一种快速可视化活体固定酵母细胞的技术

摘要

一种用于可视化固定化酵母细胞生长的快速技术，此处应用于沉默交配位点 HML 和 HMR 的荧光报告系统

摘要

我们在此介绍一种简单、快速且极为灵活的技术，用于通过落射荧光显微镜对生长中的酵母细胞进行固定和观察。该技术同样适用于静态酵母群体的观察，或长达十小时的时间序列实验。本研究利用显微镜技术探究酿酒酵母（S. cerevisiae）中沉默交配位点的表观遗传遗传。酿酒酵母有两个沉默交配位点HML和HMR，通常由于被包裹在异染色质中而不表达。在sir1突变背景下，沉默作用被削弱，使得每个位点可处于表达或沉默的表观遗传状态，因此在整个细胞群体中，HML和HMR均存在不同表观遗传状态的细胞混合。显微观察结果表明，在单个细胞中，HML与HMR的表观遗传状态之间无关联性。sir1细胞会随机地在不同表观遗传状态之间转换，即在先前表达的位点建立沉默，或激活先前沉默的位点。通过时间序列显微观察，追踪单个sir1细胞及其子代，以统计四种可能的表观遗传转换发生的频率，从而评估sir1细胞中各表观遗传状态的稳定性。另见Xu et al., Mol. Cell 2006。

方案

1. 用于时间序列落射荧光显微镜观察的固定细胞。请注意，此方案仅在显微镜的物镜位于显微镜载物台下方时适用。
   
   
2. 将细胞以所需浓度置于液体培养基中，并滴加到长盖玻片（约 24×50 mm）上。
   
   
3. 从合成培养基平板上切取适当大小的琼脂块（此类平板自发荧光较低），并将其覆盖在细胞上。请将未用镊子夹取过的一侧琼脂面与细胞接触。
   
   
4. 对于较短时间的观察（不超过 3 小时），上述设置已足够。若在显微镜下观察到细胞移动，可减少细胞体积或增大琼脂块面积。
   
   
5. 对于较长时间的观察，可在琼脂块顶部滴加一滴新鲜液体培养基，并在琼脂块上方放置一片载玻片。该载玻片可减少琼脂块顶部的蒸发。如有需要，可用凡士林密封琼脂块与盖玻片接触的边缘，以进一步减少水分流失。我曾使用此装置连续成像长达 9 小时，期间细胞以野生型速率正常分裂。

讨论

这是一种能够固定酵母细胞同时仍允许其生长的快速技术。我们已连续观察酵母生长长达十小时，酵母在整个实验过程中表现出野生型的分裂速率。请注意，此装置要求物镜位于显微镜载物台下方。