mL的棕榈酸乙醇溶液。
选定的秀丽隐杆线虫突触传递突变体对涕灭威和戊四氮的行为反应
| 突变体名称 | 突触功能角色 | 无药物时的行为 | 对涕灭威的行为反应（与野生型 N2 相比） | 对戊四氮的行为反应 |
| tom-1(ok188) | 抑制突触传递 | 运动不协调 | 麻痹速率增强 | 与野生型无差异 |
| unc-43(n498n1186) | 复杂 | 运动不协调 | 麻痹速率增强 | 全身性痉挛 |
| unc-25(e156) | 促进 GABA 传递 | 运动不协调 | 麻痹速率增强 | 前部痉挛，全身麻痹 |
| snb-1(md247) | 促进突触传递 | 运动不协调 | 麻痹速率降低 | 前部痉挛 |
| unc-4(e120) | 促进乙酰胆碱传递 | 运动不协调 | 麻痹速率降低 | 与野生型无差异 |
两种神经刺激剂——乙酰胆碱酯酶抑制剂（称为aldicarb）和GABA受体拮抗剂（称为pentylenetetrazole，PTZ），可用于互补性地鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的突触传递突变体。当乙酰胆碱（ACh）兴奋性传递的负调控因子（如tom-1和unc-43）或抑制性GABA传递的正调控因子（如unc-25）发生有害突变时，线虫体壁神经肌肉接头（NMJs）处会积累过量的兴奋性ACh。相反，当一般突触传递的正调控因子（如snb-1）或ACh特异性传递相关基因（如unc-4）发生有害突变时，线虫NMJs处的兴奋性ACh水平则会降低。与野生型N2线虫相比，NMJs处兴奋性ACh传递增强的突变体线虫表现出更高的aldicarb诱导麻痹速率，而兴奋性ACh传递降低的突变体线虫则表现出更低的aldicarb诱导麻痹速率。尽管PTZ与aldicarb类似，均可破坏线虫体壁肌肉的神经元同步性，但PTZ还能拮抗线虫头部肌肉中的抑制性GABA。因此，对aldicarb的敏感性无法准确预测对PTZ的敏感性。在PTZ存在下，那些在ACh传递的正或负调控方面存在特定缺陷的突变体线虫与野生型N2线虫无法区分；而那些在一般突触传递正调控方面存在缺陷或在抑制性GABA传递方面存在特异性缺陷的突变体线虫，则表现出明显的PTZ诱导前段惊厥。此外，unc-43功能缺失突变体在PTZ存在下出现全身性惊厥，可能还存在其他突触传递异常，这些异常共同导致其独特的药物反应表型。
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讨论
目前，使用 C. elegans 进行涕灭威（aldicarb）暴露的实验方案无法区分在乙酰胆碱（ACh）传递中存在特异性缺陷的突变体与在突触传递中存在广泛性缺陷的突变体，因为这两类突变体均表现出对涕灭威的抗性。同样，涕灭威也无法用于判断突变体是否存在γ-氨基丁酸（GABA）传递的特异性缺陷，或是否存在对乙酰胆碱传递负调控功能的普遍性障碍，因为这两类突变体均对涕灭威表现出超敏性。将我们的戊四氮（PTZ）暴露实验结果与涕灭威暴露实验结果相结合，可帮助研究人员更准确地表征突触传递突变体。
C. elegans 突触传递突变体可通过互补的涕灭威（aldicarb）和戊四氮（PTZ）处理范式进行简单分类。对涕灭威具有抗性且在PTZ诱导下出现前部痉挛的突变体，可能普遍存在突触功能缺陷。相反，对涕灭威具有抗性但无PTZ诱导前部痉挛的突变体，可能特异性地存在乙酰胆碱（ACh）传递缺陷。表现为涕灭威超敏感但不出现PTZ诱导前部痉挛的突变体，可能无法负向调控乙酰胆碱传递。最后，表现为涕灭威超敏感且出现PTZ诱导前部痉挛的突变体，可能缺乏γ-氨基丁酸（GABA）。...
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致谢
我们谨感谢Caldwell实验室所有成员的协作精神。本实验室的神经元兴奋性与癫痫研究得到了来自美国出生缺陷基金会的Basil O’Connor学者奖、美国国家科学基金会授予GAC的职业发展奖，以及霍华德·休斯医学研究所资助给阿拉巴马大学的本科生科学研究项目基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 涕灭威 | 试剂 | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | 可从 Sigma 购买 |
| 戊四氮 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P6500 |
参考文献
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
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